解放軍307醫(yī)院EGFR突變檢測經(jīng)驗分享

1、解放軍解放軍307307醫(yī)院醫(yī)院egfregfr突變檢測經(jīng)驗分享突變檢測經(jīng)驗分享劉劉 毅毅解放軍解放軍307307醫(yī)院醫(yī)院 全軍腫瘤中心全軍腫瘤中心 腫瘤學(xué)研究室腫瘤學(xué)研究室 & & 肺癌分子診斷中心肺癌分子診斷中心開展開展egfregfr突變檢測面臨的問題突變檢測面臨的問題一、是什么和為什么一、是什么和為什么二、怎么做及注意事項二、怎么做及注意事項三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究一、是什么和為什么一、是什么和為什么egfregfr基因的基本情況基因的基本情況egfregfr：表皮生長因子受體：表皮生長因子受體egfregfr的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑 e

2、gfregfr與腫瘤的生長及酪氨酸激酶抑制劑（與腫瘤的生長及酪氨酸激酶抑制劑（tkitki）http:/www.egfr- engl j medn engl j med 2004;350:2129-39 2004;350:2129-39egfregfr的突變類型的突變類型nature reviews cancernature reviews cancer 2007;7:169-181 2007;7:169-181肺癌靶向治療的里程碑：肺癌靶向治療的里程碑：ipassipass研究研究肺癌靶向治療的里程碑：肺癌靶向治療的里程碑：ipassipass研究研究n engl j med 2009;36

3、1:947-57n engl j med 2009;361:947-57肺癌靶向治療的里程碑：肺癌靶向治療的里程碑：ipassipass研究研究egfregfr突變狀態(tài)指導(dǎo)突變狀態(tài)指導(dǎo)tkitki類藥物的使用類藥物的使用egfregfr突變狀態(tài)已成為患者能否在一線使用突變狀態(tài)已成為患者能否在一線使用tkitki藥物的重要指標(biāo)藥物的重要指標(biāo)二、怎么做及注意事項二、怎么做及注意事項目前較為常見的目前較為常見的rgfrrgfr突變檢測方法突變檢測方法http:/www.egfr-http:/www.egfr-egfregfr突變檢測中需要明確的幾個基本概念突變檢測中需要明確的幾個基本概念2 2、基因

4、突變是指、基因突變是指dnadna發(fā)生堿基序列的改變：發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對性的檢測手段，針對非dna的檢測手段如：rt-pcr（檢測rna表達(dá)），免疫組化（檢測蛋白表達(dá)）以及針對非堿基序列的檢測手段如：fish（檢測dna的擴增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。體細(xì)胞突變體細(xì)胞突變發(fā)生在非種系組織中不具有遺傳性不會遺傳給子代種系突變種系突變發(fā)生于精子或卵子中可以遺傳子代子代所有細(xì)胞均帶突變1 1、egfregfr突變?yōu)轶w細(xì)胞突變：突變?yōu)轶w細(xì)胞突變：發(fā)生于腫瘤細(xì)胞中，正常細(xì)胞（癌旁或白細(xì)胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測要盡可能取到足量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，這是保證檢測

5、結(jié)果可靠的根本前提。腫瘤細(xì)胞內(nèi)及與正常組織間的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞內(nèi)及與正常組織間的異質(zhì)性片段化的片段化的dnadna不容易進(jìn)行擴增不容易進(jìn)行擴增egfregfr突變檢測中需要明確的幾個基本概念突變檢測中需要明確的幾個基本概念3 3、樣品特性：異質(zhì)性，突變細(xì)胞或、樣品特性：異質(zhì)性，突變細(xì)胞或dnadna的含量一般較少，的含量一般較少，dnadna經(jīng)常會嚴(yán)重片段化經(jīng)常會嚴(yán)重片段化4 4、關(guān)鍵是保證突變、關(guān)鍵是保證突變dnadna有效擴增至可檢測的范圍：擴增效率及檢測方法的敏感性有效擴增至可檢測的范圍：擴增效率及檢測方法的敏感性1 1、tapman tapman 探針法：邊擴增邊檢測探針法：邊擴增邊檢測

6、優(yōu)勢優(yōu)勢只檢測突變的序列只檢測突變的序列敏感性高且污染幾率小敏感性高且污染幾率小不足不足探針費用較高探針費用較高只能針對已知突變只能針對已知突變正常正常dnadna的擴增無限制的擴增無限制nature reviews drug discovery nature reviews drug discovery 20042004：3 3, 749-761749-761突變突變dnadna有熒光信號有熒光信號野生型野生型dnadna無熒光信號無熒光信號特定的探針：只結(jié)合突變序列特定的探針：只結(jié)合突變序列2 2、高分辨率溶解曲線（、高分辨率溶解曲線（hrmhrm）：擴增后再檢測）：擴增后再檢測優(yōu)勢優(yōu)勢已

7、知和未知突變序列已知和未知突變序列敏感性高且污染幾率小敏感性高且污染幾率小不足不足正常正常dnadna的擴增無限制的擴增無限制對儀器設(shè)備的要求較高對儀器設(shè)備的要求較高陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)3 3、變性高效液相色譜分析（、變性高效液相色譜分析（dhplcdhplc）：擴增后再檢測）：擴增后再檢測優(yōu)勢優(yōu)勢敏感性高敏感性高已知和未知突變序列已知和未知突變序列不足不足儀器普及率低儀器普及率低正常正常dnadna的擴增無限制的擴增無限制開蓋檢測增加污染幾率開蓋檢測增加污染幾率陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)陽性結(jié)果還需進(jìn)一步確認(rèn)檢測環(huán)境需獨立且通風(fēng)良好檢測環(huán)境需獨立且通風(fēng)良好4 4、直接測序

8、法：擴增后再檢測、直接測序法：擴增后再檢測優(yōu)勢優(yōu)勢直觀且相對成本低直觀且相對成本低已知和未知突變序列已知和未知突變序列不足不足工作量大且敏感性低工作量大且敏感性低開蓋會增加污染幾率開蓋會增加污染幾率正常正常dnadna的擴增無限制的擴增無限制sangersanger測序法原理測序法原理5 5、焦磷酸測序：擴增后再檢測、焦磷酸測序：擴增后再檢測優(yōu)勢優(yōu)勢適合已知序列適合已知序列已知和未知突變均可測已知和未知突變均可測敏感性高、直觀、能夠定量敏感性高、直觀、能夠定量不足不足需要專用儀器需要專用儀器正常正常dnadna的擴增無限制的擴增無限制開蓋會導(dǎo)致污染幾率增加開蓋會導(dǎo)致污染幾率增加6 6、突變富集

9、、突變富集pcrpcr：擴增后再檢測（抑制正常：擴增后再檢測（抑制正常dnadna擴增）擴增）優(yōu)勢優(yōu)勢敏感性高（此消彼長）敏感性高（此消彼長） 不足不足操作繁瑣操作繁瑣只針對已知突變只針對已知突變開蓋導(dǎo)致污染幾率增加開蓋導(dǎo)致污染幾率增加不好找合適的限制性內(nèi)切酶不好找合適的限制性內(nèi)切酶clin cancer resclin cancer res 2006;12(1):43-48 2006;12(1):43-487 7、擴增阻滯突變系統(tǒng)（蝎形探針）：邊擴增邊檢測、擴增阻滯突變系統(tǒng)（蝎形探針）：邊擴增邊檢測優(yōu)勢優(yōu)勢敏感性高且污染幾率小敏感性高且污染幾率小只擴增并檢測突變的序列只擴增并檢測突變的序列不

10、足不足只針對已知突變只針對已知突變試劑盒費用較高試劑盒費用較高7272延伸延伸9494解鏈解鏈6060自身雜交發(fā)光自身雜交發(fā)光armsarms引物引物各種突變檢測方法的綜合比較各種突變檢測方法的綜合比較http:/www.egfr-http:/www.egfr-1 1、操作流程、操作流程 2 2、污染幾率、污染幾率3 3、敏、敏 感感 性性 4 4、可實施性、可實施性我們最初采用的方法：直接測序法我們最初采用的方法：直接測序法選擇的理由選擇的理由結(jié)果直觀易懂結(jié)果直觀易懂大量文獻(xiàn)支持、金標(biāo)準(zhǔn)大量文獻(xiàn)支持、金標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件能夠滿足要求實驗室條件能夠滿足要求注意事項：注意事項：dnadna抽提部分抽

11、提部分新鮮組織新鮮組織體液（胸水或血漿）體液（胸水或血漿）石蠟包埋組織石蠟包埋組織提取過程約提取過程約1 1小時小時提取過程約提取過程約1 1小時小時提取過程約提取過程約3 3小時小時1 1、dnadna提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要，它決定了最終檢測結(jié)果的可靠性提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要，它決定了最終檢測結(jié)果的可靠性2 2、盡可能使用認(rèn)可程度高的試劑，以保證、盡可能使用認(rèn)可程度高的試劑，以保證dnadna的提取效率（的提取效率（takara dexpattakara dexpat）3 3、嚴(yán)格按照說明書要求保存試劑（溫度、濕度等），以免試劑失效、嚴(yán)格按照說明書要求保存試劑（溫度、濕度等）

12、，以免試劑失效4 4、可按自身需求對操作流程做適當(dāng)修改，但要形成、可按自身需求對操作流程做適當(dāng)修改，但要形成sopsop操作規(guī)范（操作規(guī)范（示例示例1 1、2 2）5 5、dnadna提取區(qū)域與提取區(qū)域與dnadna擴增后的分析區(qū)域要完全分隔，以避免氣溶膠污染擴增后的分析區(qū)域要完全分隔，以避免氣溶膠污染注意事項：注意事項：pcrpcr擴增部分?jǐn)U增部分1 1、dnadna質(zhì)量控制非常重要，可保證后續(xù)實驗的順利進(jìn)行（模板過量、質(zhì)量控制非常重要，可保證后續(xù)實驗的順利進(jìn)行（模板過量、pcrpcr抑制劑）抑制劑）2 2、設(shè)置好陰性對照（避免污染）和陽性對照（驗證實驗體系，必要時可取消）、設(shè)置好陰性對照（

13、避免污染）和陽性對照（驗證實驗體系，必要時可取消）3 3、選用保真性較高的、選用保真性較高的taqtaq酶，避免由實驗體系帶來的假陽性酶，避免由實驗體系帶來的假陽性4 4、做好詳細(xì)的實驗記錄，為以后的各種分析提供依據(jù)（、做好詳細(xì)的實驗記錄，為以后的各種分析提供依據(jù)（示例示例）marker marker 百倍稀釋百倍稀釋 原液原液 空白空白marker marker 空白空白 19 2119 21marker marker 空白空白 19 2119 21注意事項：注意事項：pcrpcr擴增部分?jǐn)U增部分原來的原來的1919號外顯子巢式號外顯子巢式pcrpcr引物引物原來的原來的2121號外顯子巢式

14、號外顯子巢式pcrpcr引物引物n engl j medn engl j med 2004;350:2129-39 2004;350:2129-39 改進(jìn)后的改進(jìn)后的1919號外顯子巢式號外顯子巢式pcrpcr引物引物 改進(jìn)后的改進(jìn)后的2121號外顯子巢式號外顯子巢式pcrpcr引物引物5 5、巢式、巢式pcrpcr并非必須，如果并非必須，如果dnadna的質(zhì)量足夠好，可以選擇一次的質(zhì)量足夠好，可以選擇一次pcrpcr6 6、不必迷信權(quán)威文獻(xiàn)中的實驗條件，實踐是檢驗真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)、不必迷信權(quán)威文獻(xiàn)中的實驗條件，實踐是檢驗真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)注意事項：結(jié)果分析部分注意事項：結(jié)果分析部分早期的報告早期的

15、報告現(xiàn)在的報告現(xiàn)在的報告報告力求簡潔明了，不僅有檢測結(jié)論還要有可靠的事實依據(jù)報告力求簡潔明了，不僅有檢測結(jié)論還要有可靠的事實依據(jù)注意事項：結(jié)果分析部分注意事項：結(jié)果分析部分檢測結(jié)果隨時歸檔，以備日后查詢、統(tǒng)計檢測結(jié)果隨時歸檔，以備日后查詢、統(tǒng)計三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究三、臨床問題的解決：轉(zhuǎn)化性研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)：以患者為中心，建立臨床治療和基礎(chǔ)研究間的雙向通道，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)：以患者為中心，建立臨床治療和基礎(chǔ)研究間的雙向通道，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)從臨床工作中發(fā)現(xiàn)和提出問題，和提出問題，尋找或建立相應(yīng)的解決方案，然后將其應(yīng)用于臨床，解決臨床的實際問題尋找或建立相應(yīng)的解決方案，然后將其應(yīng)用于

16、臨床，解決臨床的實際問題測序法敏感性不足將導(dǎo)致假陰性結(jié)果測序法敏感性不足將導(dǎo)致假陰性結(jié)果1.1. f hirsch, et al. jco 2006f hirsch, et al. jco 20062.2. c zhu, et al. jco 2008c zhu, et al. jco 20083.3. t mok, et al. discovery med 2009t mok, et al. discovery med 2009isel isel biomarkerbiomarker1 1測序法陰性樣本測序法陰性樣本200200份份armsarms法重新檢測法重新檢測17(+)17(+)測序

17、法復(fù)測測序法復(fù)測7(+)7(+)br21br21后續(xù)分析后續(xù)分析2 2測序法陰性樣本測序法陰性樣本n=148n=148armsarms法重新檢測法重新檢測 11(+)11(+)armsarms法是靈敏度更高的方法，測序法的假陰性率約為法是靈敏度更高的方法，測序法的假陰性率約為8%8%3 3阿斯利康第四期阿斯利康第四期egfregfr突變檢測培訓(xùn)班突變檢測培訓(xùn)班adx-armsadx-arms：邊擴增邊檢測且保證突變序列的有效擴增：邊擴增邊檢測且保證突變序列的有效擴增armsarms引物引物第一輪擴增第一輪擴增6464退火退火保證特異性保證特異性第二輪擴增第二輪擴增6060退火退火保證擴增效率保

18、證擴增效率擴增特異性擴增特異性由一輪引物保證由一輪引物保證 突變熒光信號：突變熒光信號：famfam 內(nèi)控?zé)晒庑盘枺簝?nèi)控?zé)晒庑盘枺篽exhex或或vicvic 外控?zé)晒庑盘枺和饪責(zé)晒庑盘枺篺amfam 陽性對照：內(nèi)含陽性質(zhì)粒陽性對照：內(nèi)含陽性質(zhì)粒 陰性對照：蒸餾水陰性對照：蒸餾水內(nèi)外控均檢測內(nèi)外控均檢測egfregfr基因基因2 2號外顯子號外顯子體系中含特殊石蠟避免氣溶膠污染體系中含特殊石蠟避免氣溶膠污染adx-armsadx-arms試劑盒的判讀流程試劑盒的判讀流程是否污染是否污染實驗體系實驗體系dnadna質(zhì)量質(zhì)量dnadna含量含量結(jié)果判讀結(jié)果判讀參數(shù)設(shè)置參數(shù)設(shè)置adx-amrsadx-amrs和和dxs armsdxs arms試劑盒的比較試劑盒的比較阿斯利康中國創(chuàng)新研究中