氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

1、蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性 1010-1012結(jié)構(gòu)蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉(zhuǎn)運蛋白l180180多種天然多種天然aaaa，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的。這些成的。這些aaaa被稱為被稱為非蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)aaaa。l參與蛋白質(zhì)組成的參與蛋白質(zhì)組成的aaaa為為蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)aaaa，常見的常見的只有只有2020種種 基本氨基酸，標準氨基酸基本氨基酸，標準氨基酸l 表達方式：表達方式：三字母三字母或或單字母的簡寫符號單字母的簡寫符號l除脯氨酸外，其他均具有如下結(jié)構(gòu)通式。除脯氨酸外，其他均具有如下結(jié)構(gòu)通式。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈r r基

2、基的不同。的不同。 -氨基酸氨基酸可變部分可變部分不變部分不變部分coohchh2nr一、基本氨基酸1 1, , 按按側(cè)鏈側(cè)鏈r r基的化學(xué)結(jié)構(gòu)基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三類，分為三類l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸15種種c2:1 c3:3 c4:3 c5:4 c6:4l芳香族氨基酸芳香族氨基酸3種種l雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)族氨基酸2種種glyalavalleuilephetyrtrpcysmetss氨基酸氨基酸的的r r基大小基大小l分為分為4 4類：類：l非極性氨基酸：非極性氨基酸：9 9l 極性不解離：極性不解離：6 6l極性氨基酸極性氨基酸 解離帶負電荷：解離帶負電荷：2 2酸性酸性l 極性解離極性解離

3、l 解離帶正電荷：解離帶正電荷：3 3堿性堿性lpolarnon-polartyrhisgly酸性酸性中性中性basicaspgluglncysasn serthrlysargalavalileleumetphetrppro氨基酸的極性分類氨基酸的極性分類極極性或非性或非極極性，是性，是影響影響蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵。-+ss有大有小有正有負有極性非極性 形形色色的氨基酸側(cè)基 l含硫氨基酸含硫氨基酸l含羥基氨基酸含羥基氨基酸l-c-c帶分支氨基酸帶分支氨基酸l二羧基一氨基氨基酸二羧基一氨基氨基酸l二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸l亞氨基酸亞氨基酸l在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出

4、一些不常見的氨在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為非標準氨基酸。由相應(yīng)基酸，通常稱為非標準氨基酸。由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的。的基本氨基酸衍生而來的。nhhocooh4-羥基脯氨酸h2nch2chch2ch2chcoohohnh25-羥基賴氨酸nh2ch3nhch2chch2ch2chcooh6-n-甲基賴氨酸hoiich2chcoohnh23,5-二碘酪氨酸 coohchh2nr手性手性c c；手性分子；手性分子；有兩種不同的排布方式，對應(yīng)有兩種不同的排布方式，對應(yīng)d d，l l兩種構(gòu)型。兩種構(gòu)型。旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。 d-甘

5、油醛甘油醛 (glycerose)ohchoch2ohhc123l 20 種天然氨基酸除甘氨酸外，都帶一個不對稱碳原子碳原子，都有光學(xué)異構(gòu)體（鏡映體）。 已知 19 種天然氨基酸均為 l型氨基酸。 比旋光度比旋光度d d2525( (單位濃度、單位長度下的旋光單位濃度、單位長度下的旋光度，度，/c/c* *l) l)是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù) 。l一）氨基酸的兼性離子形式：一）氨基酸的兼性離子形式： 氨基酸的兩個重要性質(zhì)：氨基酸晶體的氨基酸的兩個重要性質(zhì)：氨基酸晶體的熔點高（熔點高（ 200200 c c）；氨基

6、酸使水的介電）；氨基酸使水的介電常數(shù)增高。常數(shù)增高。 aa是兩性電解質(zhì)coohnh2 h+coo-r - c - hnh2 h+r - c - hcoo-nh2r - c - h酸性環(huán)境酸性環(huán)境中性中性環(huán)境環(huán)境堿性環(huán)境堿性環(huán)境+1-10pk1 2pk2 9.4等電點等電點6.0等等電點電點pipi：所帶凈電荷為零。電場中不移動。：所帶凈電荷為零。電場中不移動。此此氨基酸氨基酸在在 ph ph 2 2 或或 9 9 附近，有附近，有緩沖緩沖作用作用。賴氨酸的解離及等電點計算賴氨酸的解離及等電點計算ha2+a+a0a-l等電點等電點(isoelectric point,pi)(isoelectri

7、c point,pi)：l中性氨基酸：酸性和堿性基團的算術(shù)平均值：中性氨基酸：酸性和堿性基團的算術(shù)平均值： p pi i = (p = (pk k-coo-coo- + p- + pk k-nh2 -nh2 )/2)/2， l l酸性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術(shù)平均值酸性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術(shù)平均值p pi i = (p = (pk k-coo-coo- + p- + pk kr-coor-coo- - )/2 )/2 ， l堿性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術(shù)平均值堿性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術(shù)平均值p pi i = (p = (pk k-nh2-nh2+ p+ pk kr-nh

8、2 r-nh2 )/2 )/2 ， coohchh2nr亞硝酸反應(yīng)亞硝酸反應(yīng)烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng)?；磻?yīng)?；磻?yīng)脫氨基反應(yīng)脫氨基反應(yīng)西佛堿反應(yīng)西佛堿反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)脫羧基反應(yīng)脫羧基反應(yīng)疊氮反應(yīng)疊氮反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)成成 肽肽 反反 應(yīng)應(yīng)用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。cccooo茚三酮茚三酮cccooohohh2oh2o水合茚三酮水合茚三酮co2nh2rcho+cccoohohh2nchcoohrcccooohoh+2nh3cccoocccoo-nh4+nh2o2+cccooocccoohhol在近紫外

9、區(qū)在近紫外區(qū)(200-(200-400nm)400nm)只有酪氨酸、只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。吸收光的能力。l酪氨酸的酪氨酸的 maxmax275nm275nm，l苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nml色氨酸的色氨酸的 maxmax280nm280nml氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為氨基酸。蛋白質(zhì)氨基酸。蛋白質(zhì)除含除含c,h,oc,h,o外，還含有外，還含有n n。aaaa平均分子量平均分子量為為110110。l不同蛋白的含氮量皆在不同蛋白的含氮量皆在16%16%左右。只需測左右。只需測定定n n含量，含量， n n含量含量/16%/

10、16%即為蛋白含量。即為蛋白含量。l l - -凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)l根據(jù)根據(jù)r r基的極性。原理：分配層析?；臉O性。原理：分配層析。l 濾紙層析濾紙層析：l 薄層層析薄層層析：l根據(jù)氨基酸的凈電荷及根據(jù)氨基酸的凈電荷及r r基的極性：基的極性：l 離子交換層析離子交換層析：l陰離子交換樹脂-n(ch3)3oh，陽離子交換樹脂-so3hl根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點大?。焊鶕?jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點大?。簂 電泳電泳：l層析法層析法色層分析法（色譜）色層分析法（色譜）系統(tǒng)的組成固定相（靜相）系統(tǒng)的組成固定相（靜相）流動相（動相）流動相（動相）l分配定律分配定律當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的當(dāng)

11、溶質(zhì)在兩種給定的互不相互不相溶溶的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)數(shù). .此比值即分配系數(shù)（此比值即分配系數(shù)（kdkd）。）。l 固定相：固定相：纖維素上吸附的水纖維素上吸附的水流動相：展層溶劑，有機相流動相：展層溶劑，有機相層析時，混合層析時，混合aaaa在兩相中不斷分配，在兩相中不斷分配，疏水性強的疏水性強的aaaa在固定相水中溶解度在固定相水中溶解度較較小，與水的作用力也較小，與水的作用力也較小，小，隨展層劑的展層（移動）也移動較遠距離隨展層劑的展層（移動）也移動較遠距離（遷移率（

12、遷移率rfrf大）。大）。l極性強的極性強的rfrf值小，疏水性強的值小，疏水性強的rfrf大。大。l分離、鑒定分離、鑒定aaaa混合物的方法。混合物的方法。l將下列每組混合物分別用正丁醇將下列每組混合物分別用正丁醇- -醋酸醋酸- -水進行紙層析，指出每組的相對遷移率。水進行紙層析，指出每組的相對遷移率。l(1) val(1) val和和lys;lys;l(2) phe(2) phe和和ser;ser;l(3) leu(3) leu、alaala、serserl一個氨基酸的羧基一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的與另一個氨基酸的氨基之間失水形成氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為的酰胺鍵稱為肽鍵肽鍵，所

13、形成的化合物稱所形成的化合物稱為肽。為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基氨基酸殘基。ccnccnccnccncch2chch2ch2ch2coo-ohco2hch2conh2ohch3h3n+oooohhhhhhhhhservaltyraspglnch3n-端c-端肽鍵l在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基

14、酸順序。順序稱為氨基酸順序。l方向性：方向性：一條多肽鏈有兩個末端，自由 - -氨基，稱為氨基，稱為氨基端或氨基端或n-n-端；端；游離 - -羧基，稱為羧基端或羧基，稱為羧基端或c-c-端。端。l氨基酸的順序：氨基酸的順序：n-n-端端c-c-端端l如上述五肽可表示為：ser-val-tyr-asp-glun 絲氨絲氨酰酰纈氨纈氨酰酰酪氨酪氨酰酰天冬氨天冬氨酰酰谷氨谷氨酸酸肽單位肽單位主鏈：側(cè)鏈l熔點高。熔點高。這說明它和氨基酸一樣，是以這說明它和氨基酸一樣，是以偶極離子形式形成離子晶格而存在的。偶極離子形式形成離子晶格而存在的。2. 2. 具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點。具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點

15、。肽的酸堿肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端性質(zhì)主要來自游離末端 -nh-nh2 2和游離末和游離末端端 -cooh-cooh以及側(cè)鏈以及側(cè)鏈r r上可解離的基團。上可解離的基團。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點。末端末端 - -nhnh2 2, , - - coohcooh比游離氨基酸的酸堿度比游離氨基酸的酸堿度降低。降低。 3. 3. 具有旋光性。具有旋光性。這是由于肽中有不對稱這是由于肽中有不對稱c原子存原子存在。在。4.4.具雙縮脲顏色反應(yīng)（三肽以上）具雙縮脲顏色反應(yīng)（三肽以上）。n 雙縮脲（雙縮脲（h h2 2n-co-nh-co-nhn-co-nh-co-nh2 2

16、）是兩分子的尿素經(jīng)）是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子加熱失去一分子nhnh3 3而得到的產(chǎn)物。而得到的產(chǎn)物。 肽和蛋白特有，氨基酸無。肽和蛋白特有，氨基酸無。一般含有兩個或兩一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與個以上肽鍵的化合物與cuso4堿性溶液都能發(fā)生堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍紫色的復(fù)合物。雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍紫色的復(fù)合物。 用途：測定肽或蛋白質(zhì)含量。用途：測定肽或蛋白質(zhì)含量。l在生物體中，多肽最重要的存在形式是在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。作為蛋白質(zhì)的亞單位。l但是，也有許多分子量比較小的多肽以但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這

17、類多肽通常都具有特游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。殊的生理功能，常稱為活性肽。l如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；肽；谷胱甘肽谷胱甘肽；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。l部分肽中含有部分肽中含有d-d-氨基酸。氨基酸。l co-nh-ch-co-nh-ch2-coohchch2 2chch2 2chnhchnh2 2coohcoohchch2 2shsh 1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng) 2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng)作為輔酶參與氧化還原反應(yīng) 保護巰基酶或含保護巰基酶或含cys的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中 sh的還原性的還原性 防

18、止氧化物積累防止氧化物積累gsh+gsh-gssg根據(jù)：根據(jù)：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進行分離。蛋白（雜蛋白）的不同進行分離。 溶解度不同溶解度不同: 反相柱層析；反相柱層析；鹽析鹽析 分子量不同分子量不同: 透析；透析；凝膠過濾法凝膠過濾法 所帶電荷不同所帶電荷不同: 電泳；離子交換層析電泳；離子交換層析 特有的親和力：特有的親和力：親和層析親和層析l不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，界條件如鹽濃度，phph值，溫度等而變。值，溫度等而變。 鹽對蛋白質(zhì)濃度的影響 鹽溶鹽溶 sal

19、ting-in:加少量鹽使蛋白質(zhì)溶解度變大 鹽析鹽析 salting-out: 加大量鹽使蛋白質(zhì)由溶液中沉淀出來 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解度溶解度和和ph值及鹽濃度有關(guān)值及鹽濃度有關(guān)0.0010.0050.01 0.02 nacl(mol/l)pi4.8 5.0 5.2 5.4 5.6ph溶解度蛋白的穩(wěn)定因素：蛋白的穩(wěn)定因素：（1 1）帶電層）帶電層（2 2）水化層）水化層加入少量鹽：增加入少量鹽：增加帶電層，促進加帶電層，促進溶解。溶解。 -鹽溶鹽溶aggregate蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子表面的疏水性分子表面的疏水性區(qū)域區(qū)域，聚集許多水分子，聚集許多水分子，當(dāng)當(dāng)加入加入鹽時鹽時，這些水分子被抽出，暴露出來

20、的疏水，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性性區(qū)域區(qū)域互相互相結(jié)合結(jié)合，形成，形成沉淀沉淀。 鹽析鹽析 salting-out salting-out ：ionic strength溶解度+-+-+ammoniumsulfatesodiumsulfatea little salting-in effectnh4+so42-= hydrophobic硫酸銨分級沉淀硫酸銨分級沉淀l又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，通過具有通過具有分子篩性質(zhì)的凝膠分子篩性質(zhì)的凝膠而分離。而分離。l葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠g10-g200g10-g200l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2

21、b,4b,6b2b,4b,6bl聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠s100s100s600s600 凝膠顆粒小分子進入凝小分子進入凝膠分子內(nèi)，被膠分子內(nèi)，被滯留滯留大分子在凝大分子在凝膠顆粒間移膠顆粒間移動，較快流動，較快流出出溶劑流動方向溶劑流動方向按按分分子子量量從從大大到到小小依依次次流流出出l如兩分子間有如兩分子間有專一性親和力專一性親和力（特別的結(jié)（特別的結(jié)合和識別能力，具有合和識別能力，具有針對性針對性），以其中一種以其中一種作為作為“魚餌魚餌”，可把另外一種，可把另外一種“釣釣”出來。出來。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。 親和層析親和層析法的作用法的作用機理機

22、理：固相載體(1)(2)(3)absamplewashingelutionxb親和基團的配體xbaal在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。l蛋白質(zhì)有各自的等電點。在非等電點時，蛋蛋白質(zhì)有各自的等電點。在非等電點時，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。l蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（v v）取決于）取決于電場強度電場強度(e)(e)，所帶的，所帶的凈電荷凈電荷(q)(q)以及與以及與介質(zhì)介質(zhì)的摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)(f(f，即顆粒大小及形狀，即顆

23、粒大小及形狀) )。lsdssds（十二烷基（十二烷基磺酸鈉磺酸鈉）是一種陰離子型表）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基按大約基按大約1 1 2 2比例結(jié)合，使比例結(jié)合，使蛋白以一條無蛋白以一條無構(gòu)型的長條分子存在構(gòu)型的長條分子存在，且分子表面均勻結(jié)，且分子表面均勻結(jié)合一層負的合一層負的sdssds的電荷，蛋白質(zhì)分子的電荷，蛋白質(zhì)分子原有電原有電荷間的差別則可以忽略荷間的差別則可以忽略。l用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標準，則可以用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標準，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。l一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)概述一、蛋白

24、質(zhì)結(jié)構(gòu)概述l二、一級結(jié)構(gòu)測定方法二、一級結(jié)構(gòu)測定方法l三、同源蛋白質(zhì)及結(jié)構(gòu)進化三、同源蛋白質(zhì)及結(jié)構(gòu)進化l四、鐮刀型血紅蛋白分子病四、鐮刀型血紅蛋白分子病一級結(jié)構(gòu)一一、蛋白質(zhì)的、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次結(jié)構(gòu)層次四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)氨基酸 定義定義 1969年，國年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（學(xué)委員會（iupac） 規(guī)定：蛋白質(zhì)的規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)多肽連中多肽連中aa的排列的排列順序，包括二硫鍵順序，包括二硫鍵的位置。的位置。l前提：前提：樣品均一、樣品均一、純度純度97%97%以上、已知以上、已知分子量分子量f. sanger (1953, cambri

25、dge u) insulin 胰島素 (a, b chains)以傳統(tǒng)氨基酸定序法決定蛋白質(zhì)序列s ssss s+nh3nh3+-oocqgiveqcctsi c slylenycncoo-fsfvnqhlcghlvealylvcgergfytpkt b-chain a-chain 一級結(jié)構(gòu) (primary structure) 如何定出如何定出一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)的氨基酸順序蛋白質(zhì)的氨基酸順序(1)直接測定氨基酸測序：edman degradationf. sanger (cambridge u.) insulin 胰島素 (a, b chains) (2) 由 cdna 序列反推氨

26、基酸序列：l（1） 測定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，測定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，分析分析多肽鏈的多肽鏈的n末端和末端和c末端殘基末端殘基l（2）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵l（3） 測定每條多肽鏈的測定每條多肽鏈的aa組成組成l（4） 多肽鏈斷裂成小肽段多肽鏈斷裂成小肽段 （5） 測定各個肽段的測定各個肽段的aa順序順序 l（6） 確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序（7） 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置lsangersanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈夠與肽鏈n-n-端的游離氨

27、基作用，生成二硝基苯端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（衍生物（dnp-dnp-肽）。肽）。l酸解，得黃色酸解，得黃色dnp-dnp-氨基酸，用乙醚抽提分離。氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的不同的dnp-dnp-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。氨基酸可以用色譜法進行鑒定。（一）一）n n末端分析法末端分析法o2nfno2+ h2nchcrohnchcroo2nno2h+h2oo2nno2hnchcrooh+氨基酸dnfbn-端氨基酸dnp衍生物dnp-氨基酸是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應(yīng)是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應(yīng)用途用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)nh2末

28、端氨基酸末端氨基酸.dnsdns + + aa aa 多肽多肽 蛋白蛋白弱堿弱堿dns-dns-aa aa 多肽多肽 蛋白蛋白酸酸dns-aadns-aa + +游離游離aaaa（乙醚抽提，有熒光）（乙醚抽提，有熒光）l在可用在可用8mol/l8mol/l尿素或尿素或6mol/l6mol/l鹽酸胍（使鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開）存在下，蛋白變性，亞基分開）存在下，使使用過用過量的量的 - -巰基乙醇巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，使二硫鍵還原為巰基，然后用然后用烷基化試劑烷基化試劑保護生成的巰基，以保護生成的巰基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。(三三)氨基氨基酸組成的酸組成的分析：分析：

29、酸，堿解后酸，堿解后氨基酸分析氨基酸分析儀測定儀測定l1 1、 酶裂解法酶裂解法 胰蛋白酶胰蛋白酶蛋白水解酶（蛋白酶）：蛋白水解酶（蛋白酶）： 糜蛋白酶糜蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）（肽鏈內(nèi)切酶）嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶ltrypsin ：r r1 1= =賴氨賴氨酸酸lyslys和精氨酸和精氨酸argarg側(cè)鏈（專一性較強，側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）水解速度快）。nhchcor4nhchcor3nhchcor2nhchcor1水解位點水解位點1)1)胰蛋白酶胰蛋白酶專一性胰蛋白酶專一性胰蛋白酶斷裂斷裂phe,trp,tyrphe,trp,tyr等芳香族等芳香族aaaa的羧的羧基所

30、形成的肽鍵基所形成的肽鍵斷裂鍵鄰近的基團斷裂鍵鄰近的基團 堿性：裂解能力堿性：裂解能力 酸性：裂解能力酸性：裂解能力nhchcor4nhchcor3nhchcor2nhchcor1專一性糜蛋白酶專一性糜蛋白酶要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性aaaa如如phe-phephe-phe最適最適ph2ph2?？捎脕泶_定二硫鍵的位置?？捎脕泶_定二硫鍵的位置。nhchcor4nhchcor3nhchcor2nhchcor1l溴化氰水解法，它能選擇性地切割溴化氰水解法，它能選擇性地切割由由甲硫氨酸甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。的羧基所形成的肽鍵。l1 1、edmanedman化

31、學(xué)降解法化學(xué)降解法ledmanedman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種析法實際上也是一種n-n-端分析法端分析法。此法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈n-n-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。 用途用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)nh2末端氨末端氨基酸基酸.亦稱亦稱edmanedman反應(yīng)反應(yīng)弱堿弱堿 aaaapitc+ pitc+ 多肽多肽 蛋白蛋白 aaaaptcptc多肽多肽 蛋白蛋白無水甲酸無水甲酸或或hfhfpth-aa + pth-aa + 少一

32、個少一個aaaa的多肽或蛋白的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）（乙酸乙酯抽提）此反應(yīng)可循環(huán)進行此反應(yīng)可循環(huán)進行 進行進行n n輪反應(yīng)，可測出輪反應(yīng)，可測出n n個殘基順序個殘基順序一次：一次：60607070個殘基的肽段順序個殘基的肽段順序 l采用兩種或多種采用兩種或多種不同的斷裂方法不同的斷裂方法將多肽將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。并將其分離開來。l利用利用兩套或多套肽段兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，間的交錯重疊，拼湊拼湊出整條多肽鏈的氨出整條多肽鏈的氨基酸順序基酸順序。a a法水解得到四個小肽：法水解得到四個小肽： a1 ala-phe a1 ala-phe a2 gly-lys-asn-tyr a2 gly-lys-asn-tyr a3 arg-tyr a3 arg-tyr a4 his-val a4 his-valb b法水解得到三個小肽：法水解得到三個小肽： b1 ala-phe-gly-lys b1 ala-phe-gly-lys b2 asn-tyr-arg b2 asn-tyr-arg b3 tyr- his-val b3 tyr- his-val （一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化 1 1、同源蛋白質(zhì)