HIV實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理

1、艾滋病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理行政支持 行政部門和領(lǐng)導(dǎo) HIV實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和發(fā)展 資金 人員 監(jiān)督支持人員培訓(xùn) 每年市疾控中心組織 上崗證環(huán)境條件：實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及其建筑、設(shè)施、設(shè)備必須符合全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作管理辦法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清學(xué)檢測(cè)在滿足實(shí)驗(yàn)室管理要求和保證生物安全的條件下，可以與HIV檢測(cè)共享空間和設(shè)備，應(yīng)避免交叉污染。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理樣品采集、運(yùn)送和處理送檢單收樣登記表HIV抗體復(fù)檢檢測(cè)單檢測(cè)方法和試劑的選擇試劑的出入庫(kù)及使用記錄供應(yīng)品、耗材（試劑）質(zhì)量驗(yàn)收記錄表實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn)儀器設(shè)備溫度記錄表儀器設(shè)備使用、檢定、維修、維護(hù)記錄本強(qiáng)檢計(jì)量器具周期檢定（自

2、校）計(jì)劃表文件和文件管理實(shí)驗(yàn)原始記錄表結(jié)果報(bào)告樣品登記和保存（唯一編碼）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理文件和文件管理標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運(yùn)輸；（2）檢測(cè)方法和步驟；（3）試劑使用和保存；（4）儀器的使用維護(hù)和校準(zhǔn)；（5）質(zhì)量控制要求及程序；（6）結(jié)果解釋與報(bào)告；（7）保密程序；（8）實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存；（9）不確定樣品追蹤和處理；（10）實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)及實(shí)驗(yàn)室的清理和消毒。文件存檔（保存10年以上）ELISA實(shí)驗(yàn)影響因素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素樣品溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性 可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)

3、胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使過氧化氫釋放出原生態(tài)氧，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽(yáng)性。輕微溶血沒事，嚴(yán)重溶血的標(biāo)本易產(chǎn)生假陽(yáng)性。受細(xì)菌污染的標(biāo)本因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素樣品塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 ，最好使用真空采血管或抗凝管。（抗凝劑會(huì)略有影響，但影響不大）標(biāo)本凝固不全 在工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清

4、，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素按說明書要求，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)取出試劑穩(wěn)定加樣加樣的量要準(zhǔn)確 移液器要經(jīng)常清洗 定期校準(zhǔn)加樣位置 孔壁1/3以下 不可濺出 不可產(chǎn)生氣泡必須使用一次性TIP頭，嚴(yán)格控制，防止交叉污染先加稀釋液的，加樣時(shí)可用移液器孔內(nèi)吹打混勻移液器的校準(zhǔn)可以送檢，可以自校，自校要有SOP有記錄酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素孵育時(shí)間 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作 容易控制溫度 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作 用校準(zhǔn)的溫度計(jì)監(jiān)測(cè)溫度，特

5、別是冬天，避免因溫度過低導(dǎo)致假陰性。封板 孵育時(shí)不貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁,難以清洗徹底。恒溫孵育設(shè)備的使用與維護(hù)校準(zhǔn)的溫度計(jì)監(jiān)測(cè)ELISA反應(yīng)溫度水浴的尤其要注意水位酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素洗板洗液的量 試劑不同，板孔的大小差異會(huì)導(dǎo)致洗液的量的不同，為保證洗的徹底，原則是量足夠多且不會(huì)逸出。浸泡時(shí)間 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，一般30-60秒，不設(shè)置浸泡時(shí)間或時(shí)間太短，洗脫不徹底的話會(huì)產(chǎn)生“花板”。 保持針孔通暢不阻塞 血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)的針孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”。應(yīng)做好洗板機(jī)的維護(hù)工作。

6、拍板酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素洗板機(jī)的檢定、使用及維護(hù)檢定：注液量和殘留量（每孔5微升）使用：設(shè)置程序（注液量、洗板次數(shù)、浸泡時(shí)間、洗板位置）維護(hù)：消毒液沖洗，蒸餾水沖洗酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素顯色加底物時(shí)，應(yīng)懸空加液，避免觸及板孔內(nèi)壁造成交叉污染。應(yīng)先加底物緩沖液A再加TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物B，加入順序不能顛倒。已顯淺藍(lán)色的TMB底物堅(jiān)決不能用。個(gè)別試劑要求A、B液先混合后再加。溫度與時(shí)間的控制。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素終止及讀板讀板前應(yīng)保證板孔底部干凈，無(wú)異物，無(wú)水氣，無(wú)氣泡，特別是在冬天。酶標(biāo)儀不應(yīng)放置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下,操作時(shí)室溫宜在1

7、5-30,使用前先預(yù)熱15-30 min,測(cè)讀板結(jié)果會(huì)更穩(wěn)定。酶標(biāo)儀必須檢定 標(biāo)準(zhǔn)板廠家酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的影響因素Cutoff值計(jì)算及結(jié)果判定注意事項(xiàng)嚴(yán)格按照試劑說明書要求的數(shù)量做陰、陽(yáng)性對(duì)照根據(jù)陰、陽(yáng)性對(duì)照的值判定實(shí)驗(yàn)是否成立嚴(yán)格按照試劑說明書要求計(jì)算Cutoff值注意空白原始記錄標(biāo)明空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、外部對(duì)照以及待檢樣品的位置試劑盒廠家、測(cè)定方法、批號(hào)、效期操作人員和復(fù)核人員姓名（簽名）檢測(cè)日期其他（環(huán)境、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)依據(jù)等）注意樣本的溯源性廢棄物處理消毒液（含氯消毒劑、75%乙醇、2%戊二醛）干烤消毒（140 2-3h）高壓蒸汽消毒（121 15-20min）高壓

8、滅菌器檢定：溫度和壓力高壓滅菌器使用效果監(jiān)測(cè)：化學(xué)指示卡，生物監(jiān)測(cè)（嗜熱脂肪桿菌芽孢）ELISA實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制ELISA的質(zhì)量控制試劑盒內(nèi)部對(duì)照：試劑盒內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控品即為試劑盒內(nèi)提供的陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清。試劑盒內(nèi)部對(duì)照用于判斷每次實(shí)驗(yàn)的有效性，但不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用。每一次檢測(cè)臨床樣品時(shí)，必須有試劑盒內(nèi)部對(duì)照，而且只能在同批號(hào)的試劑盒中使用。內(nèi)部對(duì)照結(jié)果無(wú)效，必須重新試驗(yàn)。室內(nèi)質(zhì)控品：為非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測(cè)的重復(fù)性而設(shè)置的，包括強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設(shè)置一個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的23倍為宜。外部質(zhì)控品的作用是，判斷該批臨床樣品檢測(cè)的

9、有效性，因此，每次實(shí)驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無(wú)效，必須重新試驗(yàn)。室內(nèi)質(zhì)控品的來源商品化的室內(nèi)質(zhì)控品 實(shí)驗(yàn)室自己制備（比較經(jīng)濟(jì)）混合試劑盒內(nèi)部對(duì)照血清，通過做實(shí)驗(yàn)確定陰陽(yáng)性對(duì)照的混合比例，混合，分裝保存?；旌螲IV抗體陽(yáng)性人血清、HIV抗體陰性人血清，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，0.2m生物濾膜過濾除菌，5630分鐘加熱滅活處理。通過做實(shí)驗(yàn)確定陰陽(yáng)性血清的混合比例，混合，分裝保存。高濃度商品化室內(nèi)質(zhì)控品再稀釋室內(nèi)質(zhì)控品的保存一次購(gòu)買或制備量應(yīng)該足夠本實(shí)驗(yàn)室至少一年使用等量分裝，可以按單次使用、單日使用、最長(zhǎng)一周使用的量確定每個(gè)分裝的量不同室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)做好標(biāo)記，最好使用不同顏色的標(biāo)簽，以防止

10、混用應(yīng)存放于-70以下，如無(wú)條件則存放于非自動(dòng)除霜的-20冰箱一旦融解后應(yīng)存放于2-8，一周后必須棄去，不能重新凍存使用樣品的采集、處理、保存、運(yùn)送及接收樣品的采集和處理建議用K2EDTA K3EDTA 枸櫞酸鈉的抗凝管采血,不用肝素抗凝管采血血漿 1500-3000r/min離心15min，吸上層血漿血清 室溫自然放置1-2h，待血液凝固、血塊收縮后1500-3000r/min離心15min，吸上層血清樣品的保存建議用1.5ml-2.0ml的螺口凍存管或離心管保存.抗體及抗原檢測(cè)的血清或血漿樣品 應(yīng)存放于-20以下,一周內(nèi)檢測(cè)的樣品2-8 樣品的保存盡量多分裝保存樣品的運(yùn)送要求樣本量1ml樣

11、本的質(zhì)量 無(wú)嚴(yán)重溶血，無(wú)微生物污染，無(wú)血脂過多，無(wú)嚴(yán)重黃疸等管子的質(zhì)量 防漏三層包裝 單管包裝重新采樣樣品的運(yùn)送要求樣品和送檢單分開專人送樣 專門運(yùn)送箱（實(shí)驗(yàn)室人員號(hào)碼和聯(lián)系方式）市疾控確證實(shí)驗(yàn)室血清or血漿2-8度運(yùn)送或者凍存狀態(tài)下直接運(yùn)送送樣單要求送樣單打印檢測(cè)者/審核者手簽，單位或?qū)嶒?yàn)室蓋章信息完整(真實(shí)姓名、送檢人群、身份證號(hào)碼、聯(lián)系電話、現(xiàn)地址及戶籍地址等)詳細(xì)的樣本來源(監(jiān)管場(chǎng)所的具體到哪個(gè)監(jiān)管場(chǎng)所)充分利用備注欄規(guī)范性(試劑、cutoff值等)樣品的接收打開包裝，注意生物安全，個(gè)人防護(hù)核對(duì)樣品與送檢單，檢查樣品管有無(wú)破損和溢漏記錄 一般記錄，另外記錄有無(wú)嚴(yán)重溶血，微生物污染、血脂

12、過多及黃疸等情況開蓋 生物安全柜中，個(gè)人防護(hù)HIV抗體檢測(cè)HIV抗體檢測(cè)的目的HIV抗體檢測(cè)可用于診斷診斷、血液篩查血液篩查、監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)等。以診斷為目的的檢測(cè)是為了確定個(gè)體HIV感染狀況，包括臨床檢測(cè)、自愿咨詢檢測(cè)、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測(cè)為目的的檢測(cè)是為了解不同人群HIV感染率及變化趨勢(shì)，包括各類高危人群、重點(diǎn)人群和一般人群。HIV抗體檢測(cè)的要點(diǎn)根據(jù)目的選擇檢測(cè)方法及檢測(cè)策略。嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。篩查試驗(yàn)陽(yáng)性，須做確證試驗(yàn)。篩查試驗(yàn)陰性，不應(yīng)做確證試驗(yàn)。HIV抗體篩查試驗(yàn)流程樣 品初篩試驗(yàn)初

13、篩試驗(yàn)篩查試劑陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)復(fù)檢試驗(yàn)原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑一陰一陽(yáng)均陰性反應(yīng)均陽(yáng)性反應(yīng)確證試驗(yàn)報(bào)告陰性篩查試劑國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)ELISA試劑批批檢合格，在有效期內(nèi)推薦使用經(jīng)臨床質(zhì)量評(píng)估敏感性和特異性高的試劑初篩試劑 高敏感性復(fù)檢試劑 高特異性篩查樣品血清血漿全血DBS/DPS唾液尿液篩查方法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）第三代試劑 雙抗原夾心法 單純檢測(cè)HIV抗體第四代試劑 抗原抗體聯(lián)合診斷試劑 同時(shí)檢測(cè)P24抗原和抗HIV-1/2抗體 縮短窗口期 注意復(fù)檢試劑的選擇注意復(fù)檢試劑的選擇化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)快速檢測(cè)（RT）篩

14、查試驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告HIV抗體篩查試驗(yàn)陰性反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體陰性”HIV抗體篩查試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體待復(fù)檢”HIV抗體復(fù)檢試驗(yàn)兩次檢測(cè)均陰性報(bào)告為“HIV抗體陰性”HIV抗體復(fù)檢試驗(yàn)兩次檢測(cè)均陽(yáng)性或一陰一陽(yáng)報(bào)告為“HIV抗體待確證”HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒嬰兒會(huì)由于被動(dòng)攜帶母親的抗體而連續(xù)幾個(gè)月至十幾個(gè)月出現(xiàn)抗體陽(yáng)性。嬰兒滿12個(gè)月進(jìn)行第一次HIV抗體檢測(cè)。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進(jìn)行抗體檢測(cè)，兩種篩查試劑檢測(cè)結(jié)果均為陰性反應(yīng)，報(bào)告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)（一種為陰性反應(yīng)一種為陽(yáng)性反應(yīng)或兩種均陽(yáng)性反應(yīng)），不能排除感染，應(yīng)繼續(xù)追蹤隨訪，至兒童滿18個(gè)月

15、時(shí)再次進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)。HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒嬰兒滿18個(gè)月時(shí)應(yīng)再次進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進(jìn)行抗體檢測(cè)。兩種篩查試劑的檢測(cè)結(jié)果均為陰性反應(yīng)，報(bào)告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)（一種為陰性反應(yīng)一種為陽(yáng)性反應(yīng)或兩種均呈陽(yáng)性反應(yīng)），進(jìn)一步進(jìn)行確證試驗(yàn)，根據(jù)確證試驗(yàn)的結(jié)果判斷是否感染HIV。做好檢測(cè)后咨詢。HIV抗體檢測(cè)結(jié)果解釋HIV抗體陰性未發(fā)生感染（排除“窗口期”）HIV抗體不確定非特異性的反應(yīng)感染早期感染晚期HIV抗體陽(yáng)性發(fā)生感染（排除疫苗使用）HIV抗體快速檢測(cè)HIV抗體快速檢測(cè)快速檢測(cè)，是艾滋病實(shí)驗(yàn)室多了一種檢測(cè)方法快速檢測(cè)，是為了更多更快的

16、發(fā)現(xiàn)感染者快速檢測(cè)，不是為了取代實(shí)驗(yàn)室，但不能因?yàn)橛辛藢?shí)驗(yàn)室而放棄使用快速檢測(cè)快速檢測(cè)手段能否成為新型檢測(cè)-咨詢模式，或基于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的有效的檢測(cè)方法-取決于檢測(cè)的質(zhì)量HIV抗體快速檢測(cè)方法PA明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種:同時(shí)檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測(cè)HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗(yàn)必須有陰性和陽(yáng)性質(zhì)控。HIV抗體快速檢測(cè)方法免疫滲濾試驗(yàn)免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)。以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點(diǎn)狀

17、固定在膜上，加待檢樣品。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。HIV抗體快速檢測(cè)方法免疫層析試驗(yàn)免疫層析試驗(yàn)：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色。結(jié)果判讀嚴(yán)格參照試劑說明書反應(yīng)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶為陽(yáng)性。質(zhì)控區(qū)有條帶，反應(yīng)區(qū)無(wú)條帶為陰性。質(zhì)控區(qū)無(wú)條帶則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。HIV抗體快速檢測(cè)的外部質(zhì)控 外部對(duì)照質(zhì)控品，可采用商用質(zhì)控品或自制質(zhì)控品。質(zhì)控品應(yīng)包含抗體陽(yáng)性樣品和陰性樣品。自制質(zhì)控品可使用本室保留的陽(yáng)性樣品。不能使用酶聯(lián)試驗(yàn)的外部

18、質(zhì)控品。下列情況需做質(zhì)量控制：更換試劑批號(hào)；更換檢測(cè)人員；更換包裝；每個(gè)檢測(cè)日；更換試劑廠家。 建議：每個(gè)檢測(cè)日檢測(cè)一次陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品；如果日檢測(cè)量大于50份樣品，至少應(yīng)作2次質(zhì)控。快速檢測(cè)的注意事項(xiàng)不提倡個(gè)人在家中檢測(cè)。應(yīng)由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員操作，注意生物安全操作，避免職業(yè)暴露發(fā)生。在質(zhì)控窗口內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)質(zhì)控帶，如實(shí)驗(yàn)完成后未呈現(xiàn)質(zhì)控帶，說明試劑盒內(nèi)質(zhì)控?zé)o效，該試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，樣品須重檢。出現(xiàn)以下問題，提示存在質(zhì)量隱患，應(yīng)引起重視：運(yùn)輸包裝、內(nèi)盒或試劑盒的物理?yè)p傷；在單包裝內(nèi)存在混雜物質(zhì)；標(biāo)簽出現(xiàn)錯(cuò)誤、缺失或字跡模糊 （特別是產(chǎn)品名稱或出產(chǎn)廠家名稱，批號(hào)和貨號(hào)，失效期或/和生產(chǎn)日期）；缺失目錄；泄

19、漏或污染；不適宜的存放條件；保護(hù)包裝紙破損或污染?？焖贆z測(cè)的注意事項(xiàng)環(huán)境溫度,尤其是在冬天血清/血漿 全血 稀釋緩沖液樣本的量反應(yīng)的時(shí)間生物安全 廢棄物處理做好實(shí)驗(yàn)的原始記錄不同廠家的快檢試劑操作要求廠家廠家樣品要求樣品要求血量血量(ul)(ul)樣品稀釋樣品稀釋是否加緩是否加緩沖液沖液最小反應(yīng)最小反應(yīng)時(shí)間時(shí)間( (分鐘分鐘) )最大反應(yīng)最大反應(yīng)時(shí)間時(shí)間( (分鐘分鐘) )試劑儲(chǔ)存要試劑儲(chǔ)存要求求明膠顆粒法明膠顆粒法(PA)(PA)血清血清/ /血漿血漿25251:321:32N N120120/ /2-102-10DETERMINEDETERMINE血清血清/ /血漿血漿/ /全血全血5050N N用全血時(shí)用全血時(shí)加加1 1滴滴151560602-302-30SDSD血清血清1010N NN N5 520201-301-30杭州艾康杭州艾康血清血清/ /血漿血漿/ /全血全血25