遺傳工程的載體

1、遺傳工程的載體 隨著人們對遺傳物質dna的深入研究，許多科學家嘗試直接用dna轉化原核或真核生物但成效甚微，理想重組體分子的發(fā)生頻率極低。 主要的原因是：外源dna在宿主細胞連續(xù)增殖的情況下，由于不能自我復制而丟失，只有少數被整合到質?；蚣闹骰蛏系钠尾拍苄掖嫦聛?。 dna能在寄主細胞中得到復制的一個必要條件就是具備復制起點。細菌和病毒的基因組通常只有一個復制起點。 這種能夠自我復制，而且僅具有一個復制起點的dna分子稱為復制子( replicon )。 大多數dna片段不是復制子，因而不能自我復制；dna分子即使包含復制起點，在外源寄主細胞中也不一定有功能。 dna重組技術的優(yōu)越性在于利用

2、寄主細胞中有復制功能的復制子作載體，連上理想的外源dna片段，然后被送到寄主細胞中。載體的功能及特征 通常把能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具稱為基因克隆載體。 載體的功能： 運送外源基因高效轉入受體細胞 為外源基因提供復制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 載體應具備的條件：1.具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.具有較高的外源dna的載裝能力4.具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點(多克隆位點 )5.具有合適的篩選標記質粒載體 質粒（plasmid)是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳

3、的一類核酸分子，絕大多數的天然dna質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，也成ccc-dna。 質粒常見于原核細菌和真菌中，絕大多數的質粒是dna型的；質粒dna的分子量范圍：1 - 300 kb 質粒dna分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。環(huán)形雙鏈的質粒環(huán)形雙鏈的質粒dna分子具有三種分子具有三種不同的構型：不同的構型：共價閉合環(huán)共價閉合環(huán)dna（sc構型），構型），開環(huán)開環(huán)dna（oc構型），構型），線性線性dna（l構型），構型），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。走在最前

4、的是scdna其后一次是ldna和ocdna。質粒的復制 質粒是一個獨立的復制單元（復制子），帶有復制起始點及其相關的復制元件。 質粒能利用寄主細胞的dna復制系統(tǒng)進行自主復制； 質粒dna上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系。有自己的復制起點和控制復制頻率的調控基因 質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制-質粒dna復制啟動控制orirop（+）roprna iirna i3553復制方向然后在rna酶h的作用下將rnaii加工為成熟的引物（555個堿基)起始質粒dna的合成。在開始復制時，首先由rna聚合酶在復制起始位點上游550bp處開始合成一條約750個核苷酸的rna分子（稱作rnai

5、i）。在質粒起始復制的過程中，有一小段rna分子（稱作rnai)起負調控作用。 rnai是由rnaii基因的反義鏈編碼的，僅108個堿基。以以e.coli cole1 質粒為例說明質粒復制質粒為例說明質粒復制這條rna分子的5端折疊形成一個富含g的環(huán)與質粒復制起始位點上游約20個堿基處的富含c的區(qū)域配對。 rnai折疊成三葉草結構，它與rnaii前提結合使后者不能形成特定的二級結構，從而影響了rnaii與dna形成穩(wěn)定的雜種分子，是質粒dna的復制不能正常進行。 在細胞中rnai的半衰期很短，它的濃度是由自由基的劑量（也就是質粒的拷貝數）決定的。 如果細胞中的拷貝數高于正常水平， rnai的含

6、量上升，從而抑制了質粒的dna的復制。相反，如果細胞中的質?？截悢档陀谡５乃?， rnai的含量下降，從而促進了質粒dna的復制。 這就是rnai控制細胞中質粒的拷貝數的方式。 所以根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停?嚴緊型質粒 1 - 3 拷貝 stringent plasmid 松弛型質粒 10 - 60 拷貝 stringent plasmid 一般來說，構建克隆載體是松弛型質粒。質粒的不相容性（不親和性） 當兩個質粒帶有相同的復制起始位點時，它們在復制和向子細胞的分配中就會產生競爭，如果沒有選擇，這兩個質粒就不能在同一個細胞共存，這種現象被稱作質粒的不相

7、容性（incompatibility of plasmid)或質粒的不親和性（plasmid incompatibility) 。 以大腸桿菌的質粒為例： cole1、pmb1擁有相似的復制子結構，彼此不相容 psc101、f、rp4擁有相似的復制子結構，彼此不相容 p15a及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容 質粒的不相容性：分子機制 兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內 兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的

8、最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢質粒的改造 天然質粒是指那些沒有經過以基因克隆為目標的體外構建改造的的質粒，往往不能滿足分子克隆對載體的需要，只有按預定目標人工構建的質粒才能成為優(yōu)良的載體。 構建一種質粒載體需要考慮以下幾個方面：構建一種質粒載體需要考慮以下幾個方面： 1.質粒載體的分子量（單位bp）應盡可能小。 分子量小的質粒作載體有很多有點：如容易從寄主細胞中提??；較能抵抗機械（超聲波）切割帶來的危害；便于限制性內切酶的酶切和連接等。 2.應該了解載體上基因位置、限制性內切酶的作用位點。 如果有可能的話，最好還要了解核苷酸序列。 3.在理想寄主中，載體應該容

9、易繁殖，拷貝數多；這樣可以得到大量載體和dna重組分子。 4.載體應該包含一個或兩個可供選擇的標記性狀（基因），從而可以區(qū)別含有載體的轉化細胞和不含有載體的非轉化細胞。 5.在載體上有多克隆位點，便于質粒的酶切和外源dna片段的克隆。p pb br r3 32 22 2b ba am mh hi is sa al li ih hi in nd di ii ii ip ps st ti is sc ca ai ia am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )右圖顯示了pbr322質粒上的四環(huán)素抗性基因（tcr或tetr)和氨芐青霉素抗性基因（ampr

10、或ampr）和對應的酶切位點。常用的遺傳標記基因及其作用機制常用的遺傳標記基因及其作用機制 1. 四環(huán)素抗性基因（四環(huán)素抗性基因（ tettetr r ，tcr） tetracycline 可結合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399 aas蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。 2. 氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因（ ampampr r ，apr） ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地切割氨芐青霉素的內酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。3.

11、氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（ cmlcmlr r ，cmr） chlorophenicol可結合在核糖體50 s亞基上，阻止蛋白質合成。cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素乙?；?，導致乙酰化的氯霉素不能結合在核糖體上。4.卡那霉素卡那霉素(kanr), 新霉素新霉素(neor)和和g418抗性抗性(g418r)基因基因 kanamycin，neomycin和g418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內。目前常用的質粒載體bamhipuc182686 bpaprlaczorigaattcgagc

12、tcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt396452ecorisstikpnismaixbaisalipstisphihindiii1.帶有多克隆位點的質粒多克隆位點是一段人工合成序列，其中含有多個限制性核酸的切割位點，如下圖的puc18fr 的多克隆位點上有十多個限制性內切酶的切點。 2.帶有噬菌體啟動子的質粒2743 bpmcs pt7aprpgem-3zpsp6laczori許多質粒在多克隆位點附近帶有來自噬菌體（t3、t7和sp6等）的啟動子。這樣在多克隆位點插入的外源dna就可以在體外得到轉錄。右上圖的大腸桿菌質粒載體pgem-3

13、z的多克隆位點的兩邊各有一個來自不同噬菌體的啟動子，可以在兩個不同方向轉錄插入的dna片段。 3.表達質粒 表達質粒載體在多克隆位點上的上游有強啟動子，使插入的外源基因可以在細胞內轉錄和翻譯成蛋白質。單鏈噬菌體克隆載體m13噬菌體 m13是一種絲狀的大腸桿菌噬菌體，包含一個單鏈的環(huán)狀dna分子，全長6407個核苷酸； m13噬菌體并不裂解他們的宿主，受侵染的細胞可以繼續(xù)生長和分解并釋放出大量的新生的m13噬菌體； m13噬菌體只有通過細菌外邊的性傘毛（蛋白質絲狀物）才能將其dna注入細菌，因此它只侵染有性傘毛的大腸桿菌（細胞內有f因子）。 m13噬菌體感染其宿主的過程： +dna +dna（+

14、 +）dnadnarfdnarfdnarfdnarfdna- dna- dnaii以噬菌體單鏈dna即（+）鏈作為模板，復制一條與（+）鏈互補的（-）鏈，形成親本復制型（rf)的雙鏈m13dna，然后以這種雙鏈dna通過復制或其他復制方式形成大量的rf拷貝。rf nda的（-）鏈進行轉錄，產生病毒mrnas,病毒基因ii產物使rf nda（+）鏈上的特定位置產生一個切口。滾換復制：以（-）鏈為模板連續(xù)地合成后代（+）鏈形成的后代（+）鏈經切割后組裝形成m13噬菌體互補互補-半乳糖苷酶（ -gal）是大腸桿菌lacz基因的產物，當培養(yǎng)基中的一種色素原（x-gal）被-gal切割后即產生藍色。如果

15、大腸桿菌lacz基因區(qū)域（5端）缺失，則只能編碼一種在氨基酸端截短的多肽，形成無穩(wěn)定活性的不完全酶，稱為受體。如果m13的lacz基因在相反的方向缺失，則產生在羧基端截短的多肽，也無半乳糖苷酶的活性，但這種蛋白質可作為供體。受體一旦接受了供體（在體內或體外）即可恢復半乳糖苷酶的活性，這種現象稱為互補( complementation)m13及其宿主的構建及其宿主的構建n對m13的構建：nm13上的基因ii和基因iv之間存在著非編碼區(qū)域，因此，引進一部分操縱子序列不影響噬菌體的活力。iii vi i iv ii x v vii ix viiiiii vi i iv ii x v vii ix v

16、iiilaczpolylinkermcs野生型m13rf-dnam13mp系列載體插入成分包含lac啟動子（p)、操縱子（o)、和-gal基因氨基端146個氨基酸的編碼序列（z，即供體肽的編碼序列）等。還使供體肽的編碼序列里包含有多種限制性內切酶的識別序列（多克隆位點mcs），這對供體肽的互補能力毫無影響。n對m13寄主的改造：n使寄主細胞中僅包含一個有功能的基因，而且這個基因的區(qū)域已被刪掉。n當改造的m13侵染這種寄主時，由m13產生的供體能夠與寄主細胞產生的無活性的nm13 dna載體的特點：n使克隆的dna片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外，這在dna定向突變中非常有用；nm13重組分子

17、篩選簡便； 被m13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 n但m13-dna載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb噬菌粒噬菌粒n噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。n噬菌體載體兼具單鏈噬菌體和質粒的特點。n噬菌粒載體的特點：n能像m13-dna那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞 ；n像質粒那樣在受體細胞中自主復制，雙鏈dna穩(wěn)定，易于大量提取；n裝載量比常規(guī)的m13mp系列要大很多（10 kb），n通過克隆雙鏈dna能獲得同等長度的單一單鏈dnan重組操作簡便，篩選容

18、易雙鏈噬菌體克隆抗體雙鏈噬菌體克隆抗體噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體噬菌體由dna（ nda)和外殼蛋白組成，結構上分為頭部和尾部兩部分， nda集中在頭部。 nda是線狀dna分子全長是48502bp，左右兩端各有12個核苷酸組成的5凸出粘性末端，而且二者的核苷酸序列互補，即：5gggcggcgacctnn.nn3 3nn.nncccgccgctgga5dna 進入宿主細胞后，粘性末端連接形成環(huán)狀dna分子。通常把能互補連接的粘性末端成為cos位點。n噬菌體的基因族結構頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因dna合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因l - dna裂解溶原

19、根據噬菌體和宿主的關系，把噬菌體分為溫和性噬菌體和烈性噬菌體某種噬菌體感染宿主細胞后，其dna與宿主染色體dna整合，一起復制和傳代，無感染其他細胞的能力，這樣的噬菌體為溫和型噬菌體。帶著種噬菌體的宿主細胞稱為溶源性細胞。溶源性細胞溶源性細胞在一定的誘導因子作用下，噬菌體dna會脫離染色體dna重新包裝成噬菌體顆粒，釋放到宿主外，再去感染其他細胞，此過程被稱為溶源性增殖途徑。有些噬菌體感染宿主細胞后，其dna不插入染色體dna，經過一定時間的潛伏期，就大量增殖新的顆粒，使宿主細胞破裂，釋放出來的噬菌體顆粒又感染其他細胞，把此過程稱為溶菌性增殖途徑；把這樣的噬菌體稱為烈性噬菌體。溫和性噬菌體不會

20、導致宿主細胞死亡，并且溶源細胞可以傳代，因此溫和性噬菌體是構建噬菌體克隆載體很好的材料噬菌體的侵染吸附注入復制包裝裂解在大腸桿菌的的表面有一種外膜蛋白麥芽糖孔蛋白（又叫噬菌體受體蛋白）受體，可以促進麥芽糖或麥芽糖糊精從胞外進入細胞。這種蛋白是由大腸桿菌的lamb基因編碼的，它的表達受麥芽糖誘導，同時又受葡萄糖抑制。噬菌體通過位于尾部頂端的j蛋白與麥芽糖孔蛋白受體互作吸附到大腸桿菌表面。當噬菌體尾部的組分與大腸桿菌基因編碼的甘露糖磷酸轉移酶互作后，噬菌體和受體就形成了一個不可逆的復合體。噬菌體載體的構建選用構建2.在3.建立dna分子體外包裝系統(tǒng) 野生型dna包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源dna片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型dna的長度，可以提高裝載量。其實野生型dna上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據切除的多少，可將dna分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體（置換性載體）粘粒載體（考斯質粒）dna載體和m13-dna載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源dna片段，考斯質粒和噬菌粒載體的構建就是為了