血清學(xué)試驗蒼松書屋

1、血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷1深層分析血清學(xué)試驗的概念血清學(xué)試驗的概念u由于抗體主要存在于由于抗體主要存在于血清中，所以將體外血清中，所以將體外發(fā)生的抗原抗體結(jié)合發(fā)生的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)試驗?；蜓鍖W(xué)試驗。 2深層分析血清學(xué)試驗的特點血清學(xué)試驗的特點u特異性和交叉性 u敏感性 u可逆性 u反應(yīng)的二階段性 u最適比例與帶現(xiàn)象 u用已知測未知 u 3深層分析特異性和交叉性特異性和交叉性u特異性特異性 抗原只能與相應(yīng)抗體結(jié)合，而不能與其他抗體相結(jié)合。 u交叉性交叉性 兩種不同的抗原之間含有共同的抗原決定簇，則發(fā)生交叉反應(yīng) 。4深層分析反應(yīng)的二階段性反應(yīng)的二階段性 第二階

2、段第二階段 抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)可見反應(yīng)階段。此階段反應(yīng)慢、需數(shù)分鐘、數(shù)十分鐘或更久。第一階段第一階段 抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，此階段反應(yīng)快、僅數(shù)秒至數(shù)分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。5深層分析敏感性敏感性u抗原抗體的結(jié)合還具有高度敏感性的特點，不僅可檢測定性，還可以定量檢測微量、極微量的抗原或抗體。6深層分析最適比例與帶現(xiàn)象最適比例與帶現(xiàn)象v抗原與抗體結(jié)合，其比例適當(dāng)時才可出現(xiàn)肉眼可見反應(yīng)。抗體抗原與抗體結(jié)合，其比例適當(dāng)時才可出現(xiàn)肉眼可見反應(yīng)?？贵w除除igm是是5價，價，siga 4價外，一般抗體都含有兩個結(jié)合位點（二價外，一般抗體都含有兩個結(jié)合位點（二價）；抗原則根據(jù)分子大小，有價）；抗原則根據(jù)

3、分子大小，有1050個不等的結(jié)合點。當(dāng)抗個不等的結(jié)合點。當(dāng)抗原抗體比例適當(dāng)時，兩者結(jié)合后，尚有未飽和的結(jié)合點，可以原抗體比例適當(dāng)時，兩者結(jié)合后，尚有未飽和的結(jié)合點，可以繼續(xù)與游離的抗體、抗原或與抗原抗體結(jié)合物的未飽和點相聯(lián)繼續(xù)與游離的抗體、抗原或與抗原抗體結(jié)合物的未飽和點相聯(lián)結(jié)，逐漸形成愈來愈大的復(fù)合物，出現(xiàn)了肉眼可見反應(yīng)。比例結(jié)，逐漸形成愈來愈大的復(fù)合物，出現(xiàn)了肉眼可見反應(yīng)。比例最適合，出現(xiàn)反應(yīng)最快，反應(yīng)產(chǎn)物愈多。最適合，出現(xiàn)反應(yīng)最快，反應(yīng)產(chǎn)物愈多。v如果抗原或抗體過多，抗體和抗原結(jié)合點的聚合一開始時即達(dá)如果抗原或抗體過多，抗體和抗原結(jié)合點的聚合一開始時即達(dá)到飽和，形成小的復(fù)合物則不能繼續(xù)與

4、相鄰抗原、抗體結(jié)合，到飽和，形成小的復(fù)合物則不能繼續(xù)與相鄰抗原、抗體結(jié)合，不出現(xiàn)可見反應(yīng)，謂之帶現(xiàn)象。不出現(xiàn)可見反應(yīng)，謂之帶現(xiàn)象。7深層分析前帶前帶 后后帶帶 8深層分析可逆性可逆性u抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，結(jié)合條件為040、ph49。如溫度超過60或ph降到3以下，或加入解離劑時，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，并且分離后抗原或抗體的性質(zhì)仍不改變。9深層分析用已知測未知用已知測未知u所有的血清學(xué)試驗都是用已知抗原測定未知抗體，或用已知抗體測定未知抗原。10深層分析影響血清學(xué)試驗的因素影響血清學(xué)試驗的因素u電解質(zhì)：電解質(zhì)：血清學(xué)反應(yīng)須在適當(dāng)濃度的電解質(zhì)參與下，血清學(xué)反

5、應(yīng)須在適當(dāng)濃度的電解質(zhì)參與下，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。才出現(xiàn)可見反應(yīng)。0.9%0.9%氯化鈉溶液。氯化鈉溶液。8-10% 8-10% u溫度：溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，抗原、抗體分在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，抗原、抗體分子運(yùn)動速度越快，這可以增加其碰撞的機(jī)會，加速抗子運(yùn)動速度越快，這可以增加其碰撞的機(jī)會，加速抗原抗體結(jié)合和反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)原抗體結(jié)合和反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn) 。11深層分析u酸堿度：酸堿度：血清學(xué)反應(yīng)通常用血清學(xué)反應(yīng)通常用ph6ph68 8，過酸或過堿都可使，過酸或過堿都可使復(fù)合物解離，復(fù)合物解離，phph值在等電點時，可引起非特異凝集。值在等電點時，可引起非特異凝集。 u振蕩：振蕩：適當(dāng)

6、的機(jī)械振蕩能增加分子或顆粒間的相互碰撞，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振蕩能增加分子或顆粒間的相互碰撞，加速抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，但強(qiáng)烈的振蕩可使抗原抗體加速抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，但強(qiáng)烈的振蕩可使抗原抗體復(fù)合物解離。復(fù)合物解離。 u雜質(zhì)和異物：雜質(zhì)和異物：試驗介質(zhì)中如有與反應(yīng)無關(guān)的雜質(zhì)、異物試驗介質(zhì)中如有與反應(yīng)無關(guān)的雜質(zhì)、異物存在時，會抑制反應(yīng)的進(jìn)行或引起非特異性反應(yīng)。存在時，會抑制反應(yīng)的進(jìn)行或引起非特異性反應(yīng)。 u 12深層分析血清學(xué)試驗的類型血清學(xué)試驗的類型u凝集試驗?zāi)囼?u沉淀試驗沉淀試驗 u補(bǔ)體結(jié)合試驗補(bǔ)體結(jié)合試驗 u中和試驗中和試驗 u免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)13深層分析凝集試驗的概念凝集試驗的概念u細(xì)

7、菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，或吸附細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，或吸附在紅細(xì)胞、乳膠等顆粒性載體表面的在紅細(xì)胞、乳膠等顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，復(fù)合物互相凝聚形成肉眼可見的凝集復(fù)合物互相凝聚形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗。團(tuán)塊，稱為凝集試驗。 14深層分析凝集試驗的類型凝集試驗的類型u直接凝集試驗直接凝集試驗 u間接凝集試驗間接凝集試驗 15深層分析直接凝集試驗直接凝集試驗概念：概念：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)的顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)的參與下，直接結(jié)合，凝集成團(tuán)的現(xiàn)象

8、，參與下，直接結(jié)合，凝集成團(tuán)的現(xiàn)象，稱直接凝集試驗。稱直接凝集試驗。 類型：類型：按其操作方法可分為按其操作方法可分為玻片法玻片法和和試管試管法。法。 16深層分析1 1玻片凝集試驗玻片凝集試驗u方法：方法：在玻璃板或瓷在玻璃板或瓷片上進(jìn)行。片上進(jìn)行。 u特點：特點：簡單、快速。簡單、快速。 u用途：用途：定性試驗，如定性試驗，如細(xì)菌鑒定、血型鑒定細(xì)菌鑒定、血型鑒定等。等。17深層分析2 2試管凝集試驗試管凝集試驗u方法：方法：在試管中進(jìn)行。在試管中進(jìn)行。 u特點：特點：準(zhǔn)確、耗時。準(zhǔn)確、耗時。 u用途：用途：定量試驗，如定量試驗，如診斷布氏桿菌病，測診斷布氏桿菌病，測定抗體的凝集價。定抗體的

9、凝集價。18深層分析19深層分析v結(jié)果判定v結(jié)果用“+”表示反應(yīng)強(qiáng)度。v+：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底。v+ ：液體透明，菌體基本被凝集沉于管底。v+ ：液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀。v+ ：液體透明度不明顯或不透明，有不明顯的沉淀或有沉淀的痕跡。v ：液體不透明，呈均勻混濁，管底無凝集。有時有少量菌體集中于管底中心，呈臍狀，但振搖時，立即散開呈均勻渾濁。v以出現(xiàn)“+”的最高血清稀釋倍數(shù)即為該份血清的效價，又叫凝集價。大動物（馬，牛，駱駝等）以凝集價1：100以上判為陽性，1：50的凝集價判為可疑。中小動物（豬，羊，狗等）以凝集價1：50以上判為陽性，1：25的凝集價判為

10、可疑。v如對照管不符合要求時，試管須廢棄重做。 20深層分析間接凝集試驗間接凝集試驗概念：概念： f將可溶性抗原或抗體將可溶性抗原或抗體與載與載體連接后，再與相應(yīng)的抗體連接后，再與相應(yīng)的抗體或抗原作用，所出現(xiàn)的體或抗原作用，所出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)為間接凝特異性凝集反應(yīng)為間接凝集試驗。集試驗。類型：類型： f 間接血凝試驗間接血凝試驗 f 乳膠凝集試驗乳膠凝集試驗 f 協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗21深層分析致敏紅細(xì)胞致敏紅細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞抗原抗原紅細(xì)胞紅細(xì)胞抗原抗原致敏紅細(xì)胞致敏紅細(xì)胞被檢抗體被檢抗體紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集間接血凝試驗原理間接血凝試驗原理22深層分析23深層分析v凝集強(qiáng)度判定v （1

11、00%紅細(xì)胞凝集）：邊緣不整齊，有紅色顆粒布滿孔底）v （50%紅細(xì)胞凝集）v型孔：孔底可見紅色顆粒，中央有少量紅細(xì)胞沉淀v 紅細(xì)胞呈點狀沉于孔底，無紅色顆粒。v能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，為該病毒的紅細(xì)胞凝集滴度，即一個凝集單位。如表18-1-1的病毒血凝滴度為27，即將病毒原液作27倍稀釋，其中含一個血凝單位的病毒。v由于病毒血凝抑制試驗中需要的病毒液應(yīng)含4個血凝單位，因此，需要對原病毒液進(jìn)行25倍稀釋。24深層分析以能使100%紅細(xì)胞不發(fā)生凝集的血清最大稀釋倍數(shù)為該血清的hi滴度，以2的指數(shù)表示。 25深層分析沉淀試驗的概念沉淀試驗的概念u可溶性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電

12、解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗。 26深層分析沉淀試驗的類型沉淀試驗的類型u環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗 u瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗 u免疫電泳免疫電泳27深層分析環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗u方法：方法：在小口徑試管中進(jìn)行。在小口徑試管中進(jìn)行。 u原理：原理：試管內(nèi)，下層沉淀素與試管內(nèi)，下層沉淀素與上層沉淀原在液界面應(yīng)形成白上層沉淀原在液界面應(yīng)形成白色沉淀環(huán)。色沉淀環(huán)。 u用途：用途：主要用于抗原的定性試主要用于抗原的定性試驗，如炭疽桿菌的驗，如炭疽桿菌的ascoliascoli試驗試驗、鏈球菌的血清型鑒定、血跡鑒鏈球菌的血清型鑒定、血跡鑒定等。定等。白色沉淀

13、環(huán)白色沉淀環(huán)沉淀原沉淀原沉淀素沉淀素28深層分析瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗u原理原理 1%1%瓊脂凝膠孔徑為瓊脂凝膠孔徑為85nm85nm，能使許多可溶性抗，能使許多可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散。當(dāng)抗原與抗體在凝原與抗體在凝膠中擴(kuò)散。當(dāng)抗原與抗體在凝膠中的一定位置上相遇時，則兩者結(jié)合形成膠中的一定位置上相遇時，則兩者結(jié)合形成沉淀線。沉淀線。29深層分析瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗類型瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗類型u單向單擴(kuò)散單向單擴(kuò)散 u單向雙擴(kuò)散單向雙擴(kuò)散 u雙向單擴(kuò)散雙向單擴(kuò)散 u雙向雙擴(kuò)散雙向雙擴(kuò)散 f方法方法 f用途用途 30深層分析雙向雙擴(kuò)散方法雙向雙擴(kuò)散方法u此法系采用1%瓊脂倒于平皿或玻片上，制

14、成凝膠板，可按需要打孔。將抗原、抗體分別滴入孔內(nèi)，放置濕盒中，在37c濕箱中24-72h后觀察。31深層分析雙向雙擴(kuò)散用途雙向雙擴(kuò)散用途u u 抗原的比較和鑒定：抗原的比較和鑒定：在抗原在抗原與抗體孔間形成沉淀帶。每與抗體孔間形成沉淀帶。每一種抗原成分出現(xiàn)一條沉淀一種抗原成分出現(xiàn)一條沉淀帶。如兩個相鄰孔之間抗原帶。如兩個相鄰孔之間抗原相同，則沉淀帶融合，如相同，則沉淀帶融合，如1 1、2 2；抗原不同，則互相交叉，；抗原不同，則互相交叉，如如3 3；部分相同則部分融合，；部分相同則部分融合，另外不同部分則交叉，如另外不同部分則交叉，如4 4。32深層分析免疫電泳免疫電泳u免疫電泳技術(shù)是把凝膠擴(kuò)

15、散試驗與電泳技術(shù)相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。即將瓊脂擴(kuò)散置于直流電場中進(jìn)行，讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其擴(kuò)散方向，在比例合適處形成可見的沉淀帶。 33深層分析補(bǔ)體結(jié)合試驗補(bǔ)體結(jié)合試驗 u試驗系統(tǒng)、試驗系統(tǒng)、原理原理和結(jié)果判定和結(jié)果判定 反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)已知抗原已知抗原（抗體）（抗體）待檢血清待檢血清（抗原）（抗原）補(bǔ)體補(bǔ)體綿羊紅綿羊紅細(xì)胞細(xì)胞溶血素溶血素如溶血則如溶血則為陰性為陰性如不溶血如不溶血則為陽性則為陽性指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)反應(yīng)結(jié)果的判定反應(yīng)結(jié)果的判定34深層分析35深層分析中和試驗中和試驗u概念：概念：根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗

16、。疫學(xué)試驗。 u原理：原理：病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易感動物、雞胚或細(xì)胞活性。感動物、雞胚或細(xì)胞活性。 u舉例舉例 ibdvibdv 9 911d11d雞胚雞胚 242448h 48h 雞胚死亡雞胚死亡 ibdvibdv + +抗血清抗血清 9 911d11d雞胚雞胚 雞胚不死亡雞胚不死亡 36深層分析免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)u抗原與抗體結(jié)合了，但復(fù)合物小，不能通過凝集或沉淀用肉眼觀察到。 u將抗體或抗原聯(lián)結(jié)在一個特定的易于檢測的物質(zhì)上，通過檢測特定物質(zhì)的存在，間接反映抗原抗體發(fā)生了結(jié)合。 37深層分析熒光抗體標(biāo)記技術(shù)熒光抗體標(biāo)記技術(shù)u原理：將

17、熒光色素標(biāo)記在抗體或抗原上，與相應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合后，用熒光顯微鏡觀察所標(biāo)記的熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法 。 u熒光素：熒光色素是能產(chǎn)生明顯熒光，又能作為染料使用的有機(jī)化合物。最常用的是異硫氰酸熒光素(fitc)。38深層分析熒光抗體染色熒光抗體染色f染色方法染色方法 抗補(bǔ)體法抗補(bǔ)體法 直接法直接法 間接法間接法抗抗原原抗體抗體熒光素?zé)晒馑乜箍贵w抗抗體抗抗補(bǔ)補(bǔ)體體抗抗體體39深層分析酶標(biāo)抗體技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù)u原理：將酶分子標(biāo)記在抗體或抗原分子上，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性及酶的高催化活性進(jìn)行檢測。 u用于標(biāo)記的酶：辣根過氧化物酶（hrp）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。 u 40

18、深層分析f免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù) f酶聯(lián)免疫吸附試驗 f斑點-酶聯(lián)免疫吸附試驗酶標(biāo)抗體技術(shù)分類酶標(biāo)抗體技術(shù)分類41深層分析酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗u試驗方法試驗方法 f間接法：用于測定抗體 f夾心法：用于測定大分子抗原 f雙夾心法：用于測定大分子抗原u原理原理 f通過化學(xué)方法將酶與抗體結(jié)合通過化學(xué)方法將酶與抗體結(jié)合起來。酶標(biāo)記后的抗體仍然保起來。酶標(biāo)記后的抗體仍然保持著能與相應(yīng)抗原結(jié)合的免疫持著能與相應(yīng)抗原結(jié)合的免疫學(xué)活性及酶的催化活性。酶標(biāo)學(xué)活性及酶的催化活性。酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合后，形成酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合后，形成酶標(biāo)抗體抗體-抗原復(fù)合物。復(fù)合物上的抗原復(fù)合物。復(fù)合物上的酶，在遇到相應(yīng)的底物時，催酶，在遇到相應(yīng)的底物時，催化底物分解，使底物中