熒光染料選擇和數(shù)據(jù)分析

1、熒光染料的選擇及數(shù)據(jù)分析張新梅From BD Biosciences熒光染料的選擇什么是流式細(xì)胞儀什么是流式細(xì)胞儀 在流動的狀態(tài)中檢測顆粒性物質(zhì)各種物理及生物特征的一種儀器；Injector TipSheath fluid流式細(xì)胞儀原理 檢測信號 散射光信號 前向散射光信號(FSC) 側(cè)向散射光信號(SSC) 熒光信號流式細(xì)胞儀原理 散射光信號 當(dāng)顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號（SSC）。流式細(xì)胞儀原理 前向角散射光信號（FSC） FSC反映細(xì)胞大小，一般來說，細(xì)胞越大，前向角散射光信號越強； FS

2、C信號與細(xì)胞的折射率有關(guān)； 可用于表示細(xì)胞的凋亡； 區(qū)分死/活細(xì)胞時，可用于設(shè)門；流式細(xì)胞儀原理 側(cè)向角散射光信號（SSC） SSC信號主要反映了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號越強；流式細(xì)胞儀原理 FSC和SSC信號用于檢測并顯示細(xì)胞的物理學(xué)特征中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000流式細(xì)胞儀原理 熒光信號 當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀

3、原理流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀特點及檢測標(biāo)本 特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析； 可檢測的樣本種類多樣 (1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細(xì)胞 (2) New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液 熒光染料選擇的必要性 多色流式細(xì)胞儀的開發(fā)促進(jìn)了新的熒光染料的發(fā)現(xiàn)及抗體標(biāo)記物的發(fā)展 但抗體組合選擇非常復(fù)雜，如果隨意選擇熒光素搭配的抗體，不可能得到合適的結(jié)果。 在熒光染料的選擇上多一點考慮，就可避免重復(fù)實驗和錯誤的結(jié)果。流式細(xì)胞儀原理 熒光信號激發(fā)波長熒光素發(fā)射波長了解你的儀器基本要求-了解你的儀器 試劑的選擇從了解你的儀器的配置開始 激光（激發(fā)光源）：是否可以激發(fā)待選

4、的熒光素 檢測器：是否有足夠的檢測器來檢測所要用的熒光抗體組合 光路設(shè)計：影響特別染料的檢測效率 濾片：寬濾片提高檢測能力，但也會檢測到更多干擾光熒光染料 488nm激光激發(fā)的染料熒光染料 633nm激光激發(fā)的染料(APC)熒光染料 UV激光激發(fā)的染料熒光染料 常見熒光染料的發(fā)射波長了解熒光素的性質(zhì)了解熒光素的相對熒光強度 熒光素/單抗結(jié)合物的亮度 每種熒光素的相對熒光強度不同Cascade BlueAPC-Cy7FITCPE-Cy7Texas RedPEPE-Cy5APC02468100.280.951.01.42.84.66.29.2Relative BrightnessPositive

5、/ negativePositive / autofluorescenceCD8 fluorescence of CD3+ cellsData: Dr. Mario Roederer, Stanford Univ.了解熒光素的相對熒光強度 各種熒光素在BD LSRII流式細(xì)胞儀上的染色指數(shù)了解熒光素的相對熒光強度 每種熒光素的相對熒光強度不同 對一個既定的單抗來講，因為結(jié)合的熒光素不同，陽性/陰性細(xì)胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascade Blue110100110100Fluorescence Intensity

6、Relative Number of Cells110100110100Data: Dr. Mario Roederer; Stanford UniversityNeg ControlPositive (CD8-X)了解熒光素的相對熒光強度 每種熒光素的相對熒光強度不同 不同儀器的激光及濾片組合不同，熒光素的相對熒光強度也不同0.11101000.11101000.11101000.11101000.11101000.11101001000FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927了

7、解熒光素的相對熒光強度 F/P比值 抗體上熒光素分子的多少（F/P）也會影響相對的熒光強度。 FITC和PerCP的結(jié)合物通常一個抗體分子上結(jié)合幾個（2-9個，依抗體而定）熒光素分子。APC和PE與抗體結(jié)合一般是1：1。 復(fù)合染料PE-CY7和APC-CY7一般一個PE/APC分子結(jié)合多個CY7分子，一個PE/APC分子與抗體1：1結(jié)合 與之相反的是，復(fù)合染料PerCP-CY5.5，PerCP與CY5.5的比例是1：1 因為熒光素結(jié)合的化學(xué)因素的關(guān)系，IgM抗體一般與小分子的熒光素聯(lián)結(jié)，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。復(fù)合熒光染料-Tandem dyeIsolated dono

8、rDonor distance too greatDonor distance correct復(fù)合熒光染料 被激發(fā)的Donor熒光素將能量轉(zhuǎn)移給受者acceptor,需要滿足條件: Donor的發(fā)射波長與acceptor的激發(fā)波長有重疊 Donor和Acceptor分子之間的距離不能太遠(yuǎn)(100A)復(fù)合熒光染料Fluorescence Resonance Energy TransferIntensityWavelengthAbsorbanceDONORAbsorbanceFluorescenceFluorescenceACCEPTORMolecule 1Molecule 2熒光染料 多色分析熒

9、光素的選擇原則選擇熒光素需要考慮 抗原的密度 高表達(dá)的抗原可選擇幾乎所有的熒光素 低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC選擇熒光素需要考慮 自發(fā)熒光 每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光 所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強度在波長較長時迅速降低。 對自發(fā)熒光較強的細(xì)胞，選擇發(fā)射波長長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值。 對自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞，發(fā)射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善?？蛇x用FITC。選擇熒光素需考慮 非特異結(jié)合 許多熒光抗體可產(chǎn)生低水平的非特異結(jié)合，使陰性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光。 非特異結(jié)合由下列因素引起 單克隆抗體的同型抗體：一

10、些IgG同型抗體可能與一些細(xì)胞上的Fc 受體結(jié)合 所用的熒光素 羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標(biāo)的抗體及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在標(biāo)記某些亞群的細(xì)胞時有時會提高結(jié)合率。 對CY5來說，是因為該染料與低親和力FC受體的極低親和力相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。選擇熒光素需考慮 復(fù)合染料：小心信號衰退 復(fù)合染料因為光、固定劑或溫度升高會致信號衰退，使復(fù)合染料在上一級染料處發(fā)光。該種現(xiàn)象從一小部分亞群開始，導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群假陽性。 減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問題。 選擇染料時要考慮：復(fù)合染料的信號衰退會不會降低APC

11、或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配。 如果樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復(fù)合染料的信號衰退。BD：338036選擇熒光素需考慮 儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮”的熒光素，但對于特定的一款儀器，可以根據(jù)熒光的強弱列出可選的染料 亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區(qū)分背景和弱陽性信號的能力 影響背景的因素有檢測器的電子噪音、細(xì)胞自發(fā)熒光、來自其他檢測器的信號干擾，這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度（標(biāo)準(zhǔn)差） 靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)：DW，D指的是陽性峰與陰性峰的平均熒光強度的差；W是陰性峰的2SD。選擇熒光素需考慮 熒光信號之間的干擾，會增加信號檢測背景 熒光信

12、號強細(xì)胞群體的SD比熒光信號弱的細(xì)胞群體大。 多色分析時，一種熒光素（如FITC）的光會漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測器。漏入的光越多，需要補償?shù)脑蕉?，對分辨率的影響越大。尤其是弱表達(dá)的信號。選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾 IFN APC+CD8 APC-CY7+CD4 PE+IL-2 PE-CY7選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾 IFN APC+CD4 PE+IL-2 PE-CY7選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾選擇熒光素需考慮 多色熒光信號之間的干擾選擇熒光素需考慮 盡量減少熒光信號

13、之間的干擾 檢測的顏色越多，面臨的熒光信號之間的干擾越多 選擇試劑組合時盡可能降低熒光發(fā)射波長之間的重疊組合熒光素選擇 常見的6、8、10色熒光染料組合設(shè)立對照，以證實試劑組合有效 真實性對照（fidelity control）：單一的熒光抗體染色與試劑組合染色結(jié)果比較，以確保試劑組合中的其它試劑不影響結(jié)果。 減去一個熒光對照（Fluorescence-minus-one control,FMO）：除去一個熒光抗體，將其他所有試劑組合在一起。熒光素選擇原則 上述原則可能相互沖突，但要取得平衡以得到最佳結(jié)果。 原則1：選擇適合儀器配置的最“亮”的熒光染料 原則2：選擇光譜重疊最少的熒光素 原則3

14、：為最“暗”的抗體選擇最“亮”的熒光素，反之亦然 原則4：盡量避免“亮”細(xì)胞群的光漏入對靈敏度要求高的細(xì)胞群的檢測器中 原則5：采取步驟，避免復(fù)合染料信號衰退，考慮到可能對結(jié)果造成的影響。數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 檢測指標(biāo) 陽性百分率（%） 絕對計數(shù)（個/ L ） 平均熒光強度（MFI）數(shù)據(jù)分析 直方圖和點圖數(shù)據(jù)分析 設(shè)門 用來限定感興趣的細(xì)胞群； FSC vs SSC點圖是傳統(tǒng)上用于設(shè)門的圖； 分析淋巴細(xì)胞群時，CD45 vs SSC點圖設(shè)門更優(yōu)于FSC vs SSC點圖設(shè)門；數(shù)據(jù)分析 設(shè)門-確定要分析的目的細(xì)胞群數(shù)據(jù)分析 設(shè)門Side ScatterForward Scatter020040060

15、0800100002004006008001000R1數(shù)據(jù)分析 設(shè)門100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103104Anti-HLA-DR FITCGated on R1100101102103104CD25-PE數(shù)據(jù)分析對照樣本檢測樣本數(shù)據(jù)分析 直方圖統(tǒng)計表數(shù)據(jù)分析 檢測樣本數(shù)據(jù)分析對照樣本檢測樣本數(shù)據(jù)分析 點圖統(tǒng)計表數(shù)據(jù)分析 對照樣本數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性峰與陰性峰分界明顯 根據(jù)陰性對照設(shè)陽性和陰性界限 允許假陽性率一般少于2% 可記錄陽性百分比和平均熒光強度圖1數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 對照管直

16、方圖左側(cè)與檢測管重疊，但檢測管直方圖右側(cè)有肩峰 在兩曲線分離處設(shè)一界限； 從陽性曲線減去陰性曲線所致假陽性的百分比； 可記錄陽性百分比（近似值）和平均熒光強度，或弱陽性圖2數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 對照管與檢測管直方圖形狀相同，但檢測管直方圖右移 此結(jié)果不可設(shè)界限 可記錄平均熒光強度 排除非特異染色 調(diào)整抗體滴度確認(rèn)圖3數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 組合圖形 需要設(shè)界限，設(shè)在陽性管弱陽性返回基線處； 界限右側(cè)為強陽性，可報百分比； 弱陽性的分析見上述原則3圖4數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性細(xì)胞群與陰性細(xì)胞群分群明顯，且位于所在象限內(nèi) 以陰性對照設(shè)界線，允許其它三象限內(nèi)假陽性率小于2%； 可記錄陽性百分比，強陽

17、性或平均熒光強度圖5數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性群與陰性群區(qū)分明顯，但陽性群部分跨兩象限 單陽性部分使用圖5原則 雙陽性部分，根據(jù)細(xì)胞群走向，使用圖7/圖8原則圖6數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性群左側(cè)與對照平行，右側(cè)跨越兩象限 根據(jù)細(xì)胞群的分布趨勢，界限應(yīng)設(shè)在陰/陽性分離處； 陽性標(biāo)本的百分率減去假陽性； 可記錄陽性百分率（近似值），弱陽性或平均熒光強度圖7數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性群體與對照一致且部分重疊，但向陽性象限平移 與直方圖單色分析原則一致； 不可記錄陽性百分比；可記錄平均熒光強度圖8數(shù)據(jù)分析時遇到的問題 陽性群體與對照一致，但向450角方向平移 分析原則與圖7/圖8相同； 需要注意這種情況多是非特異結(jié)合圖9BD 生物