7凝膠過(guò)濾層析法純化牡蠣堿性磷酸酶

1、實(shí)驗(yàn)十 凝膠過(guò)濾柱層析純化堿性磷酸酶一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2.通過(guò)凝膠過(guò)濾柱層析對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行純化色譜的歷史知識(shí)層析 色譜 chromatography茨維特（mikhail tswett，俄國(guó)植物學(xué)家），1901年，植物色素分離1952 年，james 和martin 發(fā)明了氣相色譜，獲得1952 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)用于生物分子分離分析的色譜技術(shù)液相色譜（常壓液相色譜、高壓液相色譜-hplc）、吸附色譜（柱色譜、薄層色譜）、離子交換色譜、親和色譜、金屬螯合色譜（“鎳柱”）、排阻色譜（凝膠色譜）二、原理凝膠過(guò)濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀

2、結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)：a. 條件溫和 b.操作簡(jiǎn)便 c. 損失少回收率高 d. 層析柱可反復(fù)使用凝膠的類型：sephadex: 交聯(lián)葡聚糖 sepharose：瓊脂糖凝膠 bio-gel abio-gel p：聚丙烯酰胺凝膠分子篩sephacryl：用n，n-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠g-10g-15g-25g-50g-75g-100g-150g-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）d700150050001500-200003000-700004000-1500005000-

3、3000005000-500000凝膠及柱的選擇凝膠的處理及裝柱凝膠干粉的溶脹（熱溶脹）、浮選、抽氣、裝柱、藍(lán)色葡聚糖檢查、平衡裝柱時(shí)要注意操作壓。裝柱的兩種方法：a.手工操作 1/3床體積水加入少許凝膠積起1-2厘米凝膠床打開出水口連續(xù)緩慢加入凝膠b.電動(dòng)攪拌下的裝柱法 （如圖4-9）樣品上柱分析用量：柱床體積的12%制備用量：柱床體積的1020%洗脫收集部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀凝膠的保存方法0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰四、操作方法（一）凝膠的選擇與處理1.凝膠及柱的選擇選擇sephadex g50和1.5cm60cm的柱子。2.凝膠的處理 凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10

4、倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。（二）裝柱 1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出。 2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約5cm高度柱容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。 （三）凝膠柱的平衡 通過(guò)2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)

5、定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來(lái)在加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保護(hù)凝膠上端有一段液體。 實(shí)驗(yàn)步驟1、按圖示排列將凝膠柱及各儀器連接好。（1）凝膠柱的出水口與紫外檢測(cè)儀的進(jìn)水口（打“”符號(hào)者）連接，通過(guò)軟管將紫外檢測(cè)儀的出水口（打“ ”符號(hào)者）與部分收集器連接；（2）用紅、黑兩條連接線將紫外檢測(cè)儀與記錄儀相連接“紅接紅”、“黑接黑”；2、依次打開紫外檢測(cè)儀、部分收集器、記錄儀開關(guān)，對(duì)儀器進(jìn)行預(yù)熱。3、通過(guò)“量程/零位”切換開關(guān)，設(shè)定記錄儀的量程為“10mv”，取下記錄筆的筆套，檢查記錄筆是否可書寫。4、轉(zhuǎn)動(dòng)紫外檢測(cè)儀右側(cè)板上的波長(zhǎng)旋鈕，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。5、打開凝膠柱出水口

6、的夾子，使洗脫緩沖液流經(jīng)檢測(cè)器。把“靈敏度”旋鈕選擇到“100%”檔，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕，使檢測(cè)儀窗口數(shù)字顯示為100，即透光率為100%。再將“靈敏度”開關(guān)轉(zhuǎn)到“0.5a”檔，緩慢調(diào)節(jié)“調(diào)零”旋鈕，檢測(cè)儀數(shù)字顯示為“0”，并使記錄儀指針在“0”位。以上步驟需反復(fù)調(diào)節(jié)幾次，待層析系統(tǒng)平衡后，即可加樣檢測(cè)。（注意：在樣品檢測(cè)的過(guò)程中，不可再調(diào)節(jié)“調(diào)零”、“光量”旋鈕！）6、完成以上步驟后，進(jìn)行流速檢測(cè)，記下凝膠柱中洗脫液流出2ml所需的時(shí)間，并以此時(shí)間對(duì)部分收集器進(jìn)行定時(shí)。7、部分收集器的使用：（1）按下“手動(dòng)/自動(dòng)”鍵，使收集器處于“手動(dòng)”狀態(tài)，在此狀態(tài)下設(shè)置定時(shí)時(shí)間；（2）按“選擇”鍵，每按一

7、次移動(dòng)一位，根據(jù)第6步的結(jié)果設(shè)定定時(shí)時(shí)間。當(dāng)數(shù)字閃爍時(shí)，可通過(guò)“置數(shù)”鍵設(shè)置該位的時(shí)間，時(shí)間設(shè)定后再按一次選擇鍵，即完成定時(shí)時(shí)間的設(shè)定。（注意：定時(shí)的時(shí)間單位為分鐘，即本型號(hào)儀器的最小定時(shí)時(shí)間為1 1分鐘）8、加樣檢測(cè)（1）打開駐上端的螺絲帽塞子，用滴管吸出層析住中多余的溶液直至液面與膠面相切。（2）沿著柱管壁將1ml堿性磷酸酶樣品小心加入到凝膠床面上（注意不可將凝膠膠面沖起），打開出水口夾子，使樣品溶液進(jìn)入膠面內(nèi)，直同時(shí)收集流出液，至液面與膠面相切時(shí)，將出水口夾緊。（3）按上述加樣的操作，以洗脫緩沖液洗滌柱管壁兩次，每次1ml。最后加入3-4ml洗脫緩沖于凝膠柱中，重新裝上上口螺絲帽，柱進(jìn)水管與架上洗脫液試劑瓶相連。（4）打開凝膠柱出水口的夾子，使已設(shè)定好定時(shí)收集時(shí)間的部分收集器處于自動(dòng)收集狀態(tài)，并開動(dòng)記錄儀進(jìn)行記錄。記錄儀走紙速度設(shè)定為2mm/min。五、注意事項(xiàng)1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。2）裝柱要均勻，既