殼聚糖酶高產(chǎn)菌株選育及高效誘變-生物工程本科論文

1、本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 題 目殼聚糖酶高產(chǎn)菌株選育及高效誘變 姓 名王宇 學(xué)號(hào) 2011413283 院 系 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè) 生物工程 指導(dǎo)教師劉金峰職稱 副教授 2015年5月18 日 曲阜師范大學(xué)教務(wù)處制 摘要 1 關(guān)鍵詞 1 Abstract 1 Key words 1 引言（或緒論 1 1 材料與方法 3 1.1 菌株 3 A OM *Q 1.2 培養(yǎng)基 3 1.3 曲霉CJ22 3菌株的UV和60Co誘變 3 1.4 還原糖的測(cè)定 3 1.5 殼聚糖酶活力的測(cè)定 3 2結(jié)果與討論 2.1 菌株誘變的結(jié)果 3 2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 4 2.2.1 單一碳源對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)率和菌體

2、生長(zhǎng)的影響 4 2.2.2 復(fù)合碳源對(duì)產(chǎn)酶影響 4 2.2.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 4 2.2.4 金屬離子和 KH2PO對(duì)產(chǎn)酶影響 4 2.2.5 對(duì)碳氮源的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 5 2.2.6 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響 5 2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化 5 2.3.1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 5 2.3.2 溶氧對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 5 2.3.3 溫度、培養(yǎng)基起始聲和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 6 3結(jié)論 7 3.1 殼聚糖酶選育及誘變 7 3.2殼聚糖酶的高效誘變 致謝 7 參考文 8 殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的選育及高效誘變 生物工程專業(yè)學(xué)生王宇 指導(dǎo)教師劉金峰 摘要：從曲師大實(shí)驗(yàn)樓后采集的土樣中分離到 菌株曲霉CJ22 -

3、 3產(chǎn)酶效果最好。以自篩曲霉 4株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，經(jīng)過(guò)搖瓶復(fù)篩，發(fā)現(xiàn) CJ22 - 3為出發(fā)株，經(jīng)紫外線和60Co高效誘 變處理，獲得1株殼聚糖酶高產(chǎn)菌株CJ22 - 326，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化了其液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng) 基：殼聚糖 1.5%,麩皮 2%，( NH4)2SQ 0.2% ,KH 2PQO.2% , MgS0 40. 05% , Tween 80 0.05% ,pH5.5。優(yōu)化的發(fā)酵條件為：裝液量75 mL /250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速 150r/min，發(fā) 酵溫度為30C,發(fā)酵時(shí)間為96 h。在此條件下，CJ22 - 326產(chǎn)酶活力為3.06 U /mL 關(guān)鍵詞：選育；發(fā)酵條件；殼聚糖酶

4、；高效誘變 The Chitosanases High yield strains Of Breeding and high mutation Stude nts majori ng in biological engin eeri ngwan gyu Tutorliuji ngfeng Abstract: From Qufu Normal University experiment after collecting the soil samples isolated 4 strains of microbes chitosanase. After shaking flask rescreen

5、ing. It is found that the strain Aspergillus CJ22 3 - producing enzyme effect best. To screen Aspergillus CJ22 - 3 for starting stra ins, treated by UV and 60Co mutati on, 1 stra in of shell of gett ing Xyla nase Produc ing Strain CJ22 326 -, through orthogonal tests, the preliminary optimization of

6、 the liquid fermentation medium: 1.5% chitosa n, the drum skin 2%, (NH4) 2SO4 0.2%, KH2PO4 0.2%, MgS040. 05%, 0.05% Tween 80, pH5.5. Optimization of fermentation conditions for liquid loading on 75 ml /250mL triangle bottle, shaking speed 150r / min, fermentation temperature for the 300C, ferme ntat

7、io n time for 96 h. Un der this con ditio n, the CJ22 - 326e nzyme activity was 3.06 U /mL Key words: The ferme ntatio n con diti ons of chitosa nase;Breedi ng;Mutage nesis; Efficie nt. 引言： 殼聚糖(chitosanase )是由D-氨基葡萄糖通過(guò)B -1,4糖苷鍵連接起來(lái)的生 物多糖，可在酸性溶液中溶解，反應(yīng)活性比甲殼素和纖維素都高。殼聚糖是自 然界中唯一的天然堿性多糖，研究發(fā)現(xiàn)，其降解產(chǎn)物殼寡糖 (chi

8、tooligosaccharide)具有良好的水溶性、易被生物機(jī)體吸收且無(wú)毒、無(wú)熱源、 無(wú)變異性，并具有抗癌、抑菌等生理活性，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用廣 泛2。目前，在殼聚糖的降解方法中酶降解法以其降解過(guò)程容易控制、反應(yīng)條件 溫和以及對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)而成為殼聚糖降解的首選途徑。 殼聚糖是幾丁質(zhì)脫去部分乙?；漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物降解 性、無(wú)毒性以及易成膜性，因而在眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但殼聚糖分子質(zhì)量 較大，水溶性差，在人體內(nèi)不易吸收，使其應(yīng)用受到一定限制3 0 殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是聚合度為220的低聚糖，具有水溶性好、 易吸收等優(yōu)點(diǎn)以及許多獨(dú)特的生理活性和功能4

9、，5 如能提高機(jī)體免疫力、抑制 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、活化增殖人體腸道內(nèi)雙歧桿菌，同時(shí)還具有抗菌防腐6，7、保水 保濕等功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用前景備受矚目。殼寡糖的制備 可分為化學(xué)降解法、物理降解法和酶降解法8，9，與目前常用的化學(xué)降解法相比， 酶法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和易控，寡糖得率高、功能性更強(qiáng)，不易造成環(huán)境 污染，是殼寡糖制備的主要研究方向。因此，對(duì)殼聚糖酶的研究已成為幾丁質(zhì)和 殼聚糖研究領(lǐng)域中較為活躍的分支之一 10 0 殼聚糖酶(chitosanase，EC3.2.1.132)是以內(nèi)切方式催化水解部分乙酞化 殼聚糖中的B -1,4-氨基葡萄糖普鍵的酶。目前已經(jīng)從細(xì)菌 (CB

10、acillus,Myxobacter,Enterobacter)放線菌(Streptomyces,Nocardioides) ， 霉菌(Aspergillus,Penicillium )，病毒(Chlorella virus ) 研究人員通過(guò)人 工誘變處理來(lái)獲得高產(chǎn)突變株。王艷等11以假單胞菌丫8.0為出發(fā)菌株，分別通 過(guò)亞硝基肌、曳。和UV誘變3種誘變方法進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)UV誘變效果最好，得 到突變菌株假單胞菌丫8,其所產(chǎn)殼聚糖酶活力達(dá)到 3 .OU/mL ,酶活力提高近6 倍，并具有較好的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)篩選獲得一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株，初步鑒定為 煙曲霉菌，以該菌株為出發(fā)菌株,采用紫外誘變的方法

11、對(duì)其進(jìn)行遺傳改良，旨在 篩選獲得新的高產(chǎn)殼聚糖酶突變菌株。 11 1材料與方法 1. 1菌株 曲霉CJ22 3,自篩菌種。曲霉CJ22 326,CJ22 3經(jīng)紫外和60Co誘變得到。 A Q嚴(yán)并甘 1.2培養(yǎng)基 (1)斜面保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基。 (2 )平板篩選培養(yǎng)基：膠體殼聚糖0.5% ,葡萄糖2%酵母膏0.1%，( NH4)2SQ 0.2%，KHPQ 0.2% , MgSO 4 0.05%，瓊脂 2% ,pH5.5-6.0 。 (3) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基A:膠體殼聚糖1% 酵母膏0. 1 % ( NH) 2SQ0.2%, KHPO0.2%, MgS00.05%，pH5.5。 (4) 搖瓶篩

12、選培養(yǎng)基 B:膠體殼聚糖 1%( NH) 2SQ 0.2%, KHPQ0.2%,MgS00.05%, 麩皮 1% pH5.5。 (5) 優(yōu)化培養(yǎng)基 C:膠體殼聚糖 1.5% , ( NH) 2SQ0.2%, KHPQ 0.2%, MgS0 0.05%, 麩皮 2% pH5.5。 1.3曲霉CJ22一 3菌株的UV和 60Co誘變 誘變篩選程序?yàn)椋呵咕N抱子紫外照射1 min暗培養(yǎng)增殖葉涂布平板培養(yǎng) 葉挑取透明圈大的菌落接出斜面培養(yǎng)葉搖瓶篩選。對(duì)正突變株CJ22 一 311進(jìn)行 第2次60Co誘變,誘變劑量為500、700、900 Gy ,涂布平板培養(yǎng)葉挑取透明圈 大的菌落接出斜面培養(yǎng)葉搖瓶復(fù)

13、篩獲高產(chǎn)株CJ22 一 326。 1.4還原糖的測(cè)定 采用3, 5-二硝基水楊酸(DNS)法。 1.5殼聚糖酶活力的測(cè)定 按參考文獻(xiàn)10的方法進(jìn)行,在1 mL 0. 5%殼聚糖(0. 2 mo/L , pH5. 6 醋酸緩沖液)中加入1mL適當(dāng)稀釋的酶液，于37E保溫15 min ,沸水浴10 min 滅酶，過(guò)濾。DNSS測(cè)定酶解液中的還原糖(以氨基葡萄糖計(jì))，酶活定義：每分 鐘催化生成相當(dāng)于1 mol氨基葡萄糖還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。 2結(jié)果與討論 2. 1菌株誘變結(jié)果 以曲霉CJ22一 3為出發(fā)菌株,采用15 W紫外燈于30 cm的距離，照射1 min 后,致死率為92%在添加產(chǎn)酶

14、阻遏劑葡萄糖的平板上分離得到CJ22 一 311菌 株,產(chǎn)酶比出發(fā)株CJ22一 3提高31%達(dá)1.64U/mL。以此作為再次誘變出發(fā)株, 對(duì)CJ22一 311進(jìn)行第2次60Co誘變,誘變劑量分別為500,700,900Gy ,經(jīng)700 Gy 照射后,致死率為90%在含2%葡萄糖 表1單一碳源對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)率和生長(zhǎng)的影響 碳源 葡萄糖 乳糖 氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖殼聚糖 淀粉 麩皮 菌體量/g。L1 3.45 2.78 2.34 2.021.952.72.41 酶活/L。mL 0.01 0.038 0.05 0.0370.920.030.06 平板上仍能產(chǎn)透明圈的突變株較少，減輕了搖瓶復(fù)篩的工作

15、量，最終獲得CJ22 一 326菌株,產(chǎn)酶達(dá)1. 93 U /ml, 為出發(fā)菌株CJ22一 3的1. 54倍。 將誘變得到的高產(chǎn)菌株與原始菌株一起連續(xù)轉(zhuǎn)接8代;每傳一代用搖瓶發(fā)酵 液測(cè)定酶活。試驗(yàn)結(jié)果表明菌株 CJ22一 326產(chǎn)酶能力穩(wěn)定在1.9U/ml左右。 2. 2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 2. 2. 1單一碳源對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)率和菌體生長(zhǎng)的影響 文獻(xiàn)報(bào)道，大部分微生物產(chǎn)殼聚糖酶為誘導(dǎo)酶，底物的存在是誘導(dǎo)酶產(chǎn)生的 必要條件，殼聚糖、氨基葡萄糖、乙酞氨基葡萄糖等可以做誘導(dǎo)物來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)酶。 用同樣量的6種碳源取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A中碳源，結(jié)果見(jiàn)表1。CJ22 326菌株 殼聚糖酶的合成與分泌需要有殼聚糖的誘導(dǎo)

16、，是一典型的誘導(dǎo)酶，氨基葡萄糖、 乙酞氨基葡萄糖做碳源，不利于誘導(dǎo)產(chǎn)酶。針對(duì)菌株CJ22 - 326,殼聚糖才是高 效誘導(dǎo)劑，但由于殼聚糖分子中氨基的存在，在酸性條件下表現(xiàn)出抑菌性，故只 是單獨(dú)以它作碳源時(shí)，抱子萌發(fā)受抑制，菌體量小，影響酶活。 2. 2. 2 復(fù)合碳源對(duì)產(chǎn)酶影響 考慮到菌體的生長(zhǎng)和對(duì)殼聚糖酶誘導(dǎo) 2方面的因素，選取殼聚糖和鼓皮復(fù)合 碳源代替單一碳源。因麩皮是富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等的常用培養(yǎng) 基成分，在添加1%勺麩皮后，不同濃度的殼聚糖對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。殼 聚糖的添加量對(duì)殼聚糖酶的生產(chǎn)有很大影響，殼聚糖濃度達(dá)到2%寸，酶活達(dá)到 最高，繼續(xù)增加用量，有降低的趨

17、勢(shì)，這可能由于殼聚糖濃度高，粘度大，影響 傳質(zhì)和溶氧。 表2殼聚糖濃度對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)率的影響 殼聚糖濃度/%0.511.522.5 酶活 /U.mL-11.211.92.272.462.35 選取殼聚糖濃度為1%再改變麩皮濃度，結(jié)果見(jiàn)表3,可看出麩皮濃度對(duì)酶 活的影響同殼聚糖對(duì)酶活影響相似。 當(dāng)麩皮的濃度為2%寸酶活達(dá)到最大；再增加 時(shí)，發(fā)酵液的殘?zhí)歉?，可能產(chǎn)生了阻遏。 表3麩皮濃度對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)率影響 麩皮濃度/%123 酶活 /U.mL-11.922.352.24 2. 2. 3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 進(jìn)行不同氮源的實(shí)驗(yàn)時(shí)，培養(yǎng)基碳源選取1%5聚糖、2潞皮，再分別添加 0. 2%的不同氮源，包括4

18、種有機(jī)氮源：尿素、胰蛋白陳、酵母膏、牛肉膏和 3 種無(wú)機(jī)氮源:KN03, NHNO,（ NH） 2SQ。結(jié)果表明，在所選氮源中，無(wú)機(jī)氮源（NH） 2SQ;較有機(jī)氮源和復(fù)合氮源（0.1%（ NH 2SO+ 0. 1 %酵母膏）更有利于殼聚糖酶 的產(chǎn)生。比較適宜的（NH） 2S0;濃度為0. 2%。 表4添加氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 氮源 尿素 胰蛋白胨 酵母膏 牛肉膏 KNQ3 NH4NQ3 (NH4)2SQ4(NH4)2SQ4+ 酵母膏 酶活 /U.mL-1 1.93 2.051.97 2.011.84 2.06 2.42 2.36 2. 2. 4 金屬離子和KHPQ對(duì)產(chǎn)酶影響 金屬離子是微生物生命活

19、動(dòng)所必須的，以 0. 05%的Zn2+、Fe2+、c、Li2+、 CaT,Mn2+等金屬離子的無(wú)機(jī)鹽代替篩選培養(yǎng)基中的 Mg+。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所用 的培養(yǎng)基B中，添加以上金屬離子的無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶影響不大， 這可能因?yàn)楣钠ぶ?已含有足夠量的無(wú)機(jī)金屬離子，無(wú)需再另外添加。 選擇0.1%、0.2%、0.3%三個(gè)不同濃度的KHPQ,該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KHPQ 在此濃度范圍對(duì)產(chǎn)酶影響不大，0. 2%濃度時(shí)略好，說(shuō)明該菌株發(fā)酵時(shí)對(duì)無(wú)機(jī)鹽 和磷的要求不高。 2. 2. 5 對(duì)碳氮源的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 研究了 3個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)源，即殼聚糖、麩皮和（NH） 2SQ的不同配比對(duì)菌株產(chǎn) 酶的協(xié)同效應(yīng)。采用正交表L9（ 34

20、）的設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)數(shù)據(jù)和處理結(jié)果見(jiàn)表 5。結(jié) 果表明，影響最大的因素為殼聚糖的濃度， 其次是氮源和麩皮的濃度。最佳參數(shù) 組合為ABC，即殼聚糖2% ,麩皮2% , （ NH4）2SO0. 2%?？紤]到原料的利用率， 殼聚糖濃度以1.5%為宜。 表5正交試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理結(jié)果 試驗(yàn)號(hào) A （殼聚糖） B （麩皮） C(NH 4)2SO 酶活力/U.mL-1 1 1 (1.5%) 1 (1% 1 (0.2%) 2.81 2 1 2 (2% 2 (0.1%) 2.61 3 1 3 (3% 3 (0.3%) 2.56 4 2 (1.5%) 1 2 2.39 5 2 2 3 2.58 6 2 3 1 2.4

21、0 7 3 (1% 1 3 1.95 8 3 2 1 2.30 9 3 3 2 2.17 K1 2.66 2.38 2.50 K2 2.46 2.49 2.39 K3 2.14 2.37 2.36 R O.52 0.12 0.14 2. 2. 6 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響 表面活性劑用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)受到廣泛重視。一般認(rèn)為表面活性劑可強(qiáng)化傳 質(zhì)傳氧，提高細(xì)胞膜滲透性，使酶易向胞外分泌。實(shí)驗(yàn)表明，在優(yōu)化培養(yǎng)基C 中添加0. 1%以下的TWeen一 80表面活性劑，可提高酶活。添加 0. 05%Tureen 一 80比對(duì)照提高酶產(chǎn)量11% 表6表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響 TWeen一 80 濃度 /% 0

22、.02 0.05 0.08 0 酶活/U。mL 2.91 3.06 2.84 2.75 2. 3發(fā)酵條件的優(yōu)化 2. 3. 1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在一定的培養(yǎng)基中，接種量過(guò)低時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)，影響產(chǎn)酶。 接種量過(guò)高時(shí)，發(fā)酵周期短，同樣影響產(chǎn)酶。分別采用接種量為3% 5% 8% 10%進(jìn)行培養(yǎng)，其中以接種量8%為最佳。 2.3.2溶氧對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 通過(guò)改變搖瓶裝液量和搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn) CJ22 - 326對(duì)通風(fēng)量的要求，結(jié)果見(jiàn) 圖1。250mL的三角瓶中裝液量為75mL時(shí)最佳。當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)產(chǎn)酶 最好，超過(guò)180r/min,酶活下降?？梢?jiàn)過(guò)量的溶氧對(duì)菌株合成酶也不利

23、。 圖I培養(yǎng)基裝液址對(duì)產(chǎn)驚的彩響 233溫度、培養(yǎng)基起始聲和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度達(dá)32E時(shí)，發(fā)酵周期短，但產(chǎn)酶不高；溫度過(guò)低(28 C)，則發(fā)酵時(shí) 間延長(zhǎng)，酶活力也不高。溫度以30 C為宜 團(tuán)的解離及其微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物的吸收及代謝物的分泌， 導(dǎo)致微生物的 生長(zhǎng)和代謝發(fā)生變化。另外由于殼聚糖的特殊性，在 pH 6. 5時(shí)不溶解。我們 試驗(yàn)了培養(yǎng)基C起始pH在4. 56. 5之間和發(fā)酵89h時(shí)的pH和酶活，結(jié)果顯示 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的適宜起始聲值在 5.06.0之間。聲為5. 5時(shí)酶活力最高，見(jiàn)表7. 微生物從生長(zhǎng)到產(chǎn)酶有一過(guò)程，隨時(shí)間而變化。我們發(fā)現(xiàn)接種36h后形成了大量 的菌體，此

24、時(shí)產(chǎn)酶很低，而還原糖含量很高，發(fā)酵液聲下降， 72h后，菌體數(shù)量 達(dá)到平衡，培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，菌體數(shù)量不再增加，發(fā)酵液 pH又回升，殼聚 糖酶的合成與分泌達(dá)到平衡，當(dāng)?shù)竭_(dá) 96h左右，酶活達(dá)到最高，結(jié)果見(jiàn)圖 2。 表7不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 起始pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 終了 pH 3.72 3.75 4.06 5.04 6.16 6.99 相對(duì)酶活/% 70 76 85 100 78 73 圖2發(fā)酵產(chǎn)嗨仙線 3結(jié)論 3.1殼聚糖酶選育及誘變 以曲霉CJ22-3為出發(fā)株，經(jīng)紫外誘變和60Co誘變，最終獲得CJ22 326, 其產(chǎn)酶活力為出發(fā)株的1.54倍，經(jīng)發(fā)酵

25、條件優(yōu)化后產(chǎn)酶達(dá) 3. 06 u/mL，高于 參考文獻(xiàn)11中的報(bào)道。 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳配比為：膠體殼聚糖1.5%，( NH) 2SQ 0. 2%，KHPQ 0. 2% MgS00. 05%，麩皮 2% 0. 05% Tween 80, pH 5. 5。優(yōu)化的發(fā)酵條件為： 裝液量75 ml /250 ml三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速150 r /min ，發(fā)酵溫度和時(shí)間分別為 30 T 和 96h。 CJ22 一 326能在添加2%葡萄糖的殼聚糖培養(yǎng)基平板上仍產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明 它已解除了部分阻遏。 3.2殼聚糖酶的高效誘變 誘變育種可以顯著改善產(chǎn)殼聚糖酶菌株的產(chǎn)酶能力，其中紫外線是一種強(qiáng)的 誘變劑，能使DN

26、A上2個(gè)相鄰的胸腺嘧啶之間形成二聚體， 從而使其在復(fù)制過(guò)程 中出錯(cuò)產(chǎn)生突變。聶明等14利用的出發(fā)菌株經(jīng)30 W紫外燈誘變處理，篩選獲得 了 1株遺傳性能穩(wěn)定的產(chǎn)殼聚糖酶突變菌株，其酶活達(dá)3.47U/mL,比出發(fā)株提 高近2倍。鄭連英等對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶菌株 Peni-cilliumsp. ZD-Z1進(jìn)行紫外誘變， 搖瓶實(shí)驗(yàn)測(cè)定其粗酶液活性為 0.58U/mL使得殼聚糖酶活力提高了 3.8倍。實(shí)驗(yàn) 篩選獲得一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株(CX01 ,形態(tài)學(xué)初步鑒定為煙曲霉(CAspergillus fumigatus )。以該菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外輻射誘變篩選獲得4株突變株 CXQ1-7、CXQ1-8、CXQ1-

27、18、CXQ1-22 酶活力分別為 0.9557U/mL、0.8624U/mL、 0.8628U/mL、0.8901 U/mL，產(chǎn)酶活力分別比對(duì)照提高 50.25%、36.30% 35.65% 和39.95%。經(jīng)連續(xù)5次傳代測(cè)試，其遺傳性狀穩(wěn)定。方祥年等以B.bassiana 1316 菌株作為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外線和高能電子束注入誘變，篩選得到突變株 B.bassiana 1316-V1，其產(chǎn)殼聚糖酶能力提高為起始菌株的近16倍，達(dá)到 2.32U/mL。因此，實(shí)驗(yàn)獲得菌株還可結(jié)合其他誘變方式，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶活力， 同時(shí)還應(yīng)對(duì)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件和工藝進(jìn)行優(yōu)化。 致謝 本人的學(xué)位論文是在我的指導(dǎo)老

28、師劉老師的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成的。 他從課題的選擇到項(xiàng)目的最終完成，劉老師都始終給予我細(xì)心的指導(dǎo)和不懈的支 持。導(dǎo)師淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的 高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無(wú)華、平易近人的人格魅力對(duì) 我影響深遠(yuǎn)。不僅使我樹(shù)立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、 掌握了基本的研究方法，還使我 明白了許多待人接物與為人處世的道理。 本論文從選題到完成，每一步都是在導(dǎo) 師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在此，謹(jǐn)向劉老師表示崇高的敬意 和衷心的感謝！本論文的順利完成，離不開(kāi)各位老師、同學(xué)和朋友的關(guān)心和幫助。 時(shí)光匆匆如流水，轉(zhuǎn)眼便是大學(xué)畢業(yè)時(shí)節(jié)，春夢(mèng)秋云，聚

29、散真容易。離校日 期已日趨臨近，畢業(yè)論文的的完成也隨之進(jìn)入了尾聲。 從開(kāi)始進(jìn)入課題到論文的 順利完成，一直都離不開(kāi)老師、同學(xué)、朋友給我熱情的幫助，在這里請(qǐng)接受我誠(chéng) 摯的謝意！最后，再次對(duì)關(guān)心、幫助我的老師和同學(xué)表示衷心地感謝！ 參考文獻(xiàn): 1 武漢生物工程學(xué)院酶工程教研室.生物工程綜合實(shí)驗(yàn)M . 3 2 KUROIWA T,UTA H, NABETANI H, et al. Selective and stable pro-duction of physiologically active chitosa n oligosaccharides using an en- zymatic memb

30、ra ne bioreactorJ. Process Biochem, 2009, 44(3): 283-287 3 蔣挺大.甲殼素M.第一版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003 . 7-18 . 4 Yol J J, Sha nidi F, Kim S K. Preparation of chitin andchitosa n chito-oligosacchrides and their applicati ons in physiological fun cti onal foodsJ.Food Reviews In terna-tio nal, 2000,16(2):159-176. 5

31、Khan W, Prithiviraj B, Smith D L. Chitosa n and chit in oligomers in crease phe ny lala nine ammoni a-lyase and tyros ine ammoni a-lyase activities in soybea n leavesJ.Pla nt Physiol, 2003, 160(8):859-63. 6 Jeon Y J, Kim S K. Product ion of chitooligosaccharidesus ing an ultrafiltratio n membra ne reactor and theira ntibacterial activityJ. Carbohydr Polym, 2000 , 41(2 ):133 -141. 7 Tsai G J, Wu Z Y, Su W H. An tibacterial activity of a chitooligosaccharide mixtureprepared by cellulase digesti on of shrimp chitosa n and its applicati on to m