第三章提取和分離

1、基因工程需要三種不同的dna: 學(xué)習(xí)內(nèi)容：l制備細(xì)胞總dnafigure3.1 the basic steps in preparation of total cell dna from a culture of bacteriabasic steps1.制備總dna基本步驟：1) 收集細(xì)菌細(xì)胞2)打碎細(xì)胞，釋放內(nèi)容物3)去掉dna以外的成分4)dna溶液的濃縮1.1培養(yǎng)、搜集細(xì)菌細(xì)胞兩種類型的細(xì)菌培養(yǎng)基的成分：lm9培養(yǎng)基： na2hpo4(6.0) kh2po4(3.0) nacl(0.5) nh4cl(1.0) mgso4(0.5) glucose(2.0) cacl2(0.015)ll

2、b培養(yǎng)基：yeast extract(5) nacl(10)1.1培養(yǎng)、收集細(xì)菌細(xì)胞37c，150-250rpm達(dá)到最大濃度2-3109cell/ml, 600nm下的od值，1od相當(dāng)于0.8109cell/ml figure3.2 estimation of bacterial cell number by measurement of optical densityfigure3.3 harvesting bacteria by centrifugation1.2 制備細(xì)胞提取物l利用溶菌酶、edta或兩者結(jié)合。figure3.4 preparation of a cell extrac

3、t.figure3.5 removal of protein contaminants by phenol extraction. 1.制備細(xì)胞總dna1.4 dna的濃縮與濃度測(cè)定l最常用的方法是乙醇沉淀（同時(shí)含有na離子）。dna沉淀可用玻璃棒挑出，或者離心沉淀。l260nm下測(cè)定吸光度，1od相當(dāng)于50260280figure3.6 collecting dna by ethanol precipitation .figure3.7 the ctab method for purification of plant dna十六烷基三十六烷基三甲基溴化銨甲基溴化銨figure3.8 the

4、 use of an anion-exchange chromatography resin in dna purification.2 質(zhì)粒dna提取l質(zhì)粒dna的大?。?8%）。ldna的構(gòu)造 alkaline denaturation ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡（溴化二氨乙苯啡啶）啶）-caesium chloride（氯化銫）（氯化銫） density gradient centrifugation2質(zhì)粒dna提取2.1 根據(jù)分子大小提取質(zhì)粒dnafigure3.9 preparation of a cleared .sphaeroplast殘壁細(xì)胞殘壁細(xì)胞2質(zhì)粒

5、dna提取2.2 根據(jù)分子構(gòu)造提取figure3.10 two conformation of circular double-stranded dna.figure3.11 plasmid purification by the alkaline denaturation method.alkaline denaturation2質(zhì)粒dna提取2.2 ebcscl密度梯度離心法l在大離心力條件下，形成梯度，生物大分子形成條帶。條帶的位置取決于其浮力密度。最上部是蛋白質(zhì)，中間是dna，下部是rna。figure3.12 cscl density gradient centrifugation.

6、cscl density gradient centrifugation2.2 ebcscl密度梯度離心法leb插入相鄰的堿基之間，降低了dna的浮力密度，但超螺旋的dna結(jié)合eb浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。lcscl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。figure3.13 partial unwinding of the dna double helix by etbr intercalation between adjacent base parirs.eb如何與如何與dna結(jié)合結(jié)合?figure3.14purification of plasmiod dna by

7、 etbr-cscl density gradient centrifugation如何分離質(zhì)粒如何分離質(zhì)粒dna？2質(zhì)粒dna提取2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增figure3.15 plasmid amplification plasmid amplificationinhibitor of protein synthesis: chloramphenical, 12h, 當(dāng)培養(yǎng)物離心時(shí)，細(xì)菌沉淀到底部，噬菌體留在懸浮液中，去蛋白就可以獲得噬菌體dna。然而獲得大量的噬菌體dna是一個(gè)障礙。每ml菌液可以獲得1010噬菌體，但只能產(chǎn)生500ngdna。3.1 噬菌體的培養(yǎng)自然培養(yǎng)的噬菌體是溶源性的。要獲得

8、大量的細(xì)胞外噬菌體，必須經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)使所有的噬菌體都進(jìn)入裂解周期，使細(xì)胞死亡釋放噬菌體。3.1 噬菌體的培養(yǎng)l大部分實(shí)驗(yàn)室都使用 i突變的溫度敏感突變體。 i基因可以使噬菌體保持整合狀態(tài)，突變后轉(zhuǎn)變成溶菌性的。在 i突變體中， i基因在30c條件下正常表達(dá)，在42c時(shí)，不能正常表達(dá)，產(chǎn)生溶菌性。figure3.17 induction of a clts lysogen（溶原菌）（溶原菌） by transferring from 30 to 42figure3.18 achieving the right balance between culture age and inoculum si

9、ze when preparing a sample of a non-lysogenic phage由于缺失修飾，大由于缺失修飾，大多數(shù)基因工程載體多數(shù)基因工程載體屬于此類型。屬于此類型。3.3 收集噬菌體3.4 從噬菌體中純化dna peg沉淀物中可能含有少量的細(xì)菌裂解物，也可能含有細(xì)菌dna。這些組成部分可以通過梯度離心去掉。除去cscl后可以獲得純凈的噬菌體。然后通過酚抽提或者蛋白酶處理蛋白質(zhì)外殼。figure3.19 collection of phage particles by polyethylene（聚（聚乙烯）乙烯） glycol（乙二醇）（乙二醇）(peg) precipitation figure3.20 purification of phage particles by cscl density gradient centrifugation.3.5 純化m13 dna l每ml菌液可以獲得1012的噬菌體。這意味著少量的培養(yǎng)物可以獲得大量的噬菌體，如5ml或更少。l由于細(xì)菌細(xì)胞不裂解，沒有細(xì)胞裂解物的問題，也不需要cscl梯度離心。figure3.21 preparation of m13 dna from an in