qPCR引物設(shè)計(jì)ppt課件

1、Novobio Proprietary & Confidential1qPCRqPCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)絕對定量（Absolute Quantification） 相對定量（Relative Quantification） microRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷貝數(shù)變異（CNV Research） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）Novobio Proprietary & Confidential21. Primer blast 1. Primer blast 引物設(shè)計(jì)及特異性檢驗(yàn)工具引物設(shè)計(jì)及特異性檢驗(yàn)工具整合了Primer3軟

2、件，再加上Blast進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證Novobio Proprietary & Confidential3Primer blastPrimer blast輸入基因號或輸入基因號或FASTA序列序列定義引物的范圍定義引物的范圍（舉例：針對長3k的基因，若擴(kuò)增1000-1050的范圍，則可填入Forward 1 to 1000, Reverse 1050 to 3000若有已知引物，可填入，以測試特異性針對sybr qPCR：產(chǎn)物大小填100 to 200（最大不超過300）可用默認(rèn)值（最佳Tm為60度，波動范圍57 to 63度，兩條引物Tm差值小于3度）Novobio Propri

3、etary & Confidential4Primer blastPrimer blast引物是否需跨不同引物是否需跨不同Exon選擇1 - 無所謂選擇2 - 必須跨不同Exon選擇3 - 可以不跨Exon勾選時(shí)表示兩條引物之間必須包括一個(gè)以上的勾選時(shí)表示兩條引物之間必須包括一個(gè)以上的Intron（當(dāng)以（當(dāng)以基因組基因組DNA為模板時(shí)）為模板時(shí)）Novobio Proprietary & Confidential5基因組基因組DNADNA干擾的判別干擾的判別No gDNA detected in the RT control (flat green/red line)Detec

4、tion of contaminating gDNA in theRT control (dark blue line)no gDNA removal+RTRTNo templatecontrol+RTRTNovobio Proprietary & Confidential6防止基因組防止基因組DNADNA污染的兩種引物設(shè)計(jì)方法污染的兩種引物設(shè)計(jì)方法APrimer spans an intron/exon boundaryBPrimer flank an intronNovobio Proprietary & Confidential7Primer blastPrimer bl

5、ast勾選時(shí)表示要檢測引物勾選時(shí)表示要檢測引物的特異性的特異性填入要比較的物種填入要比較的物種（可輸入通用名，如human/mouse/rat/rabbit當(dāng)需要同時(shí)比較多物種時(shí)，點(diǎn)擊”Add more organisms”勾選勾選”show results in a new window”-點(diǎn)擊點(diǎn)擊”Get Primers”Novobio Proprietary & Confidential8Primer blast Primer blast 結(jié)果結(jié)果基因的基因的Exon位置位置引物的位置引物的位置Novobio Proprietary & Confidential9Prim

6、er blast Primer blast 結(jié)果結(jié)果引物的基本情況引物和非相關(guān)產(chǎn)物的配對情況Novobio Proprietary & Confidential102. qP2. qPCRCR引物的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫引物的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). PrimerBank contains over 306,800 primers co

7、vering most known human and mouse genes.Novobio Proprietary & Confidential11PrimerBank PrimerBank 結(jié)果結(jié)果有些引物是附帶了驗(yàn)證結(jié)果的Novobio Proprietary & Confidential12miRNART primerStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRcDNAForward primerReverseprimerFQTaqMan probe成分：成分：莖環(huán)莖環(huán)RT引物引物正向引物正向引物反向引物（通用）反向引物（通用）1.

8、TaqMan探針（可選）探針（可選）3. miRNA qPCR的引物設(shè)計(jì)（莖環(huán)引物法）的引物設(shè)計(jì)（莖環(huán)引物法）Novobio Proprietary & Confidential13miRNA miRNA qPCRqPCR引物數(shù)據(jù)庫引物數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫來源：MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，Novobio Proprietary & Confidential14以以has-miR-16為例：為例：成熟miRNA序列（末端8個(gè)堿基用下劃線標(biāo)注）has-miR-16：UAGCAGCACG

9、UAAAUAUUGGCG1）RT引物（注：5端為通用的Stem和 Loop序列，末位8個(gè)堿基和miRNA末端序列互補(bǔ)）CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA2）Forward primer（注：下劃線標(biāo)記的部分和免去末端6個(gè)堿基的靶miRNA序列同源）ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA3）Reverse primer（注：序列固定）TGGTGTCGTGGAGTCG4）Taqman MGB探針（下劃線標(biāo)記部分與miRNA末端序列互補(bǔ)）(6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB)miRNA qPC

10、R的引物設(shè)計(jì)的引物設(shè)計(jì)Novobio Proprietary & Confidential15內(nèi)參U6（Human/Mouse/Rat）的引物CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT注：U6不屬于miRNAmiRNA qPCR的的內(nèi)參引物內(nèi)參引物Novobio Proprietary & Confidential16附錄附錄1 1 - - 染料法引物的設(shè)計(jì)原則染料法引物的設(shè)計(jì)原則（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（3）、檢測mRNA時(shí)，

11、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯 子；（4）、引物之間的TM相差避免超過2；（5）、典型的引物18到24個(gè)核苷長；（6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同（7）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性Novobio Proprietary & Confidential17附錄附錄2 - Taqman2 - Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、檢測mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)

12、外顯 子；（3）、引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右（確保探針先于引物與模板結(jié)合，這就要求探針的TM值高于引物10左右）；（4）、探針的5端應(yīng)避免使用鳥嘌呤G，因?yàn)?G會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用； （5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會降低反應(yīng) 效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； （6）、引物之間的TM相差避免超過2；（7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp；（8）、PCR產(chǎn)物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；（9）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其

13、特異性 Novobio Proprietary & Confidential18附錄附錄3 - Taqman3 - Taqman探針合成時(shí)注意事項(xiàng)探針合成時(shí)注意事項(xiàng)（1）引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長度吻合，再看看非特異 性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證；（3）確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣?，這樣安排能避免很多以 外的損失；（4）探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度， 25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上

14、檢測， 95，2min; 95，20s，60，20s，40個(gè)cycles；看熒光本底和 熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應(yīng)，熒 光強(qiáng)度不會變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。Novobio Proprietary & Confidential19附錄附錄4 - 4 - 逆轉(zhuǎn)錄方法的選擇逆轉(zhuǎn)錄方法的選擇逆轉(zhuǎn)錄方式逆轉(zhuǎn)錄方式 1-step (one tube) RT-PCR1-step (one tube) RT-PCR（病毒檢測） cDNA合成與PCR同管進(jìn)行 快速、更少污染 對于稍微有些降解的RNA檢測靈敏度更高 2-step R

15、T-PCR2-step RT-PCR（基因水平變化） 一次cDNA可用于多次PCR20附錄附錄5 5 - - RTRT引物的選用引物的選用GSP：常用于一步法RTPCR。但是引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果。在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。Oligo dT引物:真核生物的mRNA適用，建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；不適用于降解的RNA隨機(jī)引物：適合各種RNA的RT，可用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。Novobio Proprietary & Confidential212-step Real-time RT-PCR2-step Real-time RT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄引物選擇的逆轉(zhuǎn)錄引物選擇Amplicon 3-end: 2 kb(N)9 Oligo-dT+(N)9Oligo-dTAmplicon 3-end: 6 kbOligo-dT Oligo-dT+(N)9(N)9(A)n使用Oligo-dT作為引物：擴(kuò)增離3端遠(yuǎn)近不同的片段，離3越遠(yuǎn)擴(kuò)增越差必須使用Oligo-dT+(N)9Novobio Proprietary & Confidential22附