藥物研究與發(fā)展：第01章 總論

1、藍(lán)色字為判斷題內(nèi)容第一章總論醫(yī)藥是人類戰(zhàn)勝疾病的重要手段，它為人類的生命健康提供了重要保障, 在漫長(zhǎng)的人類發(fā)展歷史長(zhǎng)河中曾經(jīng)起過并將繼續(xù)發(fā)揮重要的作用。隨著生活水平的提高，人們對(duì)藥物的需求也日益增加。迄今為止，人類還有很多疾病未能得到有效治療。從當(dāng)今科技發(fā)展的方向看，藥物仍然是治療疾病的主要方式。因此，不斷發(fā)展新的、更為有效的藥物在今后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)都是世界范圍內(nèi)的重要課題。第一節(jié) 新藥發(fā)展策略一、 廣泛篩選藥物的發(fā)現(xiàn)是藥物研究最初始的步驟，是尋找和認(rèn)識(shí)各種物質(zhì)藥用價(jià)值的過程。由于藥物的作用是具體物質(zhì)的固有屬性，藥物發(fā)現(xiàn)的過程是對(duì)未知世界的探索過程，發(fā)現(xiàn)藥物，不僅需要獲得這些物質(zhì)，更重要的

2、是發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的內(nèi)在藥用屬性。藥物發(fā)現(xiàn)的最基本方式是偶然發(fā)現(xiàn)和通過篩選來發(fā)現(xiàn)。藥物的偶然發(fā)現(xiàn)主要是在生活和醫(yī)療實(shí)踐過程中偶然遇到的發(fā)現(xiàn)。如：從食物中發(fā)現(xiàn)藥物。人們出于生存的目的，將大量的天然產(chǎn)物用作食物，在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)某種物質(zhì)具有防治疾病的作用，從而發(fā)展成為藥物。這類藥物的發(fā)現(xiàn)，在醫(yī)藥起源過程中有重要的地位；藥物新適應(yīng)癥的發(fā)現(xiàn)。許多藥物在臨床應(yīng)用過程中，由于使用者身體狀況和疾病的基礎(chǔ)不同，表現(xiàn)出對(duì)某些藥物的非預(yù)期的作用，從而發(fā)現(xiàn)了新的適應(yīng)癥，如近年來上市的Viagra就是典型的例子；非常規(guī)過程發(fā)現(xiàn)藥物。無論是在醫(yī)療實(shí)踐還是在研究過程中，由于采用非常規(guī)的操作過程，(有些甚至是偶然的失誤)而發(fā)現(xiàn)

3、了新的藥物，如青霉素就是在實(shí)驗(yàn)室偶然發(fā)現(xiàn)的。通過偶然機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)新的藥物，雖然成功的例子非常多，但其過程一般是不可控的，因此不可能成為人們主動(dòng)尋找藥物的途徑。顯然，廣泛篩選便成為藥物發(fā)現(xiàn)的主要方式。藥物篩選是主動(dòng)尋找藥物的過程。所謂篩選，就是對(duì)可能作為藥用的物質(zhì)，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其藥用價(jià)值。篩選的對(duì)象是可能作為藥用的物質(zhì)，因此，收集被篩選的物質(zhì)(樣品)越多，發(fā)現(xiàn)新藥的可能性越大。篩選的方法就是能反映藥物作用的技術(shù)手段，這些技術(shù)手段越靈敏越可靠，漏篩的可能性就越小。篩選藥物的策略多種多樣，下面是幾種常見的方式。（一） 定向篩選 所謂定向篩選, 就是采用特定的方法, 專門篩選防治某種疾病的

4、藥物。這種方法是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究過程中長(zhǎng)期使用的方法, 并在藥學(xué)研究中取得了巨大的成就, 如治療心血管系統(tǒng)疾病的藥物, 抗腫瘤藥物等等。但對(duì)于被篩選的物質(zhì)來講, 卻不能全面反映出其內(nèi)在的作用。因此, 理想的方法是在定向篩選的同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)一藥多篩, 從多方面發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的作用。（二） 篩選特定樣品這種篩選方法的特點(diǎn)在于利用了已有信息, 在特定的樣品范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。例如抗生素類藥物的篩選, 就是根據(jù)青霉素的來源作為借鑒, 以多種細(xì)菌的產(chǎn)物作為樣品, 篩選其抗菌活性, 從而發(fā)現(xiàn)了大量新的抗生素藥物。我國(guó)目前對(duì)中藥的研究也是采取這種方法, 根據(jù)中藥已有的相關(guān)信息, 選取對(duì)某類疾病可能有效的物質(zhì), 篩選其有

5、效成分。采用這種方式篩選, 具有較高的成功率, 但由于篩選范圍受到限定, 特別是所依據(jù)的信息資料不可能都有代表性, 也可能產(chǎn)生誤導(dǎo)。（三） 比較篩選 比較篩選是根據(jù)對(duì)現(xiàn)有藥物的認(rèn)識(shí), 獲得結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相似的樣品, 采用確定的模型進(jìn)行篩選, 由此發(fā)現(xiàn)同類型而作用更好的新藥物。這種方法主要用于模仿（me-too）創(chuàng)新藥的研究, 成功率也較高, 但是難以產(chǎn)生原始創(chuàng)新藥物。（四） 隨機(jī)篩選所謂隨機(jī)篩選, 就是采用不同的方法, 對(duì)可能作為藥用物質(zhì)樣品進(jìn)行藥理活性的廣泛篩選。這種篩選方法是新藥發(fā)現(xiàn)的最基本方式, 也是在醫(yī)藥發(fā)展過程中實(shí)際存在的方式。從原始階段人類尋找藥物到目前對(duì)新化合物的各種生物活性測(cè)試,

6、實(shí)際上都是隨機(jī)篩選。隨機(jī)篩選的特點(diǎn)是能夠發(fā)現(xiàn)全新的藥物, 但同時(shí)其成功率是不可預(yù)測(cè)的。要提高藥物隨機(jī)篩選的成功率, 就要保證足夠的篩選樣品量和廣泛的篩選方法。二、 先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造先導(dǎo)化合物是指已具有初步活性的化合物分子，它可以是已經(jīng)上市的現(xiàn)有藥物，也可以是業(yè)已被發(fā)現(xiàn)具有明顯藥理活性或作用特點(diǎn)的合成或天然化合物，其中有些是經(jīng)過廣泛篩選后得到的。運(yùn)用現(xiàn)代藥物設(shè)計(jì)方法可以對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化，以便進(jìn)一步提高活性、降低毒性、增加特異性或改善藥代動(dòng)力學(xué)特性等。這種方法是新藥研究與開發(fā)的經(jīng)典方法，通常稱為“間接合理藥物設(shè)計(jì)”，即在不清楚藥物作用靶結(jié)構(gòu)的情況下，通過對(duì)分子三維結(jié)構(gòu)與生物活性之間構(gòu)效關(guān)系

7、的研究，來指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)的方向。這是一個(gè)多輪次重復(fù)的過程，而每一輪都將會(huì)提供一些有用的信息給下一輪藥物設(shè)計(jì)使用。這種研究方法，結(jié)合綜合活性篩選，有時(shí)還會(huì)發(fā)現(xiàn)意料之外的新活性，從而成為另一種治療領(lǐng)域的藥物或先導(dǎo)化合物。三、 合理藥物設(shè)計(jì)合理藥物設(shè)計(jì) (rational drug design) 是依據(jù)生物化學(xué)、酶學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等生命學(xué)科的研究成果，針對(duì)這些基礎(chǔ)研究中所揭示的包括酶、受體、離子通道及核酸等潛在藥物作用靶位，再參考其內(nèi)源性配體或天然底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)藥物分子，以發(fā)現(xiàn)選擇性作用于靶位的新藥，這些藥物往往具有活性強(qiáng)、作用專一，且副作用較低的特點(diǎn)。而傳統(tǒng)新藥多是經(jīng)偶然觀察或?qū)Υ罅?/p>

8、天然物質(zhì)和合成物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)篩選后發(fā)現(xiàn)的，這種方法發(fā)現(xiàn)的藥物由于缺乏對(duì)藥物作用靶特征的了解及作用環(huán)節(jié)多，選擇性不是很高，因此往往活性很低，毒副作用較大。合理藥物設(shè)計(jì)分為直接設(shè)計(jì)和間接設(shè)計(jì)(模擬)。直接設(shè)計(jì)是指在已知靶物質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行的藥物分子設(shè)計(jì)。一般的方法是測(cè)定酶和受體的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，常用的方法是X衍射晶體測(cè)定法和高精度的核磁共振法，然后將親和力和活性最強(qiáng)的底物與酶或受體嵌合形成復(fù)合物后，再測(cè)定復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)或在溶液中的三維結(jié)構(gòu)，這樣即可了解到藥物和靶相互作用的三維模式，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行先導(dǎo)物分子結(jié)構(gòu)修飾，也可進(jìn)行所謂的全新藥物分子設(shè)計(jì)(de novo drug design)，即

9、設(shè)計(jì)出與先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)完全不同的新化合物分子。間接設(shè)計(jì)方法是在未知靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況下，利用藥物分子與靶物質(zhì)間的互補(bǔ)性，探索一系列藥物的三維結(jié)構(gòu)與生物活性的定量關(guān)系，即根據(jù)已知生物活性化合物的結(jié)構(gòu)，反推未知靶物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，或利用結(jié)構(gòu)已知的同族類似靶物質(zhì)推測(cè)其活性部位的空間結(jié)構(gòu)，然后再利用所推測(cè)的靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)設(shè)計(jì)新化合物。四、 模仿創(chuàng)新采用模仿(me-too)方法尋找新藥就是在別人專利藥物的基礎(chǔ)上，對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)加以修飾和改造，研究出自己的專利藥物，新藥研究開發(fā)的模仿方法，是當(dāng)今世界各國(guó)廣泛采用的戰(zhàn)略，即使是實(shí)力很強(qiáng)的大公司也不例外，因?yàn)檫@種方法投資少，周期短，成功率高，其市場(chǎng)實(shí)際上還是很可觀的。

10、模仿方法研究開發(fā)新藥已經(jīng)取得了巨大的成功。例如SmithKline根據(jù)H2-受體拮抗劑理論，成功開發(fā)出西咪替丁(cimitidine)，于1976年投放市場(chǎng)。Glaxo的科學(xué)家們得知關(guān)于H2-受體拮抗劑有研制成功新藥的可能性后，于是他們決定參與競(jìng)爭(zhēng)。終于在1981年推出了他們稍加改造的類似物雷尼替丁，成為世界最暢銷的藥品，年銷售量達(dá)30多億美元。之后，Merk又推出了療效更高的法莫替丁(famotidine)。又如，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的開發(fā)，大量的早期工作是在各大學(xué)完成的，當(dāng)時(shí)并沒有引起人們的商業(yè)追求。后來，Squibb逐漸發(fā)生了興趣，直到70年代后期才開發(fā)成功了卡托普利(cap

11、topril)。緊跟著，Merk就推出了依那普利(enalapril)，該品種由于去掉了分子中的巰基，增強(qiáng)了與酶結(jié)合的強(qiáng)度，故毒性小，作用持久。依那普利在1995年全球銷售額達(dá)23億美元。這兩個(gè)藥物成為80年代高血壓和充血性心力衰竭治療的主藥。90年代初，B-M Sauibb又上市了福辛普利(fosinopril)，成為第三代血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的代表。五、 手性均一體創(chuàng)新手性藥物是指只含單一旋光異構(gòu)體的藥物。由于許多藥物作用過程涉及藥物與機(jī)體生物大分子之間的手性匹配，近十年來手性藥物的研究開發(fā)引起了人們的極大興趣，并成為醫(yī)藥工業(yè)研究開發(fā)的新領(lǐng)域。美國(guó)、英國(guó)、瑞士、瑞典等國(guó)相繼頒布了關(guān)于手性

12、藥物的法規(guī)，要求凡帶有手性中心的新藥物分子，必須要進(jìn)行不同對(duì)映體之間的活性對(duì)比研究，以確定其最終藥用形式。手性藥物在藥效學(xué)性質(zhì)上存在以下四種情形：(1)異構(gòu)體具有完全不同的藥理作用。例如，反應(yīng)停(thalidomide)的S構(gòu)型為鎮(zhèn)靜劑，R構(gòu)型無鎮(zhèn)靜作用而有致畸作用；乙胺丁醇(ethambutol)的S，S構(gòu)型具有抗結(jié)核菌作用，而R，R構(gòu)型則可導(dǎo)致失明；喘速寧(trimethoquinol)其S構(gòu)型為支氣管擴(kuò)張劑，R構(gòu)型則具有抑制血小板凝聚作用。(2)異構(gòu)體中一個(gè)具有藥理活性，另一個(gè)沒有藥理活性。例如：甲基多巴(methyldopa)只有S構(gòu)型具有抗高血壓作用。(3)兩個(gè)異構(gòu)體雖藥理作用類型相

13、同但作用強(qiáng)度不同。例如，心血管系統(tǒng)藥物普萘洛爾(propranolol)，其S異構(gòu)體的受體阻斷作用比R異構(gòu)體強(qiáng)約100倍；抗炎鎮(zhèn)痛藥萘普生(neproxen)，其S一異構(gòu)體療效為R一異構(gòu)體的28倍。(4)兩個(gè)異構(gòu)體的藥理作用類型和作用強(qiáng)度完全相同。這種情況一般是手性中心不參與受體結(jié)合或僅存在非特異性作用的情況。例如，異丙嗪(promethazine)的兩個(gè)異構(gòu)體具有相同的抗組織胺活性和毒性。對(duì)手性藥物的評(píng)價(jià)研究，可以發(fā)現(xiàn)不同對(duì)映體的藥理學(xué)特性，為開發(fā)療效好、副作用小、治療成本低的手性藥物提供依據(jù)，也將對(duì)闡明藥物作用機(jī)理、預(yù)測(cè)藥物療效和毒性、發(fā)現(xiàn)新的作用類型和適應(yīng)癥提供幫助。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界藥品

14、市場(chǎng)共約1,700種藥物(原料藥)中，含有手性的藥物占57，但目前僅有20以單一對(duì)映體作為藥用，其余80仍以外消旋體用于臨床。不過開發(fā)單一異構(gòu)體藥物的機(jī)會(huì)越來越少了，首要的原因就是自1990年代初期開始，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）就鼓勵(lì)大制藥公司開發(fā)單一異構(gòu)體藥物，代替消旋體上市。因此，今后對(duì)于手性化合物的開發(fā)機(jī)會(huì)在于從現(xiàn)有藥物中分離母體藥物的活性代謝物。當(dāng)然，從長(zhǎng)遠(yuǎn)觀點(diǎn)來看，最根本的戰(zhàn)略還是發(fā)現(xiàn)新化學(xué)實(shí)體。第二節(jié) 新藥研究技術(shù)一、 組合化學(xué)技術(shù)組合化學(xué)(combinatorial chemistry)是由Furka等于1988年首先提出的，但直至1991年在一次專門的討論會(huì)上才正式應(yīng)用這一

15、名詞。組合化學(xué)是一種合成策略，目的是建立大型化合物庫，因此組合化學(xué)可定義為在不同結(jié)構(gòu)的構(gòu)建塊之間以共價(jià)鍵系統(tǒng)、反復(fù)地進(jìn)行連結(jié)，從而產(chǎn)生一批不同的分子實(shí)體的方法。組合化學(xué)概念的提出是對(duì)傳統(tǒng)有機(jī)合成以及活性物質(zhì)篩選觀念的挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期以來，化學(xué)家們認(rèn)為化合物要逐一合成、純化、鑒定其結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行生物活性的測(cè)定，但這種方法效率低、速度慢，使得新藥開發(fā)成本越來越高，周期越來越長(zhǎng)；而組合合成方法可以利用有限的反應(yīng)，同時(shí)合成大量的化合物，一個(gè)組合庫可以包括從幾十到幾百萬甚至上千萬或更多個(gè)化合物，生物活性測(cè)定可以對(duì)一種化合物進(jìn)行，更多情況下是對(duì)未經(jīng)純化的混合組分進(jìn)行篩選。有人作過這樣的比喻，如果把包括1024個(gè)

16、化合物庫中的每一個(gè)化合物放入微孔板的一個(gè)小孔中，結(jié)果是，這個(gè)庫將覆蓋整個(gè)美國(guó)，并且其厚度是30個(gè)帝國(guó)大廈高。如果我們真的得到了這樣一個(gè)庫，進(jìn)行逐一篩選也是沒有意義的。那么如何快速篩選出活性成分，就成為組合化學(xué)家必須面對(duì)的問題。組合化學(xué)打破了傳統(tǒng)合成化合物的模式，是用固相合成法合成許多化合物或者它們的混合物，先進(jìn)行藥理篩選，再證明活性化合物的結(jié)構(gòu)，此法用于新藥研究不僅快速、有效，而且節(jié)約人力、物力，因此，組合化學(xué)的產(chǎn)生被認(rèn)為是合成領(lǐng)域的一次“工業(yè)革命”，世界上幾乎所有的大制藥公司和大學(xué)都開展了此項(xiàng)研究，并在短短的幾年中，取得了許多令人矚目的成就。根據(jù)這種趨勢(shì)，有理由相信，組合化學(xué)必將成為下個(gè)世紀(jì)

17、尋找新藥的最主要的途徑之一。二、 反義技術(shù)反義核酸包括反義DNA、反義RNA和酶性核酸三種，它們可特異性地作用于靶基因或其相應(yīng)的mRNA，從基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)上調(diào)控基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)疾病的治療。藥物的研究與開發(fā)取決于兩個(gè)重要的參數(shù)：首先是要確定疾病發(fā)展過程中的合適靶點(diǎn)；其次是發(fā)現(xiàn)能特異性識(shí)別并能結(jié)合于該靶點(diǎn)上的化合物，從而干預(yù)疾病的發(fā)展過程。以往使用的靶點(diǎn)絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)、酶和激素。反義核酸作為藥物與常規(guī)藥物相比有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：有關(guān)疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，設(shè)計(jì)、合成特異性的反義核酸比較容易；反義寡核苷酸與靶基因能通過堿基配對(duì)原理發(fā)生特異和有效的結(jié)合，從而調(diào)

18、節(jié)基因的表達(dá)。它的缺點(diǎn)是天然的寡核苷酸難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而一旦進(jìn)入又易于被胞內(nèi)核酸酶水解，很難直接用于治療。為此人們采用藥物化學(xué)的原理和方法，對(duì)天然寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以達(dá)到治療藥物的要求。福米韋森(fomivirsen，Vitravene)1998年已由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于二線治療艾滋病所致細(xì)胞病毒(CMV)視網(wǎng)膜炎，這是全球獲準(zhǔn)上市的第一個(gè)反義藥物。隨著福米韋森的上市，以及包括ribozym類的新一代反義藥物進(jìn)入臨床，反義藥物的研究與開發(fā)將會(huì)取得飛速的發(fā)展。三、 高通量篩選技術(shù)高通量藥物篩選(High throughput screening， HTS)是使用機(jī)器人和自動(dòng)化系統(tǒng), 從大

19、量的樣本中鑒別出對(duì)確定的分子靶標(biāo)有相互作用的少量活性化合物的一種技術(shù)。被篩選出來的化合物可作為先導(dǎo)化合物, 進(jìn)一步研究開發(fā)成為新一代安全、有效的新型藥物。藥物高通量篩選分析技術(shù)是在長(zhǎng)期藥物研究經(jīng)驗(yàn)的積累和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，如分子生物學(xué)、分子病理學(xué)、分子藥理學(xué)、微電子技術(shù)等學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，形成的發(fā)現(xiàn)藥物的新方法，每天可以對(duì)數(shù)千至數(shù)萬樣品的藥物活性進(jìn)行檢測(cè)分析。分析對(duì)象除藥理活性外，還涉及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、不良反應(yīng)等。相當(dāng)多的高通量篩選分析方法是以微孔板 (如 96孔板 )為基礎(chǔ)的，加上高度自動(dòng)化的操作設(shè)備 (細(xì)胞采集設(shè)備、樣品轉(zhuǎn)移、沖洗、孵育、離心等設(shè)備、信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理設(shè)備等)。具體方法因檢測(cè)

20、對(duì)象不同而不同，但都是建立在對(duì)檢測(cè)對(duì)象分子或細(xì)胞水平的生物學(xué)機(jī)制有一定把握的基礎(chǔ)之上。所使用的技術(shù)包括基于放射性的檢測(cè)技術(shù)，基于熒光、發(fā)光或比色的檢測(cè)技術(shù)，以及、報(bào)告基因、雙雜交技術(shù)等自動(dòng)化技術(shù)，不經(jīng)過濾分離直接測(cè)定信號(hào)的“同質(zhì)”技術(shù)，閃爍親近測(cè)定法 (scintillation proximity assay, SPA), 以及報(bào)告基因技術(shù)等, 是實(shí)現(xiàn)高通量篩選分析的重要手段之一。 (一)高通量藥物篩選的自動(dòng)操作系統(tǒng)高通量藥物篩選每天要對(duì)數(shù)千化合物樣品進(jìn)行檢測(cè)，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯(cuò)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的陣列 (format); 不同的微孔板通

21、過條形碼加以標(biāo)記。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過光電閱讀器對(duì)特定的微孔板上的特定位置進(jìn)行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi)，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過程快速。自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具，簡(jiǎn)潔明了的圖示代表機(jī)器的動(dòng)作。編程過程簡(jiǎn)潔明了，可操作性強(qiáng)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成部分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫孵、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作。除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外，自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。 96孔、384孔在酶活性檢測(cè)以及

22、需同時(shí)開始、同時(shí)終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。由此可見，高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧 4個(gè)部分組成。研究者可根據(jù)主要篩選模型類型、篩選規(guī)模選購(gòu)不同的部分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)。（二）高通量藥物篩選的檢測(cè)系統(tǒng)快速、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥物篩選中，檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀

23、等。檢測(cè)儀器靈敏度的不斷提高，即使對(duì)微量樣品的檢測(cè)，也可以得到很好的檢測(cè)效果。1液閃計(jì)數(shù)放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時(shí)間分辨偶合回路 (time resolved coincidence circuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號(hào)的干擾，使測(cè)定靈敏度提高，同位素用量少。在 96孔板的分析檢測(cè)中，背景信號(hào)可控制在10 cpm左右。閃爍親近測(cè)定法()是一種新的液閃分析法。該方法通過親和結(jié)合，將放射配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標(biāo)記分析中的游離配基與結(jié)合配基的分離過程，使得放射配基分析可以以

24、全自動(dòng)化的方式進(jìn)行，在更大程度上適應(yīng)于高通量藥物篩選。2. 分光光度術(shù)為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計(jì)算機(jī)接口并能對(duì)多孔板進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的分光光度計(jì)。以Molecular Device公司的spectra 190為例，它采用 8條光導(dǎo)纖維同時(shí)對(duì)8孔進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)以 2 為間隔，可以在190850間進(jìn)行選擇。對(duì)未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進(jìn)行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測(cè)數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機(jī)軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理。方便、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高。分光光度術(shù)高靈敏儀器同自動(dòng)化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見光譜的高通量藥物篩選模型成

25、為主要模型種類。3. 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下, 化學(xué)能以光子的形式釋放出來?；瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)且穩(wěn)定。而以發(fā)光蛋白、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)則是閃光型發(fā)光反應(yīng), 其發(fā)光時(shí)間較短。由于時(shí)間分辨及偶合回路技術(shù)的使用, 對(duì)于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1 pg數(shù)量級(jí)。在單孔多點(diǎn)噴射技術(shù)中，用于檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭，用來加入反應(yīng)性底物。反應(yīng)性底物從100個(gè)小孔噴出，使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合。發(fā)光反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)后，可立即進(jìn)

26、行測(cè)定，對(duì)于閃光性化學(xué)發(fā)光的測(cè)定更為有利。4. 激發(fā)熒光檢測(cè)新型激發(fā)熒光檢測(cè)儀在傳統(tǒng)儀器的基礎(chǔ)上，用連續(xù)的激發(fā)光譜和測(cè)定光譜取代固定光譜。使模型的建立更具備靈活性。96孔板和384孔板的信號(hào)采集和處理模式使之適用于高通量藥物篩選中。（三）高通量藥物篩選的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)高通量藥物篩選的特點(diǎn)是對(duì)數(shù)以萬計(jì)的化合物樣品進(jìn)行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個(gè)方面的功能。（1）樣品庫的管理功能：化合物樣品庫對(duì)進(jìn)行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進(jìn)行存儲(chǔ)管理。對(duì)每一個(gè)新入庫的化合物進(jìn)行新穎性分析，排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物，避免不必要的篩選。由于高度反應(yīng)性基團(tuán)增加了假陽性出現(xiàn)

27、的幾率，樣品庫對(duì)新入庫的化合物進(jìn)行反應(yīng)基團(tuán)檢測(cè)以去除這類化合物。（2）生物活性信息的管理功能：:生物活性庫存貯每一化合物經(jīng)過不同模型檢測(cè)后的結(jié)果，并根據(jù)多個(gè)模型的檢測(cè)結(jié)果對(duì)化合物的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。（3）對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能：高通量藥物篩選的工作量大，自動(dòng)化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)對(duì)與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來通訊、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進(jìn)行管理，使高通量藥物篩選的各個(gè)環(huán)節(jié)程序化、標(biāo)準(zhǔn)化。（4）藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能：高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息，隨著篩選的進(jìn)行，生物活性信息也將大幅度提高。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)通過對(duì)同一模型不

28、同的呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找出其構(gòu)效關(guān)系，從而為藥物設(shè)計(jì)提供參考。（四）高通量藥物篩選的基本過程高通量藥物篩選結(jié)果雖然多數(shù)情況下能夠提供樣品化合物作用機(jī)制的信息，但并不能完全證明它對(duì)某種疾病具有防治作用。因此，采用高通量藥物篩選方法來發(fā)現(xiàn)藥物一般采取以下幾個(gè)步驟。1. 初篩和復(fù)篩藥物的初篩和復(fù)篩就是在分子、細(xì)胞水平上篩選樣品，證明某一樣品對(duì)該靶點(diǎn)具有藥理活性 (或親和力)。初篩以后，選擇具有活性的化合物，采用系列濃度，進(jìn)行同一模型的復(fù)篩，闡明其對(duì)該靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)、作用強(qiáng)度和量效關(guān)系，由此發(fā)現(xiàn)活性化合物(樣品)。2深入篩選深入篩選是在初篩和復(fù)篩的基礎(chǔ)上，將得到的活性化合物在與初篩不同

29、但相關(guān)的分子、細(xì)胞模型作進(jìn)一步的篩選。其篩選內(nèi)容包括：活性化合物的選擇性、細(xì)胞毒性以及其它性質(zhì)。經(jīng)過深入篩選，可為比較全面地評(píng)價(jià)活性化合物的藥用價(jià)值提供更充分的實(shí)驗(yàn)資料。根據(jù)這些資料并結(jié)合活性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)行綜合分析，確定在結(jié)構(gòu)和作用方面具有新穎性和開發(fā)價(jià)值的化合物(樣品)作為先導(dǎo)化合物。同時(shí)，也可以結(jié)合組織器官或整體動(dòng)物模型，證明其藥理作用，為活性化合物提供更加充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。獲得先導(dǎo)化合物以后，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化 (根據(jù)資料也可以直接作為藥物候選化合物進(jìn)行開發(fā))，即進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)的改造，以便得到活性更高、缺點(diǎn)更少的活性物質(zhì)。普通的結(jié)構(gòu)優(yōu)化手段是經(jīng)過分子設(shè)計(jì)進(jìn)行多種衍生物的合

30、成。近年發(fā)展起來的組合化學(xué)技術(shù)為結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了強(qiáng)有力的手段。結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的化合物需要重復(fù)篩選過程，以得到高效的新化合物。3確證篩選確證篩選 (confirmatory screening)是對(duì)深入篩選獲得的先導(dǎo)化合物或優(yōu)化后的被選定的活性最好的化合物進(jìn)行更深入廣泛的研究。其內(nèi)容包括藥理作用、藥物代謝過程、一般毒性等多方面的篩選, 以確定其開發(fā)前景。對(duì)符合藥物要求的樣品, 確定為“藥物候選化合物 (candidate compounds)”，進(jìn)入開發(fā)研究程序，即臨床前研究，為臨床研究準(zhǔn)備必要的資料。以上過程是對(duì)篩選靶點(diǎn)明確的篩選模型而言，在實(shí)際工作中，可以采取多種靈活的方式和方法，最終目的是為了高

31、效地發(fā)現(xiàn)新藥。綜上所述，高通量篩選方法作為新藥發(fā)現(xiàn)的手段具有明顯的優(yōu)勢(shì)，它具有選擇范圍廣、篩選成本較低、結(jié)果可靠等特點(diǎn)，是新藥研究的重要技術(shù)。四、 基因芯片技術(shù)生物芯片 (Bio Chip)是用微加工技術(shù)(光刻、光化學(xué)合成、激光立體化刻蝕等)并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)制成的具有一定生物學(xué)分析檢測(cè)功能的微型器件?？捎糜谕瓿缮飿悠返姆蛛x、制備、生化反應(yīng)及產(chǎn)物的檢測(cè)等一系列過程?；蛐酒?(Gene Chip) , 又稱芯片 (DNA Chip) , 是最重要的一種生物芯片?；蛐酒霞闪顺汕先f的網(wǎng)絡(luò)狀密集排列的基因探針,能夠在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因, 迅速讀取與生命相關(guān)的基因信息。它是受到在固相

32、支持物上合成多肽的啟發(fā)而發(fā)明的。美國(guó)Affymetrix公司總裁Fodor為主要的發(fā)明者之一。 隨著芯片技術(shù)不斷完善, 已經(jīng)在基因診斷、基因表達(dá)、基因組研究、發(fā)現(xiàn)新基因及各種病原體的診斷等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中顯示出應(yīng)用價(jià)值?；蛐酒难芯亢蛻?yīng)用可以大大推進(jìn)人類基因組計(jì)劃和蛋白質(zhì)組科學(xué)的研究。通過比較不同個(gè)體或物種之間以及同一個(gè)體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，正常和疾病狀態(tài)下基因表達(dá)的差異，尋找和發(fā)現(xiàn)新的基因，研究基因的功能以及生物體在進(jìn)化、發(fā)育、遺傳等過程中的規(guī)律?；蛐酒蔀樘剿鞑煌瑢哟味嗷騾f(xié)同作用的生命過程提供手段，將在研究人類重大疾病如癌癥、心血管病等相關(guān)基因及作用機(jī)理方面發(fā)揮巨大的作用。一些著名的醫(yī)

33、藥公司已將基因芯片技術(shù)用于新藥篩選。以期從天然產(chǎn)物和合成物中篩選基因相關(guān)藥物。 (一) 基因芯片用于藥靶的研究據(jù)推測(cè), 人類約有3萬種疾病, 許多疾病由遺傳因素引起。一些慢性疾病如高血壓、型糖尿病等為多種基因相關(guān)疾病, 每種這類疾病可能涉及 510個(gè)基因。這些疾病相關(guān)基因都有可能成為藥靶(藥物作用靶點(diǎn))。每一基因產(chǎn)物及與其發(fā)生作用的蛋白質(zhì)也有可能成為藥靶。利用基因芯片可以比較正常組織(細(xì)胞)及病變組織(細(xì)胞)中大量 (可達(dá)數(shù)千)相關(guān)基因表達(dá)的變化, 從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶, 這種方法尤其適于病因復(fù)雜或尚未定論的情況。芯片技術(shù)可直接檢測(cè)的種類及豐度,所以它是研究基因表達(dá)的有力工具

34、。用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的芯片已研究完成。芯片中包含了幾萬種人工合成的寡核苷酸探針?？蓪?duì)幾個(gè)數(shù)量級(jí)細(xì)胞到單個(gè)細(xì)胞幾個(gè)拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),而且是定量研究?；蚬δ芸寺∈抢没虻谋磉_(dá)產(chǎn)物如蛋白質(zhì)、等達(dá)到搜尋和克隆相關(guān)基因的方法。目前常用差異表達(dá)法或消減雜交法：依靠?jī)煞N基因組 (如腫瘤組織與正常組織)在(如缺失)或表達(dá)上的不同,通過進(jìn)行片段或的雜交來篩選確定與疾病有關(guān)的基因。將已知的或其探針按一定方法在硅片或玻璃上列陣排布,用兩種熒光進(jìn)行待檢測(cè)組與對(duì)照組的或其(表達(dá)序列標(biāo)記, expressed sequence tag)探針的標(biāo)記。兩種材料一起與芯片雜交后, 每一種單獨(dú)表達(dá)的基因位點(diǎn)就會(huì)顯示

35、單獨(dú)的顏色, 而兩種基因組同時(shí)表達(dá)的基因位點(diǎn)則顯示其混合色, 通過顏色在亮度上的差別還可鑒定每一種基因表達(dá)的相對(duì)豐度。 Affymetrix公司應(yīng)用此方法成功地檢測(cè)到了細(xì)胞激活后基因的表達(dá)。他們的研究表明, 對(duì)每一個(gè)基因只需要2 0個(gè)左右的探針對(duì)即可對(duì)其表達(dá)進(jìn)行準(zhǔn)確分析。而通常一塊芯片可以進(jìn)行10,000個(gè)以上基因的檢測(cè)。有人在載玻片上固定排布了的微列陣 (microarray), 用以比較腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在基因表達(dá)圖式上的差別, 并準(zhǔn)確地檢測(cè)到了與腫瘤發(fā)生相關(guān)的下調(diào)和上調(diào)表達(dá)的基因, 由此可以確定與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因。這些基因序列可能成為治療和診斷的藥物作用靶。分子生物學(xué)將會(huì)提供豐富多彩的

36、分子靶, 以致超出制藥公司應(yīng)用開發(fā)的能力。因此選擇確定新穎的藥靶是當(dāng)前新藥研究的首要任務(wù)和目標(biāo)。運(yùn)用基因芯片可以有效地發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的基因, 尋找新藥靶。如臨床雖有多種抗結(jié)核藥物, 但由于結(jié)核分枝桿菌的抗藥性越來越嚴(yán)重, 全球每年有700萬的新結(jié)核病例產(chǎn)生, 開發(fā)新的抗結(jié)核菌藥成為當(dāng)務(wù)之急。目前, 結(jié)核分支桿菌的整套基因組已被探明,Wilson首次將分子生物學(xué)基因組的方法應(yīng)用于新藥的開發(fā), 并用芯片用于檢測(cè)抗結(jié)核藥物異煙肼作用后基因表達(dá)的變化。他們發(fā)現(xiàn)異煙肼作用后, 所誘導(dǎo)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)與藥物作用模型有關(guān), 此基因包括五個(gè)編碼脂肪酸型合成酶及fbpc的操縱子。另外, 還有幾個(gè)不影響生物合成途

37、徑的基因, 這些基因可能與藥物的副作用有關(guān)。通過此方法可以確定新的藥物靶點(diǎn)。炎癥是一類由于受傷部位毛細(xì)血管擴(kuò)脹、血流量的減少和白細(xì)胞積聚所致的疾病,是機(jī)體對(duì)受傷的一種反應(yīng)。與炎癥相關(guān)的基因很多,如,等。迄今為止已開發(fā)出各類抗炎藥物,篩選模型也多種多樣。Scott等使用含有10,000個(gè)基因的芯片, 檢測(cè)了在炎癥情況下1 (一種單細(xì)胞系 )分別由 (Phorbol 12-myristate 13-acetate)和脂多糖作用后的基因表達(dá)情況。他發(fā)現(xiàn)其中有幾個(gè)明顯上調(diào), 而這幾個(gè)基因以前并無報(bào)道, 且其功能也未知。這幾個(gè)基因與炎癥有關(guān), 有可能成為一個(gè)新的藥靶。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生、發(fā)展過程中基因的表達(dá)

38、調(diào)控有一個(gè)復(fù)雜變化的表達(dá)模式。芯片為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中的基因開關(guān)及表達(dá)程度提供了強(qiáng)有力的工具。利用它可隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)各期與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)模式。黑色素瘤細(xì)胞系UACC 903的裸鼠致瘤性及生長(zhǎng)特性能被引入人類正常 6號(hào)染色體而趨于正常。用含有1161個(gè)基因片段的芯片與來源于UACC 903的探針 (標(biāo)記綠色熒光素 )及來源于UACC 903 (+6 )的探針 (標(biāo)記紅色熒光素)雜交, 雜交譜中綠色熒光斑點(diǎn)顯示是UACC 903優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因, 紅色熒光斑點(diǎn)是UACC 903 (+6 )優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因。黃色或棕色則代表兩細(xì)胞系共表達(dá)的基因。這樣兩種細(xì)胞系的基因表達(dá)性情況可被雜交譜直接表現(xiàn)

39、出來。在包含有870個(gè)特異基因中, 正常細(xì)胞系與黑色素細(xì)胞系相比, 1.7%下調(diào), 7.3 %上調(diào)。并且用芯片的結(jié)果與Northern雜交結(jié)果是一致的, 說明了這種方法的可靠性。這些能改變自身表達(dá)并能使腫瘤抑制的基因可作為治療靶。(二)芯片用于新藥篩選對(duì)已確定的藥靶基因進(jìn)行標(biāo)記分析,以便于采用芯片技術(shù)分析藥物作用后的基因表達(dá)變化。芯片技術(shù)可直接檢測(cè)的種類及數(shù)量。早在1995年,Schena等就報(bào)道了用雙熒光雜交顯色法,利用cDNA微芯片檢測(cè)基因差異表達(dá)。1998年在美國(guó)舉行的題為“基因組與藥物開發(fā)”的會(huì)議上, 提出了發(fā)展快速檢測(cè)不同基因表達(dá)和檢測(cè)與疾病相關(guān)基因的方法。近年微芯片技術(shù)得到越來越多

40、的應(yīng)用, 有大量文獻(xiàn)報(bào)道芯片用于檢測(cè)酵母和人體細(xì)胞的基因表達(dá)。用基因芯片篩選抗炎、抗腫瘤的藥物的報(bào)道也相繼出現(xiàn)。1997年Heller等首次使用96 cDNA的微矩陣檢測(cè)炎癥條件下基因的表達(dá)情況, 該芯片包括文獻(xiàn)報(bào)道部分與炎癥有關(guān)的基因。在此炎癥模型中, 細(xì)胞因子和化學(xué)因子都上調(diào), 這與預(yù)期的一樣。通過培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎病人軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)在和IL-1的刺激下有相似的表達(dá)圖譜, 從而可以建立以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的人類炎癥的模型。通過比較關(guān)節(jié)炎和腸炎的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種疾病的本質(zhì)一樣, 只是抑制水平有區(qū)別。對(duì)在抗炎藥物作用下表達(dá)情況的檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)氟輕松 (fluocinolone)、地塞米松 (d

41、examethasone)、潑尼松 (prednisone)、氫化可的松 (hydrocortisone)作用極其相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性很好。而且, 在臨床上對(duì)幾個(gè)關(guān)節(jié)炎病人的作用結(jié)果相似, 說明了該方法的可靠性。周期蛋白依賴性激酶2 (Cyclin dependent kinase 2, CDK2 )可與周期蛋白結(jié)合成復(fù)合物, 并與蛋白結(jié)合 (腫瘤抑制基因產(chǎn)物 )或一個(gè)與RB相關(guān)蛋白1 0 7及轉(zhuǎn)錄因子F2F結(jié)合成復(fù)合物, 通過作用于增殖有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄, 在細(xì)胞增殖周期期啟動(dòng)中發(fā)揮作用。在癌細(xì)胞中CDKs通?；钚愿呋蛟撁敢种苿┍日＜?xì)胞下調(diào), 這說明CDKs是一個(gè)抑癌藥物的作用靶點(diǎn)。Gray

42、等從化學(xué)庫中篩選得到的嘌呤類似物抑制周期蛋白依賴的激酶2, 用高密度微芯片 (含整套酵母基因 )檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 其中Flavopiridol與另兩種 2 ,6 ,9 三取代化合物能使將近一半的基因表達(dá)受影響, 其中 2 %3 %的細(xì)胞循環(huán)、代謝、表達(dá)產(chǎn)物增加2倍之多。令人感興趣的是當(dāng)兩種化合物作用時(shí), 基因表達(dá)結(jié)果是不同的, 即兩種化合物作用機(jī)制不同, 作用的靶基也不同。另外, 通過使無關(guān)基因滅活的方法, 如: 缺失、活性位點(diǎn)置換等, 可以使得待測(cè)藥品與對(duì)照品之間的區(qū)別更易于觀察。為了找到最合適的藥物, Gray等人還比較了正常酵母細(xì)胞在藥物作用下的表達(dá)圖譜與cdc28p激酶 (與2同源 )突變的

43、細(xì)胞的區(qū)別, 他們希望兩者基本相同, 但事實(shí)上, 只有極少數(shù)基因在兩種情況都改變, 但這也說明選擇合適的藥靶是一個(gè)基本問題。藥物篩選要求平行、快速, 生物芯片這種高通量、多參數(shù)而又近乎實(shí)時(shí)的篩選方式無疑具有巨大的優(yōu)越性。 對(duì)于以將化合物處理細(xì)胞后一群特定基因表達(dá)變化為靶標(biāo)的篩選方式, 使用芯片自然是較為合適的。cDNA芯片尚可用于反義寡核苷酸類藥物的篩選。 基因芯片可提供一個(gè)高通量的藥物篩選方法, 怎樣進(jìn)行數(shù)據(jù)處理是科學(xué)家所面臨的一個(gè)問題。計(jì)算機(jī)軟件及數(shù)據(jù)庫的開發(fā)顯得尤為重要。 在研究當(dāng)中, Scott等提出建立完整的微芯片數(shù)據(jù)庫的重要性, 他們建議將已知毒物與所有的藥物建立基因表達(dá)的數(shù)據(jù)庫。

44、人類基因組多樣性的數(shù)據(jù)庫將在Internet上發(fā)布。其目的就是使鑒定人類自身基因組的變化更加快速容易。如: 用為分析工具, 檢測(cè)某些遺傳病及藥物的異常反應(yīng)更加容易。并使可作為標(biāo)記物檢測(cè)人體30多億堿基中單個(gè)堿基的變化。當(dāng)小分子作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)激發(fā)特異的基因表達(dá), 由于臨床診斷費(fèi)用昂貴, 微芯片能提供一個(gè)相對(duì)比較便宜的藥物篩選方法。 用芯片進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與其他用途相比有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn): 信息量豐富, 含10,000個(gè)人特異的cDNA序列的芯片含有全部人類基因組的表達(dá)信息, 而同樣的用于測(cè)序的芯片只能測(cè)25,000 bp, 相當(dāng)于人類基因組的百萬分之八。數(shù)據(jù)直接與功能相聯(lián)系, 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄水平提供了一個(gè)

45、敏感、全面、可讀的細(xì)胞或組織樣本的生理狀況。當(dāng)生理狀況變化時(shí)則基因表達(dá)產(chǎn)物變化, 因此生物芯片提供了一個(gè)研究生物學(xué)進(jìn)程內(nèi)部機(jī)制的方法。分子生物學(xué)家預(yù)測(cè), 2 1世紀(jì)的藥物是為每個(gè)人設(shè)計(jì)的。 因?yàn)殡S著基因芯片技術(shù)的普及和基因科學(xué)研究的深入, 人們將會(huì)發(fā)現(xiàn)每個(gè)人對(duì)藥物敏感的基因、耐藥基因以及各種抗病基因等表達(dá)各不相同, 為達(dá)到最佳療效, 藥學(xué)家的任務(wù)之一是開發(fā)更具個(gè)體特異性的藥物。以單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs)為標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異。在人類基因組中大約1,000個(gè)堿基SNPs出現(xiàn)一次。因此可作為基因特異性的標(biāo)記。若能

46、將所有SNPs全部信息裝入芯片則可檢測(cè)到與之關(guān)聯(lián)的基因間的差異。美國(guó)麻省的Whitehead研究所已確定了450個(gè)。據(jù)該機(jī)構(gòu)的負(fù)責(zé)人Lander宣稱, 如果他們得到2,000個(gè)這種標(biāo)志, 就可以制造“基因組掃描儀”(genomic scanner), 即將所有收入單個(gè)芯片, 用來掃描各個(gè)個(gè)體基因組成上的差異。目前, 技術(shù), 尤其是-技術(shù)飛速發(fā)展, 如DD-PCC, SSH等技術(shù)相繼出現(xiàn), 輔以微芯片檢測(cè)技術(shù), 將會(huì)使新藥研究進(jìn)入一個(gè)新階段。五、 生物工程技術(shù)生物工程亦稱生物技術(shù)或生物工藝學(xué)，是利用生物學(xué)及工程學(xué)原理為人類制造有用產(chǎn)品及提供服務(wù)的技術(shù)。其發(fā)展可分3個(gè)階段：上古時(shí)期，用非純種微生物

47、自然發(fā)酵工藝稱為原始生物工程，本世紀(jì)40年代以純種微生物發(fā)酵工藝稱為近代生物工程，而本世紀(jì)70年代以基因工程為標(biāo)志的生物工藝稱為現(xiàn)代生物工程。今時(shí)三者共存構(gòu)成復(fù)雜的生物工程體系，為世人提供眾多治病藥物及服務(wù)，改善了人類生存條件，促進(jìn)了人類社會(huì)繁榮昌盛。 在精密控制條件下，根據(jù)生物學(xué)及工程學(xué)原理創(chuàng)制新藥的技術(shù)謂之現(xiàn)代醫(yī)藥生物工程，其內(nèi)容有基因工程、微生物工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程及生物反應(yīng)工程等。理論上任何有機(jī)物皆可由現(xiàn)代生物工程制造，足見現(xiàn)代生物工程在產(chǎn)業(yè)革命中擁有巨大潛力及發(fā)展前景。（一）基因工程 基因工程是在分子水平上定向改造生物遺傳性的技術(shù)。其主要特點(diǎn)是打破生物種間界限，克服遠(yuǎn)緣

48、雜交不親和性，獲得特異功能細(xì)胞，生產(chǎn)名貴藥品。其主要環(huán)節(jié)是制備目的基因、基因重組、重組基因轉(zhuǎn)移、基因工程細(xì)胞篩選、鑒定、培養(yǎng)、表達(dá)及產(chǎn)物純化等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)1987年頒布的2096項(xiàng)基因工程專利中有1992項(xiàng)為醫(yī)藥產(chǎn)品專利，占96。迄今已有數(shù)十種名貴藥品問市，如人胰島素、人生長(zhǎng)激素、人促紅細(xì)胞生成素(EPO)、人尿激酶(UK)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、乙肝疫苗、干擾素(IFN)、IL-2，3，6及60多種單克隆抗體(McAb)等。其中EPO對(duì)腎性貧血、化療及其它貧血均有良好療效，譽(yù)為“藥品皇冠之明珠”，有極好發(fā)展前景，美國(guó)1990年銷售額達(dá)4億美元。近年來由于高表達(dá)昆蟲宿主之應(yīng)用，及-I

49、FN、IL-2，3、乙肝疫苗、艾滋病毒抗原基因及腫瘤壞死因子基因在昆蟲體內(nèi)均獲得高表達(dá)，其中-IFN基因在家蠶體內(nèi)表達(dá)濃度為107 Uml，23條家蠶表達(dá)之產(chǎn)物相當(dāng)于4.5L人血液或1L基因工程菌發(fā)酵液之產(chǎn)物；此外，人-心房肽(-hANP)基因在酵母細(xì)胞中得到充分表達(dá)，且有95產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外，-hANP 是有希望成為充血性心力衰竭和高血壓等疾病最佳治療藥物之一。上述成果表明真核生物之間基因轉(zhuǎn)移技術(shù)亦獲得重大進(jìn)展。 此外，遺傳性疾病、惡性腫瘤、艾滋病及糖尿病的發(fā)生與發(fā)展，皆與基因突變及其異常表達(dá)有關(guān)，迄今尚無有效治療手段?；蚬こ痰恼Q生為根治上述疾病奠定了理論與技術(shù)基礎(chǔ)，有可能用正?；蜓a(bǔ)充缺

50、失基因，取代異?；蚧蛘{(diào)節(jié)基因表達(dá)功能，并有可能產(chǎn)生一系列基因藥物，導(dǎo)致藥物治療產(chǎn)生重大變革，推動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生第三次革命。（二）細(xì)胞工程 定向改變細(xì)胞遺傳性，創(chuàng)造特異功能細(xì)胞，用于生產(chǎn)名貴藥品及提供服務(wù)的技術(shù)稱為細(xì)胞工程。其主要內(nèi)容有細(xì)胞融合，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、細(xì)胞生物反應(yīng)器及細(xì)胞反應(yīng)工程等，并涉及動(dòng)植物及微生物細(xì)胞，后者已形成規(guī)模性產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)抗生素、維生素、氨基酸及核酸類藥品。 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)系指人工控制條件下，高密度大量培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞具有群體效應(yīng)及功能全能性，除腫瘤細(xì)胞及傳代細(xì)胞外，尚有錨地依賴性及接觸抑制性；細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，需氧量較微生物低，不耐受強(qiáng)烈攪拌和高速通風(fēng)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜

51、，需要小牛血清，為產(chǎn)品分離純化造成困難，目前已研制出無血清培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)方式有懸浮法及固定化法兩種類型，有多種反應(yīng)器可供選用。懸浮法多用氣升式反應(yīng)器。固定化培養(yǎng)法有轉(zhuǎn)瓶或平板式培養(yǎng)器。目前動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的tPA、UK、IL-2、EPO、IFN及100多種單克隆抗體等昂貴藥品均已商品化，另有多種激素、酶及疫苗等亦取得重大研究進(jìn)展。細(xì)胞融合是將兩個(gè)不同種屬細(xì)胞合并成表達(dá)二親本性狀雜種細(xì)胞的技術(shù)，包括植物及微生物原生質(zhì)體融合及雜交瘤技術(shù)，后者已十分成熟，并已研制出5萬多種雜交瘤細(xì)胞，其基本過程是使骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞融合，經(jīng)培養(yǎng)、分離及篩選獲得針對(duì)單一抗原決定族的克隆系，以生產(chǎn)單克隆抗體，目前已

52、有100多種單克隆抗體用于診斷及治療各種癌癥及傳染病。植物細(xì)胞培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)和功能全能性及群體效應(yīng)，培養(yǎng)過程生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞易于成團(tuán)，不耐受強(qiáng)烈攪拌與通風(fēng)，產(chǎn)物往往滯留細(xì)胞內(nèi)，可通過融合及誘變獲得有益性狀細(xì)胞生產(chǎn)名貴藥品。細(xì)胞培養(yǎng)方式亦分為懸浮培養(yǎng)及固定化培養(yǎng)兩類。懸浮培養(yǎng)法多采用氣升式連續(xù)培養(yǎng)罐，固定化培養(yǎng)多用纖維素細(xì)胞固著法填充床式反應(yīng)器。植物細(xì)胞培養(yǎng)已獲得眾多研究成果，如煙草、黃連、熏衣草、紫草、人參、洋地黃、長(zhǎng)春花、海巴戟及紅花等細(xì)胞培養(yǎng)，已分別獲得CoQ10、小檗堿、生物素、紫草素、人參皂甙、地高辛、蛇根堿、阿瑪堿、蒽醌及-維生素E等重要藥物，其它尚有利血平、異喹啉堿及哈爾滿堿等。其中煙

53、草細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)規(guī)模為20m3，人參細(xì)胞為2m3，紫草細(xì)胞為750L，紫草素已商品化。此外，秋海棠與黃連兩種細(xì)胞原生質(zhì)體融合后雜種細(xì)胞既產(chǎn)生花色素，亦產(chǎn)生黃連素，同時(shí)植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)有時(shí)能獲得其外植體不產(chǎn)生的藥用成分，如蕓香及穿心蓮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可分別獲得蕓香培素及倍半帖內(nèi)酯。此外植物細(xì)胞尚具有催化有機(jī)物產(chǎn)生酯化、皂化、水解、羥化、異構(gòu)化、甲基化、去甲基化、羧基化、雙鍵還原、縮合及氧化等化學(xué)反應(yīng)，如希臘毛地黃細(xì)胞可將甲基毛地黃毒甙轉(zhuǎn)化為甲基地高辛，已實(shí)現(xiàn)4m3中試生產(chǎn)規(guī)模，而胡蘿卜細(xì)胞可使毛地黃毒配基及菱毒配基分別轉(zhuǎn)化為杠柳配質(zhì)及5羥菱毒配質(zhì)。由此可知，在現(xiàn)代醫(yī)藥生物工程中，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用范圍

54、十分廣泛，且不受氣候及地理環(huán)境影響，前景誘人。（三）酶工程酶或細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)加工處理后用于藥品生產(chǎn)與疾病治療技術(shù)稱為酶工程，為當(dāng)今競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的高新技術(shù)領(lǐng)域之一。目前酶或細(xì)胞固定化、生物傳感器及酶反應(yīng)器為其核心內(nèi)容。固定化系指通過物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞限制或定位于特定空間范圍內(nèi)的技術(shù)，以期反復(fù)使用。其方法有吸附、包埋、分子交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合及熱處理等，所用載體或基質(zhì)有硅膠、活性炭、氧化鋁、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、卡拉膠、聚氨酯、纖維素酯、離子交換劑、瓊酯糖、海藻膠、纖維蛋白及膠原蛋白等。用于酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的核心設(shè)備稱為酶反應(yīng)器，目前主要有攪拌罐、填充床及介于二者之間的流化床式3類，其規(guī)格型號(hào)很多，可根據(jù)生

55、物催化劑性能及形狀、底物及產(chǎn)物理化性質(zhì)、轉(zhuǎn)化方式及反應(yīng)條件選擇適當(dāng)反應(yīng)器。此外，將酶或細(xì)胞作為分子識(shí)別元件與相應(yīng)電子器件構(gòu)成的設(shè)備稱為生物傳感器，用于控制發(fā)酵及生物轉(zhuǎn)化過程，或用于檢測(cè)體液中某些物質(zhì)的變化以判斷相關(guān)疾病發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。酶工程誕生僅20余年，但已有poly：C、ATP、FDP、L-Met、L-Phe、L-Trp、L-ASP、L-Ala，L-蘋果酸、-氨基丁酸、短桿菌肽及葡萄糖酸等重要藥物實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其它尚有6-APA、7-ACA、苯乙酰甲醇及間羥苯乙酰甲醇等制藥工業(yè)原料。同時(shí)該技術(shù)已延伸至細(xì)胞工程領(lǐng)域，近年來動(dòng)植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)已生產(chǎn)出多種名貴藥物。如人胰島素，IL-2、Co

56、Q10、生物素、紫草素、小檗堿、可待因、甙類、生物堿及McAb，且細(xì)胞固定化后產(chǎn)物量較懸浮培養(yǎng)為高，如固定化長(zhǎng)春甙花細(xì)胞阿瑪堿產(chǎn)率較懸浮細(xì)胞高40，罌粟細(xì)胞固定化后可待因產(chǎn)率較懸浮細(xì)胞培養(yǎng)高10，足見酶工程技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中擁有巨大潛力。其次有人將脲酶固定化后用于血液體外循環(huán)，將血中尿素分解為氨，經(jīng)吸附劑除氨以解毒，此稱為第一代人工腎；亦有將脲酶、谷氨酸脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶及NAD+共固定化，用于完成尿素體外循環(huán)，稱為第二代人工腎；亦有人考慮用固定化天冬酰胺酶進(jìn)行體外血液循環(huán)治療白血病。此外固定化生物催化劑體內(nèi)應(yīng)用的研究亦取得重要進(jìn)展，如固定化胰島細(xì)胞植入患糖尿病大鼠體內(nèi)，即釋放出胰島素并可調(diào)節(jié)血糖正

57、常代謝水平，且不產(chǎn)生排異反應(yīng)。近年來亦有人將多種McAb同時(shí)吸附于一種載體上，制備預(yù)防多種疾病的疫苗已取得重要進(jìn)展。由此可知，酶工程技術(shù)在臨床上亦有極其廣泛應(yīng)用前景。（四）蛋白質(zhì)工程采用物理化學(xué)或生物學(xué)方法制造非天然蛋白質(zhì)類藥物及制藥工業(yè)用工具酶的技術(shù)稱為蛋白質(zhì)工程。其內(nèi)容主要有蛋白質(zhì)分子主鏈切割、連接、分子內(nèi)及分子間再組合、主鏈的部分或全部人工設(shè)計(jì)、合成與組裝及側(cè)鏈修飾，或者人工定向設(shè)計(jì)非天然基因及基因定點(diǎn)突變技術(shù)制造特定基因，通過宿主細(xì)胞表達(dá)制造非天然蛋白質(zhì)及酶類新藥或制藥用工具酶，后者亦稱為第二代基因工程。蛋白質(zhì)工程研究目的在于克服天然蛋白質(zhì)和酶類藥物的熱不穩(wěn)定性、高免疫原性及其它缺陷，

58、以獲得高效治療藥物及高效率制藥工具酶，推動(dòng)醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展。蛋白質(zhì)工程雖處于初期發(fā)展階段，但因其在醫(yī)藥工業(yè)中具有無可估量的發(fā)展前景，故美、日及西歐諸國(guó)均已投入巨資，建立數(shù)十個(gè)專門研究機(jī)構(gòu)，已有許多重要研究成果獲得成功。如日本人用微生物發(fā)酵獲得的膽紅素氧化酶經(jīng)PEG修飾后，活性大為提高，正準(zhǔn)備開發(fā)，用于治療新生兒黃膽及肝炎；此外，經(jīng)苯乙烯及馬來酸酐共聚物修飾的SOD可優(yōu)先在炎癥部位累積，提高了抗炎效果。目前，還趨向于采用兩種藥物進(jìn)行相互修飾研究，以期獲得雙重及多重性藥效的藥物。如美國(guó)Genetech公司將-IFN及-FEN基因重組后，經(jīng)宿主表達(dá)的雜種蛋白質(zhì)-IFN-FEN在低劑量時(shí)，抗腫瘤作用大于兩種因子混合物。又如牛血清白蛋白、禽丙種球蛋白及促黃體激素釋放素分別與維生