實(shí)驗(yàn)六 微生物的大小測(cè)定和顯微直接計(jì)數(shù)

1、微生物大小測(cè)定和顯微直接計(jì)數(shù)微生物大小測(cè)定和顯微直接計(jì)數(shù)1l學(xué)會(huì)測(cè)微尺和血球計(jì)數(shù)板的使用方法。學(xué)會(huì)測(cè)微尺和血球計(jì)數(shù)板的使用方法。l建立微生物大小的概念。建立微生物大小的概念。21.微生物大小的測(cè)定原理微生物大小的測(cè)定原理 微生物的大小需要用刻有一定刻度的測(cè)微尺來測(cè)微生物的大小需要用刻有一定刻度的測(cè)微尺來測(cè)量，先用絕對(duì)長(zhǎng)度的鏡臺(tái)測(cè)微尺來校正不表示絕量，先用絕對(duì)長(zhǎng)度的鏡臺(tái)測(cè)微尺來校正不表示絕對(duì)長(zhǎng)度的目鏡測(cè)微尺，計(jì)算后者每格所代表的實(shí)對(duì)長(zhǎng)度的目鏡測(cè)微尺，計(jì)算后者每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，然后放上待測(cè)的標(biāo)本，用目鏡測(cè)微尺測(cè)際長(zhǎng)度，然后放上待測(cè)的標(biāo)本，用目鏡測(cè)微尺測(cè)定標(biāo)本上微生物細(xì)胞占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，就可

2、定標(biāo)本上微生物細(xì)胞占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，就可計(jì)算該微生物的大小。計(jì)算該微生物的大小。3l(1)目鏡測(cè)微尺的構(gòu)造目鏡測(cè)微尺的構(gòu)造 目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻片，其中央刻有精確的等分刻度，有等分為片，其中央刻有精確的等分刻度，有等分為50小小格和格和100小格兩種。刻度的大小是隨使用的接目小格兩種?？潭鹊拇笮∈请S使用的接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，用前必須用鏡臺(tái)鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，用前必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺來標(biāo)定。測(cè)微尺來標(biāo)定。l(2)鏡臺(tái)測(cè)微尺的構(gòu)造鏡臺(tái)測(cè)微尺的構(gòu)造 鏡臺(tái)測(cè)微尺為一塊特制鏡臺(tái)測(cè)微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內(nèi)刻有分度，的載玻片，其中央有一小圓圈

3、。圓圈內(nèi)刻有分度，將長(zhǎng)將長(zhǎng)1mm的直線等分為的直線等分為100小格，每小格等于小格，每小格等于10m。45目尺目尺每格長(zhǎng)度每格長(zhǎng)度= 兩個(gè)重疊刻度間兩個(gè)重疊刻度間鏡尺鏡尺格數(shù)格數(shù)10兩個(gè)重疊刻度間兩個(gè)重疊刻度間目尺目尺格數(shù)格數(shù)6 2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)原理l微生物常用的計(jì)數(shù)方法有兩種，即直接計(jì)數(shù)法和微生物常用的計(jì)數(shù)方法有兩種，即直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。間接計(jì)數(shù)法。l前者利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，能立前者利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)。即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)。l后者是在平板上長(zhǎng)成菌落后再計(jì)數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，后者是在平板上長(zhǎng)成菌

4、落后再計(jì)數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，但費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。但費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。l本實(shí)驗(yàn)是利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)是利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。l計(jì)數(shù)前需對(duì)樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計(jì)計(jì)數(shù)前需對(duì)樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計(jì)算公式運(yùn)算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。算公式運(yùn)算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。 7l血球計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的血球計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面?zhèn)€刻有一個(gè)方格網(wǎng)。上面?zhèn)€刻有一個(gè)方格網(wǎng)。l方格

5、網(wǎng)上刻有方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室，供微生物計(jì)數(shù)的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室，供微生物計(jì)數(shù)用。這一大方格為邊長(zhǎng)為用。這一大方格為邊長(zhǎng)為1mm正方形，正方形，深度為深度為0.1mm，其體積為，其體積為0.1mm3。8916小格小格 25中格計(jì)數(shù)室中格計(jì)數(shù)室 25小格小格 16中中格計(jì)數(shù)室格計(jì)數(shù)室 計(jì)數(shù)室的兩種刻度形式計(jì)數(shù)室的兩種刻度形式10 計(jì)算公式計(jì)算公式l(1)16小格小格25中格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：中格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：l 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)ml=A525104Bl(2)25小格小格 16中格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：中格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：l 細(xì)

6、胞數(shù)細(xì)胞數(shù)ml=A516104Bl其中其中：lA為五個(gè)中方格的總菌數(shù)為五個(gè)中方格的總菌數(shù) lB為稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)11l菌種：釀酒酵母。菌種：釀酒酵母。l儀器或其他用具：顯微鏡；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，儀器或其他用具：顯微鏡；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片；鏡臺(tái)測(cè)微尺，目鏡測(cè)微尺，載玻蓋玻片；鏡臺(tái)測(cè)微尺，目鏡測(cè)微尺，載玻片；無菌毛細(xì)滴管。片；無菌毛細(xì)滴管。121.酵母菌大小的測(cè)定酵母菌大小的測(cè)定 （1 1）目鏡測(cè)微尺的校正（高倍）目鏡測(cè)微尺的校正（高倍） l把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度裝入目鏡的隔板

7、上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。朝上。l先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”0”刻刻度完全重合。度完全重合。l定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。13 （2）酵母菌大小的測(cè)定）酵母菌大小的測(cè)定l

8、取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸制片。取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸制片。l測(cè)量菌體的長(zhǎng)度和寬度各占目鏡測(cè)微尺幾格，然后換算測(cè)量菌體的長(zhǎng)度和寬度各占目鏡測(cè)微尺幾格，然后換算出菌體的實(shí)際長(zhǎng)度。出菌體的實(shí)際長(zhǎng)度。l在同一標(biāo)本上測(cè)定在同一標(biāo)本上測(cè)定5-10個(gè)菌體，求其平均值。個(gè)菌體，求其平均值。 2.細(xì)菌大小的測(cè)定細(xì)菌大小的測(cè)定 （1 1）目鏡測(cè)微尺的校正（油鏡）目鏡測(cè)微尺的校正（油鏡） （2）細(xì)菌大小的測(cè)定）細(xì)菌大小的測(cè)定l測(cè)定細(xì)菌三型玻片標(biāo)本上的某一種細(xì)菌（球菌或桿菌測(cè)定細(xì)菌三型玻片標(biāo)本上的某一種細(xì)菌（球菌或桿菌 或螺旋菌）或螺旋菌）142.酵母細(xì)胞數(shù)的直接測(cè)定酵母細(xì)胞數(shù)的直接測(cè)定（1 1）取潔凈

9、的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片（蓋玻片要清洗）。玻片（蓋玻片要清洗）。（2 2）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。液。（3 3）加樣后靜止加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡，然后將血

10、細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。15l一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有4-5 個(gè)菌體為宜。個(gè)菌體為宜。l每個(gè)計(jì)數(shù)室選每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格個(gè)中格(可選可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。行計(jì)數(shù)。l位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。l如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)。l計(jì)數(shù)一個(gè)樣

11、品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。菌量。（4）清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板l使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。l通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。16五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 1、微生物大小測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果、微生物大小測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果填入下表：）將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果填入下表： 接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度(m)高倍鏡油 鏡接目鏡的放大倍數(shù)_（2） 微生物細(xì)胞大小的測(cè)量結(jié)果：微生物細(xì)胞大