動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1、動物基因工程發(fā)展歷程古語有云龍生龍鳳生鳳，兔子生來會打洞。老祖先么通過長期生活經(jīng)驗總結(jié)出的俗諺往往與現(xiàn)代科學發(fā)現(xiàn)有著驚人的共同點。現(xiàn)代生物學認為生物的遺傳性狀由基因決定基因遺傳信息的基本單位。一般指位于染色體上編碼一個特定功能產(chǎn)物(如蛋白質(zhì)或RNA分子等)的一段核苷酸序列。 1969年 科學家成功分離出第一個基因1970年，從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶 1972年美國斯坦福大學P.Berg等構(gòu)建了第一個重組子1973年，S.N.Cohen構(gòu)建了第一個可以在細胞中表達的重組子1980年 科學家首次培育出世界第一個轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因小鼠1983年 科學家首次培育出世界第一個轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草

2、1988年 K.Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)加速了基因工程的發(fā)展具有里程碑意義1980年，Gordon首次報道用DNA顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠；1982年，美國科學家Palmiter首次將大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男坌栽酥校@得了轉(zhuǎn)基因小鼠，其個體比對照鼠增大一倍，稱之為“超級鼠”。轉(zhuǎn)基因動物自1980年代誕生以來，一直是生命科學研究和討論的熱點，隨著研究的不斷深入和實驗技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了更廣泛的應用，幾乎每年都有令人矚目的研究成果報道，有些轉(zhuǎn)基因成果已經(jīng)進入實用化和商業(yè)化的開發(fā)階段。動物基因工程動物基因工程動物轉(zhuǎn)基因主要是將外源基因轉(zhuǎn)移到胚胎細胞內(nèi)的染色體上，并進行整

3、合、表達和遺傳等。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一項高度綜合的技術(shù)，它涉及到DNA重組技術(shù)、胚胎工程技術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)等，因而這需要多學科的交叉和融合。同時也需要更為嚴苛的技術(shù)手段。動物基因工程簡介動物基因工程簡介目的基因的分離與克隆表達載體的構(gòu)建受體細胞的獲得基因?qū)胧荏w動物選擇轉(zhuǎn)基因胚胎移植轉(zhuǎn)基因整合表達的檢測轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的分離與純化遺傳性能研究以及性能選育組建轉(zhuǎn)基因動物新類群等動物基因工程流程物理方法點擊穿孔法顯微注射法裸露DNA直接注射法化學方法DEAE葡聚糖法磷酸鈣DNA共沉淀法脂質(zhì)體載體包埋法生物學方法病毒轉(zhuǎn)染法胚胎干細胞介導法精子載體法外源基因?qū)氲郊毎姆椒ㄍ庠椿驅(qū)氲郊毎姆椒ㄟ@些方法

4、各有自己的特點和優(yōu)勢，但在整個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中，其基本原理應該是相同。即將外源基因或體外重組基因經(jīng)體外增值和修飾轉(zhuǎn)移到動物受精卵或細胞內(nèi)，或?qū)⒉糠只蚣舫蛞种剖蛊湓趧游矬w內(nèi)得以整合和表達，以產(chǎn)生新遺傳特征或形狀的轉(zhuǎn)基因動物。并能將新的遺傳信息穩(wěn)定地進行世代遺傳獲得新的轉(zhuǎn)基因系或群體。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)基本原理轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)基本原理將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用,并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105115m ,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復。在此期

5、間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進入細胞。電穿孔的法的特點：1理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官2對導入的外源基因片段的大小沒有限制3電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作缺點：首先,外源基因表達持續(xù)的時間很短,雖然外源基因?qū)牒笞羁炜稍?15 小時有表達,但大多12 月后表達量降至很低。外源基因表達的時間主要由于所構(gòu)建的表達載體和基因?qū)氲陌屑毎M織器官不同而存在巨大差異。 電電擊穿孔法擊穿孔法電電擊穿孔法流程圖擊穿孔法流程圖顯微注射法是指在顯微鏡下操作的微量注射技術(shù)?？蓪⒓毎哪骋徊糠?如細胞核、細胞質(zhì)或細胞器)或外源物質(zhì)(

6、如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白質(zhì)等)通過玻璃毛細管拉成的細針，注射到細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)。是研究各種生物分子的作用、制作轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物等的重要技術(shù)。顯微注射法轉(zhuǎn)入基因長度可以達到數(shù)百kb，并能隨機地整合在受體細胞染色體DNA上，并且直接、相對容易控制應用范圍廣。但是有時會導致轉(zhuǎn)基因動物基因組的重排易位、缺失或者定點突變顯微注射法顯微注射法顯微注射法流程圖顯微注射法流程圖脂質(zhì)體載體包埋法脂質(zhì)體載體包埋法流程反轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細胞并整合于細胞染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過輔助細胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細胞導入子宮，可

7、發(fā)育成攜帶外源基因的子代動物。該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合于難以觀察到原核的禽類受精卵。由于病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩(wěn)定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達。病毒轉(zhuǎn)染法病毒轉(zhuǎn)染法流程圖轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也異常迅猛。據(jù)統(tǒng)計全球現(xiàn)有以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的公司超過40家已成為21世紀生物技術(shù)領域的支柱產(chǎn)業(yè)。1998年全球動物生物技術(shù)產(chǎn)品銷售額估計為62億美元。預計到2010年僅在農(nóng)業(yè)領域銷售額將達到110億美元，其中75億美元來自轉(zhuǎn)基因動物品種：而利用轉(zhuǎn)基因動物制作生物反應器生產(chǎn)藥物和功能蛋白的銷售額預計可達500億

8、美元?？梢?，雖然部分轉(zhuǎn)基因動物還處于研究與開發(fā)生產(chǎn)階段，但該項技術(shù)給我們生產(chǎn)和生活所帶來的益處已引起國際學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的高度關(guān)注。轉(zhuǎn)基因動物的應用發(fā)育生物學的研究 轉(zhuǎn)基因動物可用于觀察目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達、關(guān)閉及調(diào)控機制，了解調(diào)控順序(如增強子、啟動子)在組織特異性表達中的作用，此外，轉(zhuǎn)基因動物還可用于識別動物發(fā)育過程中的基因(包括內(nèi)源基因)及其活動，也可測出與動物發(fā)育相關(guān)的未知基因的表達特性。遺傳學研究 利用自然突變或人為修飾的基因作為外源基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物，研究導人的異?；虻谋硇托梢粤私饣蛘緲?gòu)和功能的蓋系，還可用于基因組印跡分析、遺傳缺陷的矯正等生命現(xiàn)象的基礎

9、理論生命現(xiàn)象的基礎理論研究研究心血管疾病的研究各種調(diào)節(jié)心血管功能的因子如轉(zhuǎn)脂蛋白、轉(zhuǎn)纖維蛋白溶酶原等都可通過轉(zhuǎn)基因動物來了解其生理功能及作用，建立如動脈粥樣硬化、突發(fā)性高血壓、靜脈閉塞等轉(zhuǎn)基因動物模型。 腫瘤學研究 腫瘤基因的發(fā)現(xiàn)是近10年來腫瘤學研究的重大突破，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺癌基因等100多個腫瘤基因。實驗證明，各種脊椎動物都攜帶腫瘤基因，在通常情況下并不引起細胞癌變，只有在某些條件下才能被激活使癌細胞增生而導致癌變。建立帶有腫瘤基因的轉(zhuǎn)基因動物可了解哪些組織對腫瘤基因轉(zhuǎn)化活性敏感、腫瘤形成與其基因的關(guān)系、腫瘤基因生長分化影響等等。 遺傳病研究 通常是將功能正常的外源基因?qū)雱游矬w的靶細胞內(nèi)，

10、用來彌補缺陷的基因，改變患病細胞的遺傳物質(zhì)，進行基因治療。相反的將顯性疾病基因或一個、甚至多個外源基因人為地導入動物體內(nèi)，就可制備遺傳性疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，研究和治療人類遺傳性疾病。免疫學研究 巴賓耐特(Babinet)發(fā)現(xiàn)雖然轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生HBsAg，但在6個月內(nèi)沒有任何病理變化，表現(xiàn)為一種持續(xù)的帶病毒狀態(tài)。這些結(jié)果表明：乙型肝炎患者的肝細胞損傷不是由HBV的HBsAg表達直接引起，而是通過對肝細胞膜上的病毒抗原發(fā)生免疫反應造成的。因此，可以用轉(zhuǎn)基因小鼠模型來研究免疫耐受與肝細胞損傷的關(guān)系以探討發(fā)病機制。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠還為研究第l和第類主要組織相容性抗原的功能提供了新手段。醫(yī)學研究醫(yī)學研

11、究經(jīng)典的遺傳育種方法要在同種或親源關(guān)系很近的種經(jīng)典的遺傳育種方法要在同種或親源關(guān)系很近的種間才能進行，并且受到變異或突變的限制，而使用間才能進行，并且受到變異或突變的限制，而使用重組重組DNADNA技術(shù)在短時間內(nèi)就可使技術(shù)在短時間內(nèi)就可使親緣關(guān)系很遠的種親緣關(guān)系很遠的種間遺傳信息進行交換和重組間遺傳信息進行交換和重組。另外由于轉(zhuǎn)基因動物。另外由于轉(zhuǎn)基因動物可以穩(wěn)定地整合外源基因，并在合適的組織表達，可以穩(wěn)定地整合外源基因，并在合適的組織表達，還能將這種性狀遺傳給后代，這樣就可以生產(chǎn)出生還能將這種性狀遺傳給后代，這樣就可以生產(chǎn)出生長快、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶更多而耗料極少的轉(zhuǎn)基因長快、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶

12、更多而耗料極少的轉(zhuǎn)基因家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。改良和培育動物新品種改良和培育動物新品種一般把目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液、腹水等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應器,動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。為醫(yī)藥、食品及畜牧業(yè)的發(fā)展開辟了極為廣闊的天地。動物生物反應器動物乳腺動物乳腺生物反應器簡介生物反應器簡介動物乳腺生物反應器利用哺乳動物乳腺特異性

13、表達的啟動子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物, 指導外源基因在乳腺中表達, 并從轉(zhuǎn)基因動物的乳液中獲取重組蛋白。動物乳腺有廣泛表達外源基因的能力，可以生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和多肽，從小分子肽到大分子蛋白質(zhì)，從分泌型蛋白到內(nèi)膜蛋白、多聚蛋白、二價抗體等，顯示動物乳腺是一種很好的生物反應器，在生產(chǎn)高附加值蛋白質(zhì)方面有廣泛用途。用動物乳腺生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品還有產(chǎn)品活性高、產(chǎn)量高、產(chǎn)品易于純化、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。據(jù)專家估計，用細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)1藥物蛋白，成本8005000美元，而乳腺生物反應器方法只需0.020.50美元；傳統(tǒng)藥物的研制生產(chǎn)周期是1520年，乳腺生物反應器方法一般為5年。生物反應器技術(shù)已成為當今生物工程技術(shù)

14、的制高點和市場競爭熱點。我國是從1984年開始轉(zhuǎn)基因動物研究的，并于同年獲得了含人-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用顯微注射法，1985年和1986年又分別獲得了含人生長激素（MT-hGH）基因的轉(zhuǎn)基因泥鰍和小鼠。1987年獲得含有大腸桿菌galk和gpt基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后又相繼獲得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、含促紅細胞生成素（EPO）和HbgAg 2種基因乳腺特異性表達的轉(zhuǎn)基因山羊、含人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊、含人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛、乳腺表達“生物鋼”蛋白基因的轉(zhuǎn)基因老鼠30。2003年3月，中國農(nóng)業(yè)大學取得我國首例轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛成功31。同年10月，第二頭轉(zhuǎn)有人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的體細胞克隆牛出生，這標志著我國已經(jīng)成熟掌握了轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛的技術(shù)體系，在該領域的研究躋身世界前列（人民網(wǎng)）。2004年，利用精子載體法制備乳腺生物反應器的轉(zhuǎn)基因兔模型獲得成功，該項目由中國軍事醫(yī)學科學院主持，獲得F代轉(zhuǎn)基因兔184只，通過鑒定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因陽性后代89只，陽性率48.4%動物基因工程研究現(xiàn)狀盡管轉(zhuǎn)基因動物發(fā)展迅速，對人們的健康生活起了巨大作用，但是目前仍存在一些問題。首先，轉(zhuǎn)基因技術(shù)支撐體系不夠完善主要表現(xiàn)為目前轉(zhuǎn)基因動物的成功率不高，體細胞克隆等技術(shù)環(huán)節(jié)還有待完善。并且有些技術(shù)會對動物健康產(chǎn)生危害，這就需要研究者在轉(zhuǎn)基因技術(shù)