第六章蛋白質(zhì)的分離純化

1、第六章第六章 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征蛋白質(zhì)的分離、純化和表征一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)中的功能團(tuán) 末端nh2 末端cooh 側(cè)鏈基團(tuán)所以，蛋白質(zhì)的化學(xué)物理性質(zhì)aa a蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用。b蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán)來自側(cè)鏈上的功能團(tuán)。c結(jié)合蛋白質(zhì) 輔基成分包含可解離蛋白質(zhì)d末端-cooh, -nh2e蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的pk和游離aa中相應(yīng)基團(tuán)的pk值完全不相同。在蛋白質(zhì)分子中受到鄰近電荷的影響f蛋白質(zhì)可看作一個(gè)多價(jià)離子 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)-在某一ph值，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，凈電荷為零。這一ph稱為蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 等離子點(diǎn)-沒有其他鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)

2、界離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子 受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的ph稱等離子點(diǎn)。特征常數(shù)。二蛋白質(zhì)分子的大小與形狀 利用sds聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量利用sds聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量 蛋白質(zhì)在各種介質(zhì)中（page）電泳時(shí)，它的遷移率 這樣造成兩個(gè)后果：sds為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比向正極移動(dòng)。 改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。 sds-蛋白質(zhì)在水溶液中長(zhǎng)橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。電泳遷移率與多肽鏈分子量的對(duì)

3、數(shù)有下列關(guān)系( (七七) ) 毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量 毛細(xì)管電泳（毛細(xì)管電泳（cece）則可以在很大程度上克服常）則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時(shí)間長(zhǎng)、靈敏芽低不利情況。用毛細(xì)管電泳規(guī)方法時(shí)間長(zhǎng)、靈敏芽低不利情況。用毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量?jī)H需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可測(cè)定蛋白質(zhì)分子量?jī)H需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)精確定量。以用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)精確定量。 ( (八八) )質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量是近年來發(fā)展的一項(xiàng)新質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量是近年來發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，其分辨率和精確度都較前幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其技術(shù)

4、，其分辨率和精確度都較前幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其近幾年發(fā)展起來的磁質(zhì)譜可精確測(cè)定分子質(zhì)量近幾年發(fā)展起來的磁質(zhì)譜可精確測(cè)定分子質(zhì)量2000da2000da以下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜（以下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜（esiesi）可以測(cè)）可以測(cè)5 5萬萬dada的蛋白質(zhì)，而且只需要皮摩爾（的蛋白質(zhì)，而且只需要皮摩爾（pmolpmol）量的蛋）量的蛋白質(zhì)，精確度為白質(zhì)，精確度為0.01%0.01%。三蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液是分散系統(tǒng)：分散相是蛋白質(zhì)分子顆粒，分散介質(zhì)是水。分散程度-膠體系統(tǒng)分散相質(zhì)點(diǎn)-真溶液（質(zhì)點(diǎn)是分子，均相系統(tǒng)） 分散程度-以分散相質(zhì)點(diǎn)的直徑來衡量 根據(jù)分散程度：

5、 分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定需三個(gè)條件：a 分散相質(zhì)點(diǎn)1-100nmb 分散相質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥不聚成顆粒而沉淀c 分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層蛋白質(zhì)： a. 膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍 c 丁達(dá)爾效應(yīng)d 布朗運(yùn)動(dòng)e 不能透過半透膜2蛋白質(zhì)的沉淀 沉淀蛋白質(zhì)的方法： 鹽析法： 中性鹽（nh4so4，naso4，nacl等） 蛋白質(zhì)脫去水化層優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性 有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用 條件：低溫操作 縮短時(shí)間 重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液phpi,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子 (hg2+,pb2+,cu2+.ag

6、+等)生成沉淀用途：搶救誤服重金屬鹽的病人生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑 當(dāng)溶液phpi 蛋白質(zhì)帶電，溶解度較大phpi 1 不同蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同 pi時(shí)溶解度最低將蛋白質(zhì)彼此分開2蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度 鹽溶作用機(jī)理：蛋白質(zhì)吸附鹽類離子，帶電表層使蛋白質(zhì)分子被此排斥，蛋白質(zhì)與水分子的作用加強(qiáng)，溶解度提高。同樣濃度（摩爾數(shù)/升）的兩價(jià)離子的中性外，如mgcl2 （nh4）2so4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響效果，要比單價(jià)離子的中性鹽如nacl,nh4cl大得多。 鹽析當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，eg.

7、飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象叫鹽析。原理大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 鹽析法分離、提純常用方法。保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。（nh4）2so43.有機(jī)溶劑分級(jí)法作用原理：.有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，。蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。.有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。 聚乙二醇（水溶性非離子聚合物）可致使蛋白質(zhì)沉淀。原理：脫去蛋白質(zhì)的水化層；聚乙

8、二醇與蛋白質(zhì)親水基團(tuán)發(fā)生相互作用，并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度與鹽濃度，ph，及絕對(duì)溶解度無關(guān)。其溶解度依賴于聚乙二醇的分子量。4溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響。 0-40攝氏度 大部分球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增大40-50攝氏度 大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定,開始變性大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,蛋白質(zhì)的操作在0攝氏度或更低溫度下進(jìn)行. 糜蛋白酶糜蛋白酶, ,胰蛋白酶及其前體的制備胰蛋白酶及其前體的制備 (三)根據(jù)電荷不同的分離方法 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析電泳

9、和離子交換層析兩類。兩類。 1 1電泳電泳 在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，例如在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱電泳性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱電泳(elecctrophoresis)(elecctrophoresis)或離子泳或離子泳(ionphoresis)(ionphoresis)。 或從方法學(xué)的角度給電泳下定義，電泳是在外電場(chǎng)存在下，利用分子攜帶的凈電荷不同分離分子混合物的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋曰質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分離分析和制備。 帶電顆粒在電場(chǎng)中的泳動(dòng)

10、速度主要決定于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形狀。顆粒在電場(chǎng)中發(fā)生泳動(dòng)時(shí)，將受到兩種方向相反的力的作用：f(電場(chǎng)力)=qe(=qu/s)ff(摩擦力)=fv這里，q顆粒所帶的電量e電場(chǎng)強(qiáng)度或電勢(shì)梯度u/qu兩電極間的電勢(shì)差(以伏特表示)s= 兩電板之間距離(以厘米表示)f摩擦系數(shù)(與顆粒的形狀，大小和介質(zhì)的粘度有關(guān))v顆粒泳動(dòng)速度(以厘米秒表示 當(dāng)顆粒以恒穩(wěn)速度移動(dòng)時(shí)，則f-ff=0，因此，qe=fv，即，v/e=q/f 在一定的介質(zhì)中對(duì)其一種蛋白質(zhì)禾說，q/f是一個(gè)定值，因而v/e月也是定值，它被稱為遷移率或泳動(dòng)度：u=v/eu值可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得，蛋白質(zhì)的u值為0.1*10-4 -1.0*

11、10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白質(zhì)的泳動(dòng)度以及ph和離子強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)度的影響都反映某一特定蛋白質(zhì)的特性。因此電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純廈的重要手段而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。電泳基礎(chǔ)：自由電泳（移動(dòng)界面電泳） a.先在u-形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液之間形成清晰的界面b.加電場(chǎng)c.由于界面處存在濃度梯度，因而產(chǎn)生折射率梯度。利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到界面的移動(dòng)。每個(gè)移動(dòng)界面相當(dāng)于一個(gè)特定蛋白質(zhì)。 區(qū)帶電泳 是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移數(shù)度不同分布成區(qū)帶而得名。按支持物介質(zhì)的物理性狀：四類區(qū)帶電泳：1.濾紙電泳.薄膜電泳(醋酸纖維薄膜電泳, 薄膜電泳)2.粉末

12、電泳:淀粉.纖維層.硅膠粉3.細(xì)絲電泳:尼龍絲,人造絲4.凝膠電泳:聚丙烯酰胺.瓊脂糖凝膠盤狀電泳 在區(qū)帶電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。支 持 物聚丙烯酰胺凝膠 三種物理效應(yīng)：1。樣品的濃縮效應(yīng)2。凝膠對(duì)分子的篩選效應(yīng)3。電泳分離的電荷效應(yīng)樣品分離效果好、分辨率等。 等電聚焦（電聚焦） 蛋白質(zhì)混合物的分離是在具有ph梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液介質(zhì)固體化、操作方便、分離快蛋白質(zhì)聚焦在等于其等電點(diǎn)的ph點(diǎn)處，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。 雙向電泳-aa混合物一次電泳不能完全分開,將第一次電泳分開的斑點(diǎn)通過支持介質(zhì)間的接觸吸印轉(zhuǎn)移到第二個(gè)支持介質(zhì)上,旋轉(zhuǎn)90進(jìn)行第二次電泳,稱雙向電泳.優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡(jiǎn)

13、單.操作方便,樣品用量少 1975 1975年，年，ofarrell ofarrell 首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出腸桿菌總蛋白分離出11001100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)一多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。 雙向電泳由第一向等電聚焦雙向電泳由第一向等電聚焦(ief)(ief)電泳和第二向電泳和第二向sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(

14、sds-page)(sds-page)組成，第一向使組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。2 離子交換層析原理：原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開。根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開。離子交換介質(zhì)：離子交換介質(zhì)： (1)(1)離子交換樹脂離子交換樹脂 (2)(2)離子交換纖維素離子交換纖維素 (3)sepharose fast flow:(3)sepharose fast flow: (4)sepharose high

15、 performance(4)sepharose high performance：分辨率較：分辨率較f.f.f.f.高高 (5)mono: hplc(5)mono: hplci i 分類：分類： 陰離子交換陰離子交換 強(qiáng)度強(qiáng)度 功能基團(tuán)功能基團(tuán) + + deae deae 中等中等 ochoch2 2chch2 2nh(chnh(ch2 2chch3 3) )2 2 + + qae qae 強(qiáng)強(qiáng) ochoch2 2chch2 2nh(chnh(ch2 2chch3 3) )2 2chch2 2chch3 3 陽離子交換陽離子交換 強(qiáng)度強(qiáng)度 功能基團(tuán)功能基團(tuán) cm cm 弱弱 ochoch2

16、2coocoo- - sp sp 強(qiáng)強(qiáng) chch2 2chch2 2chch2 2soso3 3- -ii ii 選擇：選擇： i i 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì) ii ii 根據(jù)分離目的選擇介質(zhì)根據(jù)分離目的選擇介質(zhì)例如：例如： 離子交換纖維素纖維素為交換基質(zhì)原理：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，吸較大的表面積，大分子可以自由通過優(yōu)點(diǎn)：交換容量大洗脫條件溫和回收率高品種多，選擇范圍廣 離子交換葡聚糖基質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大34倍。能根據(jù)凈電荷分子大小分離 蛋白質(zhì)混合物的分離由 溶液中的鹽離子強(qiáng)度ph 來完成結(jié)合力小蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來洗脫時(shí)保持

17、洗脫劑成分不改變改變洗脫劑的鹽濃度、ph值 跳躍式分段改變（分段洗脫） 漸進(jìn)式連續(xù)改變（梯度洗脫）梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：分離效果好分辨率高適合：交換容量小，對(duì)鹽敏感的離子交換劑 兩種混合器: 簡(jiǎn)單型混合器 復(fù)合型混合器 注意的問題：注意的問題： (1) (1) 緩沖液的選擇緩沖液的選擇： 陽離子：tris 陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽 (2) (2) 介質(zhì)處理：介質(zhì)處理： 陽離子： na+ 型 陰離子： cl- 型 (3) (3) 洗脫：洗脫：原理：i改變鹽濃度 ii改變ph值方式：i分步洗脫 ii梯度洗脫 (4) (4) 介質(zhì)再生介質(zhì)再生（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附分離 吸附層析-利用吸附力的強(qiáng)弱不同而達(dá)到分

18、離的目的。吸附劑-結(jié)晶磷酸鈣及羥基磷灰石蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的基團(tuán)，與羥基磷灰石的鈣離子結(jié)合。用磷酸緩沖液羥基磷灰石-分離核酸：病毒?；钚詂 硅酸 al2o3磷酸鈣-吸附層析（五）根據(jù)對(duì)配基的生物學(xué)特異性的分離方法-親和層析 基礎(chǔ)： 基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合）配基：能被生物大分子所識(shí)別并于之結(jié)合的原子，原子團(tuán)，和分子：酶-底物;激素-受體；抗原：抗體。原理 先把待提純的某一蛋白質(zhì)的特異配基，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上，在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個(gè)連接臂使配基于凝膠之間保持足夠的距離，不改變載體表面的空間位

19、阻妨礙等待分離的大分子與其配基的結(jié)合。 待提純的蛋白質(zhì)樣品+多糖材料待提純的蛋白質(zhì)樣品與配體結(jié)合，吸附，在瓊質(zhì)糖顆粒上結(jié)合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自由配體的分子溶液脫下來1 原理：利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行分離。利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行分離。2 介質(zhì)準(zhǔn)備： 載體選擇：sepharose 4bsepharose 4bsepharose cl4b,sepharose cl4b,sepharose fast flow,sepharose fast flow,sepharose high performancesepharose high performance 空間臂：偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)

20、，如己二偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或氨或氨基己酸。氨基己酸。 3 3 配基選擇：配基選擇： 抗原抗原抗體，酶抗體，酶抑制劑，酶抑制劑，酶底物，底物，激素激素受體，金屬結(jié)合蛋白受體，金屬結(jié)合蛋白螯和劑，螯和劑， 含巰基蛋含巰基蛋白白hghg或含巰基分子，凝集素或含巰基分子，凝集素糖蛋白糖蛋白4 4 偶聯(lián)：偶聯(lián)： i i 溴化氰法溴化氰法：與：與氨基或氨基或氨基偶聯(lián)。氨基偶聯(lián)。 效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。 ii ii 環(huán)氧氯丙烷法：環(huán)氧氯丙烷法：與與nhnh2 2, oh, sh , oh, sh 偶聯(lián)偶聯(lián) 偶聯(lián)時(shí)

21、需強(qiáng)烈條件，如偶聯(lián)時(shí)需強(qiáng)烈條件，如ph11ph11，40405050，適于特別，適于特別穩(wěn)定的蛋白穩(wěn)定的蛋白六蛋白質(zhì)含量的測(cè)定與純度的鑒定六蛋白質(zhì)含量的測(cè)定與純度的鑒定 分析工作： （一）測(cè)定蛋白質(zhì)的總量；（一）測(cè)定蛋白質(zhì)的總量；（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量；含量；（三）鑒定最后制品的純度。（三）鑒定最后制品的純度。 （四）活性測(cè)定（四）活性測(cè)定（一）濃度（一）濃度/ /含量測(cè)定含量測(cè)定 1 1 紫外法：紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。 2 lowry2 lowry法法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族

22、氨基酸還原磷鉬酸磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。 3 bradford3 bradford法：法：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料的結(jié)合量。 4 4 凱氏定氮法凱氏定氮法 5 5 雙縮脲法雙縮脲法（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)的含量-具有高度特異性的生物學(xué)方法酶活性激素活性抗原-抗體（三）蛋白質(zhì)制品純度的鑒定 1 1 電泳法：電泳法： sdssdspagepage， iefief 2 2 化學(xué)法：化學(xué)法： n n端測(cè)定，端測(cè)定， c c端測(cè)定端測(cè)定 3 3 儀器法：儀器法： hplchplc，質(zhì)譜，氨基酸組成分析，質(zhì)譜，氨基酸組成分析 4 4 物理方法：物理方法： 沉降分析沉降分析 擴(kuò)散分析擴(kuò)散分析 （四）活性測(cè)定（四）活性測(cè)定 1 激酶：標(biāo)記atp 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化還原酶 5 elisa溶菌酶：溶菌酶： 分子量為分子量為14kd14kd， 等電點(diǎn)為等電點(diǎn)為1111，耐熱，耐