高效液相色譜補充內(nèi)容

1、第八章第八章 hplc的補充內(nèi)容的補充內(nèi)容液相色譜鍵合相的類型和色譜液相色譜鍵合相的類型和色譜性質(zhì)的主要影響因素性質(zhì)的主要影響因素高效液相色譜鍵合固定相的類型高效液相色譜鍵合固定相的類型主要有四類：主要有四類： 硅硅-氧氧-碳鍵型固定相碳鍵型固定相 硅硅-氮氮-碳鍵型固定相碳鍵型固定相 硅硅-氧氧-硅硅-碳鍵型固定相碳鍵型固定相 硅硅-碳鍵型固定相碳鍵型固定相siocsincsi o si csi c1、硅、硅-氧氧-碳鍵型固定相碳鍵型固定相制備方法之一：制備方法之一： 高壓、過量醇、高壓、過量醇、280度條件下與硅膠的硅度條件下與硅膠的硅羥基發(fā)生反應。羥基發(fā)生反應。制備方法之二：制備方法之二

2、： 亞硫酰氯處理硅膠獲得表面氯化硅膠，亞硫酰氯處理硅膠獲得表面氯化硅膠，再與過量醇進行醇解反應。再與過量醇進行醇解反應。缺點：容易被水解缺點：容易被水解2、硅、硅-氮氮-碳鍵型固定相碳鍵型固定相制備方法：制備方法： 先將硅膠表面氯化，再使伯胺與氯化硅先將硅膠表面氯化，再使伯胺與氯化硅膠反應。膠反應。對有機溶劑和對有機溶劑和ph=3-8的水介質(zhì)穩(wěn)定。的水介質(zhì)穩(wěn)定。3、硅、硅-氧氧-硅硅-碳鍵型固定相碳鍵型固定相制備方法：制備方法： 硅膠表面的硅羥基與有機氯硅烷或有機硅膠表面的硅羥基與有機氯硅烷或有機硅氧烷進行硅烷化反應硅氧烷進行硅烷化反應 。對有機溶劑和對有機溶劑和ph=2-8.5的水介質(zhì)是穩(wěn)定

3、的。的水介質(zhì)是穩(wěn)定的。4、硅、硅-碳鍵型固定相碳鍵型固定相制備方法：制備方法： 氯化硅膠和有機鋰或格氏試劑反應。氯化硅膠和有機鋰或格氏試劑反應。穩(wěn)定性優(yōu)于硅穩(wěn)定性優(yōu)于硅-氧氧-碳鍵型固定相，但生成的產(chǎn)碳鍵型固定相，但生成的產(chǎn)物覆蓋度較低。物覆蓋度較低。鍵合固定相的性質(zhì)鍵合固定相的性質(zhì)1、表面覆蓋度、表面覆蓋度完全水解的硅膠表面有完全水解的硅膠表面有8umol/m2硅羥基，由于位阻硅羥基，由于位阻的存在只有約一半的硅羥基可以進行反應。的存在只有約一半的硅羥基可以進行反應。好的填料要把殘余硅羥基掩蔽起來，利用掩蔽試劑好的填料要把殘余硅羥基掩蔽起來，利用掩蔽試劑與參與硅羥基反應，以消除其不良影響。與

4、參與硅羥基反應，以消除其不良影響。表面覆蓋度越高，色譜保留越強。表面覆蓋度越高，色譜保留越強。2、鍵合相鏈長的影響、鍵合相鏈長的影響對于反相色譜固定相對于反相色譜固定相 鍵合相鏈長越長保留越鍵合相鏈長越長保留越強強對于正相色譜固定相對于正相色譜固定相 鏈長的影響不明顯。鏈長的影響不明顯。3、鍵合固定相基質(zhì)性質(zhì)的影響、鍵合固定相基質(zhì)性質(zhì)的影響基質(zhì)的種類、表面積、化學性質(zhì)影響鍵合量、基質(zhì)的種類、表面積、化學性質(zhì)影響鍵合量、覆蓋度等，都會對鍵合相有一定的影響。覆蓋度等，都會對鍵合相有一定的影響。色譜柱色譜柱 hplc柱填料柱填料1、全多孔球形硅膠填料最為普遍、全多孔球形硅膠填料最為普遍硅膠基質(zhì)分為微

5、孔硅膠基質(zhì)分為微孔(小于小于2nm)，中孔，中孔(2-50nm)，大孔大孔(大于大于50nm)硅膠，多用中孔和大孔硅硅膠，多用中孔和大孔硅膠填料膠填料2、其它金屬氧化物基質(zhì)填料、其它金屬氧化物基質(zhì)填料tio2、zr o2、高分子聚合物等基質(zhì)的填料，、高分子聚合物等基質(zhì)的填料，能夠改善耐堿性和減弱硅羥基效應。能夠改善耐堿性和減弱硅羥基效應。 硅膠色譜柱填料的優(yōu)勢硅膠色譜柱填料的優(yōu)勢 硅膠有良好的機械強度硅膠有良好的機械強度 硅膠的孔結(jié)構(gòu)和比表面積容易控制硅膠的孔結(jié)構(gòu)和比表面積容易控制 硅膠填料具有比較好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)硅膠填料具有比較好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性定性 硅膠表面具有豐富的硅羥基，可以

6、進行化硅膠表面具有豐富的硅羥基，可以進行化學鍵合修飾學鍵合修飾 硅膠色譜柱填料的殘余硅羥基效應硅膠色譜柱填料的殘余硅羥基效應 堿性分析物嚴重拖尾，分離度低。堿性分析物嚴重拖尾，分離度低。加入堿性流動相加入堿性流動相添加劑抑制添加劑抑制 反相色譜柱填料保留性能隨溫度的變化反相色譜柱填料保留性能隨溫度的變化lnkh=rtosro+ln-lnk與與1/t在一定溫度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系在一定溫度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系 提高硅膠基質(zhì)反相色譜填料的色譜性能提高硅膠基質(zhì)反相色譜填料的色譜性能 提純硅膠，利用高純提純硅膠，利用高純(99.999%)硅膠色譜填硅膠色譜填料料 對硅膠進行充分封端（尾）對硅膠進行充分封端（尾

7、） 利用空間位阻掩蔽殘余硅羥基利用空間位阻掩蔽殘余硅羥基 鍵合相分子中嵌入極性基團（胺基、脲基、鍵合相分子中嵌入極性基團（胺基、脲基、酰胺基）酰胺基）1.1.雙齒鍵合相雙齒鍵合相高效液相色譜的流動相高效液相色譜的流動相 常用反相色譜流動相：甲醇常用反相色譜流動相：甲醇-水、乙腈水、乙腈-水水 常用正相色譜流動相：正己烷常用正相色譜流動相：正己烷-異丙醇、正異丙醇、正己烷己烷-乙醇、正己烷乙醇、正己烷-四氫呋喃四氫呋喃 常用離子色譜流動相：稀硝酸、稀氫氧化常用離子色譜流動相：稀硝酸、稀氫氧化鈉鈉 需要考慮流動相自身中紫外檢測波長下的需要考慮流動相自身中紫外檢測波長下的吸收強弱，溶劑紫外截止波長見

8、表吸收強弱，溶劑紫外截止波長見表9-4。高效液相色譜方法的選擇高效液相色譜方法的選擇 反相色譜可以分析多數(shù)樣品。反相色譜可以分析多數(shù)樣品。 極性極強的水溶性樣品在反相色譜中保留極性極強的水溶性樣品在反相色譜中保留很弱，難以有效分離，可以用正相色譜很弱，難以有效分離，可以用正相色譜（氨基柱、二醇基柱）有機溶劑（氨基柱、二醇基柱）有機溶劑-水流動相水流動相分離。分離。 弱酸、弱堿樣品抑制電離，反相分離。弱酸、弱堿樣品抑制電離，反相分離。 分析離子，首選離子色譜。分析離子，首選離子色譜。 生物分子的分離模式有反相、離子交換、生物分子的分離模式有反相、離子交換、體積排阻、疏水作用、親和色譜模式。體積排

9、阻、疏水作用、親和色譜模式。色譜條件的影響色譜條件的影響 色譜柱影響分離度，越長分離度越大，內(nèi)徑越色譜柱影響分離度，越長分離度越大，內(nèi)徑越小分離度越高。小分離度越高。 柱填料影響分離度，顆粒越小柱效越高，分離柱填料影響分離度，顆粒越小柱效越高，分離度越大，但柱壓越高（度越大，但柱壓越高（5m到到3m柱效提高柱效提高30%柱壓卻升高柱壓卻升高1倍）。倍）。 流動相影響保留，洗脫能力越強，分析時間越流動相影響保留，洗脫能力越強，分析時間越短，如：反相色譜流動相中有機組分增加保留短，如：反相色譜流動相中有機組分增加保留減弱。減弱。 流速越高，保留時間越短，但柱壓液越高。流速越高，保留時間越短，但柱壓

10、液越高。 柱溫越高，保留時間越短，分離度有所降低。柱溫越高，保留時間越短，分離度有所降低。 在等度洗脫難以獲得短的分析時間和滿意色譜在等度洗脫難以獲得短的分析時間和滿意色譜峰形時，可以進行梯度洗脫。峰形時，可以進行梯度洗脫。40度度169bar90度度94bar溫度的影響溫度的影響sb-c8 4.6x75mm 3.5um流通池流通池: 5mm, 2.5ul2060%b (10min.)2ml/min.sb-c8 4.6x150mm 5um流通池流通池: 10mm, 8ul2060%b (30min.)1ml/min.填料粒徑填料粒徑的影響的影響5um色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 50mm

11、3.5um色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 50mm填料粒徑填料粒徑的影響的影響-cn柱柱-苯基柱苯基柱c8柱柱填料種類填料種類的影響的影響液相色譜儀器的維護和維修液相色譜儀器的維護和維修 流動相需要用流動相需要用0.45m的微孔濾膜進行過濾的微孔濾膜進行過濾微孔濾膜微孔濾膜濾膜種類分為濾膜種類分為過水相過水相和和過有機相過有機相兩種兩種 過濾有機相流動相用有機（聚四氟乙烯）過濾有機相流動相用有機（聚四氟乙烯）濾膜。濾膜。 過濾水或鹽溶液作為流動相用水相濾膜。過濾水或鹽溶液作為流動相用水相濾膜。 鹽溶液作為流動相時，需要先將鹽溶解后鹽溶液作為流動相時，需要先將鹽溶解后再進行過濾，不能先過濾完

12、水再溶解鹽，再進行過濾，不能先過濾完水再溶解鹽，防止鹽中的固體不溶物堵塞流路。防止鹽中的固體不溶物堵塞流路。 注意：用于過濾無機流動相的濾膜溶于有注意：用于過濾無機流動相的濾膜溶于有機溶劑。機溶劑。 樣品需要用樣品需要用0.22m的微孔濾膜進行過濾的微孔濾膜進行過濾 樣品需要用樣品需要用0.22m的微孔濾膜進行過濾的微孔濾膜進行過濾針式樣品過濾器針式樣品過濾器 流動相中的固體顆粒和密封圈碎屑會堵塞過流動相中的固體顆粒和密封圈碎屑會堵塞過濾白頭，導致泵壓過高，需要及時更換。濾白頭，導致泵壓過高，需要及時更換。安捷倫液相色譜儀更換過濾白頭安捷倫液相色譜儀更換過濾白頭 密封圈老化、磨碎，導致漏液密封

13、圈老化、磨碎，導致漏液 檢測器的維護一檢測器的維護一氘燈（壽命氘燈（壽命2000h左右，價格左右，價格5000-6000元）元）不宜頻繁開關(guān)不宜頻繁開關(guān) 開開+關(guān)關(guān)=4小時小時需要用時才開，不使用時最好關(guān)閉需要用時才開，不使用時最好關(guān)閉沖柱（平衡或沖洗）時可以不接檢測器沖柱（平衡或沖洗）時可以不接檢測器 一是節(jié)省燈的使用，二是防止污染檢測器一是節(jié)省燈的使用，二是防止污染檢測器 多數(shù)儀器的檢測器電源開關(guān)在開機時就已打多數(shù)儀器的檢測器電源開關(guān)在開機時就已打開，但燈的開關(guān)并沒有開。開，但燈的開關(guān)并沒有開。 檢測器的維護二檢測器的維護二 不用時充滿有機流動相，如甲醇，乙腈等。不用時充滿有機流動相，如甲

14、醇，乙腈等。 長時間未用在開始使用時檢測器內(nèi)可能會長時間未用在開始使用時檢測器內(nèi)可能會有氣泡，現(xiàn)象是檢測信號呈鋸齒狀劇烈大有氣泡，現(xiàn)象是檢測信號呈鋸齒狀劇烈大幅度波動，解決方法是快速堵住和放開檢幅度波動，解決方法是快速堵住和放開檢測器的出液口，堵住時使其內(nèi)部壓力瞬間測器的出液口，堵住時使其內(nèi)部壓力瞬間增大放開后氣泡會被沖出。增大放開后氣泡會被沖出。檢測器（連有進出液兩管）被堵，先檢查檢測器（連有進出液兩管）被堵，先檢查是否是進液管被堵（多數(shù)情況下它被堵），是否是進液管被堵（多數(shù)情況下它被堵），用小流速倒沖，出液管連接泵。用小流速倒沖，出液管連接泵。 色譜柱的維護色譜柱的維護 色譜柱的保存參考購

15、買色譜柱的說明書，一色譜柱的保存參考購買色譜柱的說明書，一般反相色譜柱（般反相色譜柱（c18，c8等）用色譜純甲醇等）用色譜純甲醇或乙腈充滿后用堵頭密封兩頭冰箱內(nèi)保存?；蛞译娉錆M后用堵頭密封兩頭冰箱內(nèi)保存。 色譜柱在開始使用時（或使用完畢時），用色譜柱在開始使用時（或使用完畢時），用洗脫能力強的流動相沖洗，除去上次使用時洗脫能力強的流動相沖洗，除去上次使用時（或本次使用時）殘留在固定相上的樣品污（或本次使用時）殘留在固定相上的樣品污染物等。染物等。色譜柱沖洗過程中最好不接檢測器，防止污色譜柱沖洗過程中最好不接檢測器，防止污染了檢測器。染了檢測器。色譜柱使用多次后（出現(xiàn)柱壓高、柱效低等）色譜柱使

16、用多次后（出現(xiàn)柱壓高、柱效低等）參考說明書沖洗再生。參考說明書沖洗再生。 色譜柱的正確連接色譜柱的正確連接盡量減小縫隙，以減小死體積，減小色譜峰的展寬盡量減小縫隙，以減小死體積，減小色譜峰的展寬鍵合相穩(wěn)定性取決于鍵合技術(shù)鍵合相穩(wěn)定性取決于鍵合技術(shù)流動相中有機組分流動相中有機組分含量高時含量高時流動相中有機組分流動相中有機組分含量低時含量低時傳統(tǒng)的鍵合和封端（封尾）傳統(tǒng)的鍵合和封端（封尾）固定相鍵合固定相鍵合二甲基硅烷二甲基硅烷封端封端三甲基氯硅烷三甲基氯硅烷傳統(tǒng)的鍵合相分子容易水解而流失，造成色譜柱損傷，傳統(tǒng)的鍵合相分子容易水解而流失，造成色譜柱損傷，具體表現(xiàn)為保留減弱和殘余硅羥基效應。具體表

17、現(xiàn)為保留減弱和殘余硅羥基效應。側(cè)鏈位阻基團大的側(cè)鏈位阻基團大的鍵合相分子鍵合相分子主要依據(jù)色譜柱及填料參數(shù)主要依據(jù)色譜柱及填料參數(shù) 基質(zhì)類型基質(zhì)類型 粒徑大小粒徑大小 孔徑大小孔徑大小 碳含量高低碳含量高低 封尾類型封尾類型 色譜柱內(nèi)徑色譜柱內(nèi)徑 色譜柱長度色譜柱長度uplc和快速液相色譜和快速液相色譜 儀器方面代表性的是儀器方面代表性的是2004年年waters公司推出公司推出aquity 超高效液相色譜超高效液相色譜(uplc)，agilent公司公司 從從2006年相繼推出年相繼推出agilent 1200、1260、1290具有更高耐壓限和靈活性的高分離度快速液具有更高耐壓限和靈活性的

18、高分離度快速液相色譜系統(tǒng)（相色譜系統(tǒng)（rrlc）。）。 色譜柱方面在市場上出現(xiàn)了不同規(guī)格、不同色譜柱方面在市場上出現(xiàn)了不同規(guī)格、不同品牌的亞品牌的亞2m（1.7m）的色譜柱，及性能和）的色譜柱，及性能和工作范圍各不相同的超高效液相色譜產(chǎn)品。工作范圍各不相同的超高效液相色譜產(chǎn)品。使用亞使用亞2微米粒徑的色譜柱，用微米粒徑的色譜柱，用agilent 1200系列高分離度快系列高分離度快速液相色譜（速液相色譜（rrlc）系統(tǒng)進行快速和超快速分析）系統(tǒng)進行快速和超快速分析uplc 超高效液相色譜（超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography uplc）

19、是分離科學中的一個全新類）是分離科學中的一個全新類別，別，uplc借助于借助于hplc（高效液相色法）的理論及原（高效液相色法）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。超高效液相色譜是一個新興的領(lǐng)域，色譜峰容量。超高效液相色譜是一個新興的領(lǐng)域，作為世界第一個商品化作為世界第一個商品化uplc產(chǎn)品的產(chǎn)品的waters acquity uplctm 超高效液相色譜系統(tǒng)在超高效液相色譜系統(tǒng)在1996年問世，之后年問世，之后像安捷倫、島津等公司也

20、陸續(xù)開始生產(chǎn)超高效色譜像安捷倫、島津等公司也陸續(xù)開始生產(chǎn)超高效色譜儀。目前，超高效液相色譜儀已經(jīng)開始逐漸地投入儀。目前，超高效液相色譜儀已經(jīng)開始逐漸地投入液相實驗中。液相實驗中。agilent 1290 液相色譜系統(tǒng)液相色譜系統(tǒng) uplc的原理與的原理與hplc相同，所改變的地方主相同，所改變的地方主要有以下幾點：要有以下幾點： 小顆粒、高性能微粒固定相的出現(xiàn)。小顆粒、高性能微粒固定相的出現(xiàn)。hplc色色譜柱，例如常見的十八烷基硅膠鍵合柱，它的譜柱，例如常見的十八烷基硅膠鍵合柱，它的粒徑是粒徑是5um，而，而uplc的色譜柱，會達到的色譜柱，會達到3.5um，甚至，甚至1.7um，具有更高柱效

21、，更加利于物質(zhì)，具有更高柱效，更加利于物質(zhì)分離。分離。超高壓輸液泵的使用。超高壓輸液泵的使用。由于使用的色譜柱粒徑由于使用的色譜柱粒徑減小，使用時所產(chǎn)生的壓力也自然成倍增大。減小，使用時所產(chǎn)生的壓力也自然成倍增大。故液相色譜的輸液泵也相應改變成超高壓的輸故液相色譜的輸液泵也相應改變成超高壓的輸液泵。液泵。 高速采樣速度的靈敏檢測器。高速采樣速度的靈敏檢測器。 與傳統(tǒng)的與傳統(tǒng)的hplc相比，相比，uplc的速度、靈敏度的速度、靈敏度及分離度分別是及分離度分別是hplc的的9倍、倍、3倍及倍及1.7倍，倍，它縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量它縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量降低了分析成本。降低

22、了分析成本。uplcuplc比比hplchplc更為優(yōu)越，主要表現(xiàn)為更高效的更為優(yōu)越，主要表現(xiàn)為更高效的分離效率，即分析時間更短和分離度更大。分離效率，即分析時間更短和分離度更大。 制備色譜制備色譜是能夠獲得一定量（從幾毫克到千是能夠獲得一定量（從幾毫克到千克甚至噸級）純品的色譜分離方法?？松踔羾嵓墸┘兤返纳V分離方法。 制備色譜在制備色譜在醫(yī)藥工業(yè)醫(yī)藥工業(yè)（如外消旋體藥物分子（如外消旋體藥物分子的分離），的分離），生化技術(shù)生化技術(shù)（生物制品的純化和植（生物制品的純化和植物化學組分的純化），物化學組分的純化），精細化學品精細化學品的生產(chǎn)方的生產(chǎn)方面已成為越來越重要的制備分離手段。很多面已成為越

23、來越重要的制備分離手段。很多高純標樣只能用制備色譜獲得。高純標樣只能用制備色譜獲得。 為了滿足生物、中藥等復雜體系分離純化的為了滿足生物、中藥等復雜體系分離純化的任務，任務，制備色譜越發(fā)發(fā)揮出其作用。制備色譜越發(fā)發(fā)揮出其作用。 制備型液相色譜技術(shù)可以簡單的認為是分制備型液相色譜技術(shù)可以簡單的認為是分析型液相色譜技術(shù)的放大，一是輸液泵有析型液相色譜技術(shù)的放大，一是輸液泵有高的流量，二是所用的色譜柱有大的直徑高的流量，二是所用的色譜柱有大的直徑和柱填料有大的粒徑，三是大的進樣量，和柱填料有大的粒徑，三是大的進樣量，四是可以獲得純品。四是可以獲得純品。 分析型色譜注重的是分離度和分離速度，分析型色譜

24、注重的是分離度和分離速度，而制備色譜以獲得純品為唯一目的，在犧而制備色譜以獲得純品為唯一目的，在犧牲分離度和分析速度的前提下獲得純品。牲分離度和分析速度的前提下獲得純品。 分析色譜目的分析樣品，制備色譜以獲得純品為目的分析色譜目的分析樣品，制備色譜以獲得純品為目的 分析型色譜進樣量小夠檢即可，制備色譜進樣量盡可分析型色譜進樣量小夠檢即可，制備色譜進樣量盡可能大。能大。 分析色譜柱內(nèi)徑分析色譜柱內(nèi)徑1-5mm，制備色譜柱，制備色譜柱1-10cm甚至更大甚至更大 分析柱填料分析柱填料7m。 分析色譜流速分析色譜流速 10ml/min 分析色譜檢測器可以破壞樣品（如電化學檢測器），分析色譜檢測器可以破壞樣品（如電化學檢測器），制備色譜檢測器不能對樣品造成破壞。制備色譜檢測器不能對樣品造成破壞。 分析色譜流動相不需要易揮發(fā)，制備色譜流動相必須分析色譜流動相不需要易揮發(fā)，制