生物制藥 第二章 生物制藥技術(shù)通論 第三節(jié) 細(xì)胞工程制藥技術(shù)

1、生物制藥 第二章 生物制藥技術(shù)通論 第三節(jié) 細(xì)胞工程制藥技術(shù) 其次章 生物制藥技術(shù)通論第一節(jié) 生物藥物的制備技術(shù) 其次節(jié) 發(fā)酵工程制藥技術(shù) 第三節(jié) 細(xì)胞工程制藥技術(shù) 第四節(jié) 酶工程制藥技術(shù) 第五節(jié) 基因工程制藥技術(shù) 第三節(jié) 細(xì)胞工程制藥技術(shù)一、細(xì)胞工程的概述 二、動物細(xì)胞工程及特點 三、植物細(xì)胞工程及特點 四、細(xì)胞固定化技術(shù)與細(xì)胞反應(yīng)器 Engineering) 一、細(xì)胞工程概述(Cell Engineering) 細(xì)胞工程概述(1、細(xì)胞工程的定義 、細(xì)胞工程也稱細(xì)胞技術(shù) 細(xì)胞工程 也稱細(xì)胞技術(shù)， 是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物 也稱 細(xì)胞技術(shù)， 發(fā)育生物學(xué)、 學(xué) 、 發(fā)育生物學(xué) 、 遺傳學(xué)和分子生物學(xué)

2、的理論與 方法，根據(jù)人們的需要和設(shè)計，通過細(xì)胞融合 細(xì)胞融合、 方法 ， 根據(jù)人們的需要和設(shè)計 ， 通過 細(xì)胞融合 、 核質(zhì)移植、染色體移植以及組織和細(xì)胞培育等方 以及組織和細(xì)胞培育 核質(zhì)移植 、 染色體移植 以及 組織和細(xì)胞培育 等方 法 ， 快速繁殖和培育出人們所需要的新物種的生 物工程技術(shù)。 物工程技術(shù)。 發(fā)酵技術(shù)也屬于細(xì)胞工程的范疇。 發(fā)酵技術(shù)也屬于細(xì)胞工程的范疇。 也屬于細(xì)胞工程的范疇 2、細(xì)胞工程的內(nèi)容(細(xì)胞操作技術(shù)) 、細(xì)胞工程的內(nèi)容(細(xì)胞操作技術(shù))細(xì)胞融合 細(xì)胞核移植 細(xì)胞器移植 染色體添加 外源染色體導(dǎo)入 胚胎移植 細(xì)胞培育 組織培育 細(xì)胞融合在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下， 在自發(fā)或人

3、工誘導(dǎo)下，兩個 不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì) 體融合形成一個雜種細(xì)胞。 體融合形成一個雜種細(xì)胞。 基本過程 1 細(xì)胞融合形成異核體 細(xì)胞融合形成異核體 2 異核體通過細(xì)胞有絲分裂 進(jìn)行核融合 進(jìn)行核融合 3 形成單核的雜種細(xì)胞 形成單核的雜種細(xì)胞 有性繁殖時發(fā)生的精卵結(jié)合 有性繁殖時發(fā)生的精卵結(jié)合 是正常的細(xì)胞融合， 是正常的細(xì)胞融合，即由兩 個配子融合形成一個新的的 二倍體。 二倍體。 細(xì)胞核移植 細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核 供體細(xì)胞核移入 細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入 去核的卵母細(xì)胞中 除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過精子 穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、 穿透等有性過程即無

4、性繁殖即可被激活、 分裂并發(fā)育成新個體， 分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因 得到完全復(fù)制。 得到完全復(fù)制。 基本過程 1 供體核的獲得 去核的卵母細(xì)胞 供體細(xì)胞核 2 受體細(xì)胞的獲得及其去核 3 核卵重組 4 細(xì)胞融合 激活 細(xì)胞融合/激活 5 重構(gòu)胚的培育與移植 以供體核的來源不同可分為胚細(xì)胞核移植 以供體核的來源不同可分為胚細(xì)胞核移植 體細(xì)胞核移植兩種 兩種。 與體細(xì)胞核移植兩種。 胚胎移植 細(xì)胞核移植 細(xì)胞器移植 細(xì)胞器移植，是將一個物種 細(xì)胞器 分 細(xì)胞器移植，是將一個物種的細(xì)胞器分 一個物種的 離出來，通過與另一物種的原生質(zhì)體混合 另一物種的原生質(zhì)體 離出來，通過與另一物種的原生

5、質(zhì)體混合 及原生質(zhì)體的胞飲作用 培育及原生質(zhì)體的胞飲作用， 培育及原生質(zhì)體的胞飲作用，把細(xì)胞器攝 入到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行作物的遺傳改良。 入到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行作物的遺傳改良。目前 討論較多的主要是葉綠體的攝入 葉綠體的攝入。 討論較多的主要是葉綠體的攝入。 顯微操作技術(shù)是指在高倍復(fù)式顯微鏡下， 顯微操作技術(shù)是指在高倍復(fù)式顯微鏡下， 是指在高倍復(fù)式顯微鏡下 利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作 的一種方法。 的一種方法。顯微操作器是用以掌握顯微 注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置。 注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置。 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注 嵌合體技術(shù)、 射、嵌

6、合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割 等。 染色體添加染色體工程( 染色體工程(chromosome engineering) engineering) 按設(shè)計有方案削減 添加和代換同種或異種染色體的方法 按設(shè)計有方案削減、添加和代換同種或異種染色體的方法 削減、 和技術(shù)。也稱為染色體操作 染色體操作。 和技術(shù)。也稱為染色體操作。 它不僅在改良植物的遺傳基礎(chǔ)培育新品種上受到重視， 它不僅在改良植物的遺傳基礎(chǔ)培育新品種上受到重視，而 且也是基因定位，和染色體轉(zhuǎn)移等基礎(chǔ)討論的有效手段。 且也是基因定位，和染色體轉(zhuǎn)移等基礎(chǔ)討論的有效手段。 胚胎移植胚胎移植又稱受精卵移植 俗稱人 胚胎移植又稱 受精卵移植

7、， 俗稱 人 受精卵移植， 工授胎或 借腹懷胎， 工授胎 或 借腹懷胎 ， 是指將雌性動 物的早期胚胎， 物的早期胚胎 ， 或者通過體外受精 及及其他方式得到的胚胎， 及及其他方式得到的胚胎 ， 移植到 同種的、 同種的 、 生理狀態(tài)相同的其他雌性 動物體內(nèi)， 動物體內(nèi) ， 使之連續(xù)發(fā)育為新個體 的技術(shù)。 的技術(shù)。 胚胎分割移植 是指采納機(jī)械方法將早期胚胎切割 等份、 等份或8等份等， 成2等份、4等份或8等份等，經(jīng)移植 獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。 獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。 胚胎移植 細(xì)胞核移植 細(xì)胞培育 (1)原代培育 是指從供體內(nèi)取出組織后， 是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機(jī)械以及消 化分別

8、成單個細(xì)胞或單一型細(xì)胞群， 化分別成單個細(xì)胞或單一型細(xì)胞群，使之 在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、 在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng) 溫度和肯定的養(yǎng)分條件下，生存、 溫度和肯定的養(yǎng)分條件下，生存、生長和 繁殖。 繁殖。 傳代培育 原代細(xì)胞培育勝利以后， 原代細(xì)胞培育勝利以后，需要進(jìn)行分別培 養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過 養(yǎng)分障礙，影響細(xì)胞生長。 大，養(yǎng)分障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原 培育瓶內(nèi)分別稀釋后傳到新的培育瓶中培 養(yǎng)的過程稱之為傳代培育。 養(yǎng)的過程稱之為傳代培育。傳代細(xì)胞允許 培育的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株 形成細(xì)胞株), 培育的細(xì)胞擴(kuò)增 形成細(xì)胞株 ， 可以進(jìn)行 細(xì)胞克隆，易于

9、保存， 細(xì)胞克隆，易于保存，但可能丟失一些特 殊的細(xì)胞和分化特征。 殊的細(xì)胞和分化特征。 組織培育 在無菌的條件下， 在無菌的條件下 ， 將植物 的器官或組織的一部分切下來， 的器官或組織的一部分切下來， 放在適當(dāng)?shù)娜斯づ嘤线M(jìn)行 培育， 培育，這些組織器官就會進(jìn)行 細(xì)胞分裂， 細(xì)胞分裂，形成沒有分化的一 團(tuán)薄壁細(xì)胞，叫愈傷組織。 團(tuán)薄壁細(xì)胞，叫愈傷組織。 在適合的光照、 在適合的光照 、 溫度和一 定的養(yǎng)分物質(zhì)與激素的條件下， 定的養(yǎng)分物質(zhì)與激素的條件下， 愈傷組織開頭分化， 愈傷組織開頭分化，發(fā)育成一 棵完整的植株。 棵完整的植株。 二、動物細(xì)胞工程及特點(一)動物細(xì)胞培育的特點1、污染

10、可能概率大細(xì)胞生長緩慢，培育時需要添加抗生素。 細(xì)胞生長緩慢，培育時需要添加抗生素。 關(guān)鍵：培育環(huán)境無菌 關(guān)鍵： 2、養(yǎng)分成分要求高養(yǎng)分成分：氨基酸、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、激 養(yǎng)分成分：氨基酸、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、 素和生長因子； 素和生長因子； 常用：血清、 常用：血清、胚胎浸出液 3、培育環(huán)境適應(yīng)性差生產(chǎn)用動物細(xì)胞必需依據(jù)生產(chǎn)形式需要，經(jīng)過較長時 生產(chǎn)用動物細(xì)胞必需依據(jù)生產(chǎn)形式需要， 間的馴化， 無血清培育的馴化、 間的馴化，如：無血清培育的馴化、懸浮培育的馴化 和高密度培育環(huán)境的馴化。 和高密度培育環(huán)境的馴化。 4、培育條件要求嚴(yán)常用空氣、氧氣、CO2和氮?dú)獾幕旌蠚怏w進(jìn)行供氧。

11、 和氮?dú)獾幕旌蠚怏w進(jìn)行供氧。 常用空氣、氧氣、 5、代謝廢物毒性大在進(jìn)行培育時，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、 在進(jìn)行培育時，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、準(zhǔn)時清除 代謝物等，維持細(xì)胞生存的基本條件。 代謝物等，維持細(xì)胞生存的基本條件。 6、檢測掌握指標(biāo)多在整個細(xì)胞培育過程中，需要對動物淡薄啊的形態(tài)結(jié) 在整個細(xì)胞培育過程中， 構(gòu)、倍增時間、產(chǎn)物表達(dá)狀況、表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征 倍增時間、產(chǎn)物表達(dá)狀況、 等進(jìn)行檢測和掌握。 等進(jìn)行檢測和掌握。 7、載體生長依靠強(qiáng)載體：中空纖維、 載體：中空纖維、微珠載體 (二)動物細(xì)胞系1.原代細(xì)胞系 .挺直取自 動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細(xì)胞。 挺直取自動物組織、

12、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細(xì)胞。 2.二倍體細(xì)胞系 .是原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆， 是原代細(xì)胞經(jīng)過傳代 、 篩選 、 克隆 ， 從多種細(xì)胞成分的組織中選擇出 來的具有某種特征的細(xì)胞株。 來的具有某種特征的細(xì)胞株。 3.連續(xù)細(xì)胞系 .是從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，分化不成熟的、 是從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來 ， 分化不成熟的 、 獲得了無限增殖力量的一種 細(xì)胞。 細(xì)胞。 4.基因工程細(xì)胞系 .通過基因工程技術(shù)，把編碼蛋白質(zhì)的基因在分子水平上進(jìn)行設(shè)計、 通過基因工程技術(shù) ， 把編碼蛋白質(zhì)的基因在分子水平上進(jìn)行設(shè)計 、 改 重組， 所獲得細(xì)胞系。 造、重組， 所獲得細(xì)胞系。 動物細(xì)胞培育的基本程序 (三)冷凍

13、保存慢凍速溶 液氮溫度( 保存10年以上 年以上。 液氮溫度(-196),保存 年以上。 -80保存細(xì)胞， -70- 保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞的活性無 - 明顯影響，但隨著凍存時間延長， 明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明 顯降低。 顯降低。- 40 0范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不 佳。 常用愛護(hù)劑：甘油、 常用愛護(hù)劑：甘油、二甲亞砜 (四)動物細(xì)胞培育基的組成及常用培育基1、動物細(xì)胞培育基的組成(1)氨基酸 ( 2 ) 維生素 。 最低基本培育基只含 B 族維生素 ， 其它都 維生素。 最低基本培育基只含B 族維生素， 靠從血清中獲得。 靠從血清中獲得。 (3)無機(jī)鹽 (4)葡萄糖 ( 5)

14、 激素和生長素 。 一般加血清即可滿足需要 ， 常用的 激素和生長素。一般加血清即可滿足需要， 有小牛血清、胎牛血清、人血清等。 有小牛血清、胎牛血清、人血清等。 2、動物細(xì)胞培育常用培育基 、(1)自然?培育基主要有生物性體液(如血清) 組織浸出液( 主要有生物性體液(如血清)、組織浸出液(如胚胎浸出 水解乳蛋白等。 液)、水解乳蛋白等。 (2)合成培育基依據(jù)自然?培育基的成分， 依據(jù)自然?培育基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對動物體內(nèi)生存環(huán)境 中各種已知物質(zhì)在體外人工條件下的模擬， 中各種已知物質(zhì)在體外人工條件下的模擬，經(jīng)過反復(fù)試驗 篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培育基。 篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培

15、育基。 (3)無血清培育基無血清培育基一般是由基礎(chǔ)培育基和替代血清的補(bǔ)充因子 所組成。 所組成。 (五)動物細(xì)胞培育條件1、溫度昆蟲細(xì)胞培育溫度一般25 28 昆蟲細(xì)胞培育溫度一般 25 28, 哺乳動物細(xì)胞的培育溫度一般 37。 37 2、pH動物細(xì)胞培育適合的pH一般在 動物細(xì)胞培育 適合的pH一般在7.27.4,低于6.8或高于7.6都不利 一般在7 低于6 或高于7 于細(xì)胞生長，嚴(yán)峻時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 于細(xì)胞生長，嚴(yán)峻時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 3、溶氧及氣體環(huán)境培育初期要求較低的溶氧水平，對數(shù)生長期或培育后期， 培育初期要求較低的溶氧水平，對數(shù)生長期或培育后期，溶氧水平 要求增加。 要求增加

16、。 除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)留意培育基的氧氣和 除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)留意培育基的氧氣和CO2的平衡。 氧氣和CO 的平衡。 4、滲透壓動物細(xì)胞滲透壓的維持一般采納平衡鹽溶液 動物細(xì)胞滲透壓的維持一般采納平衡鹽溶液。 平衡鹽溶液。 (六)動物細(xì)胞培育技術(shù) 1.灌注懸浮培育 . 2.貼壁細(xì)胞培育 . 3.固定化細(xì)胞培育 . 1、灌注懸浮培育 、 懸浮培育是指細(xì)胞在培育器中自由懸浮生 懸浮培育是指細(xì)胞在培育器中自由懸浮生 長的培育方法， 長的培育方法，它是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ) 上進(jìn)展起來的一種動物細(xì)胞培育技術(shù)。 上進(jìn)展起來的一種動物細(xì)胞培育技術(shù)。 非貼壁依靠性細(xì)胞如血細(xì)胞 淋巴細(xì)胞、 非貼壁依靠性細(xì)胞如血

17、細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 如血細(xì)胞、 某些腫瘤細(xì)胞(包括雜交瘤細(xì)胞) 某些腫瘤細(xì)胞(包括雜交瘤細(xì)胞)以及某 些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以采納此法進(jìn)行培育。 些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以采納此法進(jìn)行培育。 2、貼壁細(xì)胞培育 、 貼壁細(xì)胞培育指必需將細(xì)胞貼附在固體介質(zhì)表面上才能進(jìn)行細(xì)胞培育 的方式，主要用于非淋巴組織等貼壁依靠性細(xì)胞的培育。培育時， 貼壁依靠性細(xì)胞的培育 的方式，主要用于非淋巴組織等貼壁依靠性細(xì)胞的培育。培育時，在 固體載體表面上生長并擴(kuò)展成一單層，所以又稱為單層培育 單層培育或 固體載體表面上生長并擴(kuò)展成一單層，所以又稱為單層培育或微載體 系統(tǒng)培育法。 系統(tǒng)培育法。 由于大部分動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，屬于貼壁依靠性細(xì)

18、胞， 由于大部分動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，屬于貼壁依靠性細(xì)胞，所以貼壁培育 是動物細(xì)胞培育的一種重要方法。 是動物細(xì)胞培育的一種重要方法。 3、固定化細(xì)胞培育 、 固定化細(xì)胞培育是指將細(xì)胞限制或定 固定化細(xì)胞培育 是指將細(xì)胞限制或定 位于特定空間位置的培育技術(shù)。 位于特定空間位置的培育技術(shù)。 采納載體使整個細(xì)胞固定化。 采納載體使整個細(xì)胞固定化。 載體使整個細(xì)胞固定化 常見的固定化培育是包埋培育， 常見的固定化培育是包埋培育 ， 常用 凝膠( 海藻酸鈣、 瓊脂糖、 凝膠 ( 海藻酸鈣 、 瓊脂糖 、 血纖維蛋 白等) 來包埋細(xì)胞， 白等 ) 來包埋細(xì)胞 ， 能使細(xì)胞處于活 性狀態(tài)進(jìn)行培育。 性狀態(tài)進(jìn)行

19、培育。 (七)動物細(xì)胞培育在制藥中 的應(yīng)用1、單克隆抗體的生產(chǎn) 、(Monoclonal antibady,McAb) 單克隆抗體：指由一個 細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞( 細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞 單克隆抗體：指由一個B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞(漿細(xì) 產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體。 胞)產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體。 雜交瘤細(xì)胞：以人工方法將產(chǎn)生特異性抗體的 細(xì)胞 細(xì)胞與 雜交瘤細(xì)胞：以人工方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞與骨 髓瘤細(xì)胞融合 具有骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖的特性， 融合， 髓瘤細(xì)胞融合，具有骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖的特性，又具 細(xì)胞分泌特異性抗體的力量的細(xì)胞。 有B細(xì)胞分泌特異性抗體的力量的細(xì)胞。

20、細(xì)胞分泌特異性抗體的力量的細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞：壽命短，分泌特異系性抗體 淋巴細(xì)胞：壽命短， 淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞： 骨髓瘤細(xì)胞：壽命長 雜交瘤細(xì)胞：壽命長， 雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體 抗原決定簇 單特異性決定簇 多價抗原 多特異性決定簇 多價抗原 雜交瘤技術(shù)這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。 這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。 骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代， 骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代 ， 而 脾細(xì)胞是終末細(xì)胞， 不能在體外繁殖。 脾細(xì)胞是終末細(xì)胞 ， 不能在體外繁殖 。 如 將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌某種抗體或因 胞融合， 子的淋巴細(xì) 胞融合，則融合細(xì)胞既具有腫 瘤細(xì)胞無限繁殖的特性， 瘤細(xì)胞無

21、限繁殖的特性 ， 又具有淋巴細(xì)胞 能分泌特異性抗體或因子的力量， 能分泌特異性抗體或因子的力量 ， 同時也 克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外繁殖的缺 細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。 點，融合的 細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。 1984年， 兩位科學(xué)家獲得諾貝爾醫(yī)學(xué) 年 與生理學(xué)獎。 與生理學(xué)獎。 1984年，人-鼠雜交瘤構(gòu)建技術(shù)。 年 鼠雜交瘤構(gòu)建技術(shù)。 1986年，生產(chǎn)人源化單抗。 年 生產(chǎn)人源化單抗。 1988年，第一次商業(yè)性臨床試驗。 年 第一次商業(yè)性臨床試驗。 單克隆抗體的應(yīng)用領(lǐng)域高度靈敏的診斷分析 這是單抗的主要用途。目前已有很多這樣的單抗診斷藥盒。 這是單抗的主要用途。目前已有很多這樣的單抗診斷藥

22、盒。 防治某些癌癥生物導(dǎo)彈 防治某些癌癥生物導(dǎo)彈 把抗癌細(xì)胞的單抗與放射性同位素、 把抗癌細(xì)胞的單抗與放射性同位素、化療藥物或細(xì)胞毒素相結(jié) 定向地與癌細(xì)胞結(jié)合，并在原位殺死該細(xì)胞。 合，定向地與癌細(xì)胞結(jié)合，并在原位殺死該細(xì)胞。 應(yīng)用于方案生育 已勝利制成抗孕酮的單克隆抗體，注射這種抗體， 已勝利制成抗孕酮的單克隆抗體，注射這種抗體，能夠阻擋受 抗孕酮的單克隆抗體 精卵在子宮粘膜上著床，達(dá)到長 期避孕的目的。 精卵在子宮粘膜上著床，達(dá)到長期避孕的目的。 在器官移植后，消退異體細(xì)胞，免除排斥反應(yīng)， 在器官移植后，消退異體細(xì)胞，免除排斥反應(yīng)，是器官移植存活 率大大提高。 率大大提高。 利用單克隆抗體

23、的特異結(jié)合力量，有效地純化酶 利用單克隆抗體的特異結(jié)合力量，有效地純化酶、激素和干擾素 等制品。如用單克隆抗體提純干擾素，是產(chǎn)量提高5000倍 等制品。如用單克隆抗體提純干擾素，是產(chǎn)量提高5000倍。 2、疫苗生產(chǎn) 、疫苗的種類傳統(tǒng)疫苗： 第一代疫苗傳統(tǒng)疫苗：減毒活疫苗、滅活疫苗、工程疫苗 第一代疫苗 傳統(tǒng)疫苗 減毒活疫苗、滅活疫苗、 亞基疫苗： 其次代疫苗亞基疫苗：組分疫苗、多糖疫苗、合成肽疫苗 其次代疫苗 亞基疫苗 組分疫苗、多糖疫苗、 核酸疫苗： 第三代疫苗核酸疫苗：表達(dá)特定抗原蛋白的核酸(DNA和RNA) 第三代疫苗 核酸疫苗 表達(dá)特定抗原蛋白的核酸( 和 ) 疫苗生產(chǎn)的一般程序 滅活

24、 檢定 毒株 毒種 收獲 大量細(xì)胞 檢疫 動物 組織 分散 培育 細(xì)胞懸液 活疫苗 稀釋 原苗 檢定 接種 滅活疫苗 乙 腦 毒 培育 培育 接種于長成致密單層Vero細(xì)胞瓶中 接種于長成致密單層 細(xì)胞瓶中 乙腦SA14-14-2 乙腦 無血清維持液， 無血清維持液，35 乙腦病毒液 棄 離 去 心 沉 淀 液 ， 清液 毒 乙腦 毒 0.22m 清液 100,000D ,35 三、植物細(xì)胞工程及特點(一)植物細(xì)胞的培育特性1、 細(xì)胞個體較大 ( 較微生物細(xì)胞大的多) , 有纖維細(xì)胞壁， 細(xì)胞個體較大(較微生物細(xì)胞大的多) 有纖維細(xì)胞壁， 細(xì)胞抗剪切力差； 細(xì)胞抗剪切力差； 2、 細(xì)胞生長速度

25、較慢 ， 簡單被微生物污染 ， 培育時需添加 細(xì)胞生長速度較慢，簡單被微生物污染， 抗生素； 抗生素； 3、細(xì)胞培育過程中易聚集成團(tuán)，較難進(jìn)行懸浮培育； 細(xì)胞培育過程中易聚集成團(tuán)，較難進(jìn)行懸浮培育； 4、 培育時需供氧 ， 但培育液黏度較大 ， 不能耐受強(qiáng)力通風(fēng) 培育時需供氧，但培育液黏度較大， 攪拌； 攪拌； 5、植物細(xì)胞具有群體效應(yīng)及解除抑制性； 植物細(xì)胞具有群體效應(yīng)及解除抑制性； 6、細(xì)胞培育產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量低； 細(xì)胞培育產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量低； 7、植物細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性。 植物細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性 全能性。 植物細(xì)胞全能性植物的每個細(xì)胞都包含著該物種的全 部遺傳信息

26、， 部遺傳信息 ， 從而具備發(fā)育成完整植株 的遺傳力量。在適合條件下， 的遺傳力量 。 在適合條件下 ， 任何一個 細(xì)胞都可以發(fā)育成一個新個體。 細(xì)胞都可以發(fā)育成一個新個體 。 植物 細(xì) 胞全能性是植物組織培育的理論基礎(chǔ)。 胞全能性是植物組織培育的理論基礎(chǔ)。 (二)培育基組成1、基本培育基 基本培育基的各種成分是愈傷組織和懸浮細(xì)胞培育的物質(zhì) 基礎(chǔ)，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產(chǎn)物累積時更是如此。 基礎(chǔ)，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產(chǎn)物累積時更是如此。 2、碳源 碳源通常以光自養(yǎng)培育中的CO 碳源通常以光自養(yǎng)培育中的CO2或異養(yǎng)培育中的糖類兩種 形式供應(yīng)， 形式供應(yīng)，其性質(zhì)和數(shù)量往往對培育細(xì)胞的生物量有很大 的

27、影響。 的影響。CO2可以誘導(dǎo)某些特征反應(yīng)，如在金蘋果的懸浮 可以誘導(dǎo)某些特征反應(yīng)， 細(xì)胞培育中，高濃度CO 可產(chǎn)生一種特有的蘋果香味。 細(xì)胞培育中，高濃度CO2可產(chǎn)生一種特有的蘋果香味。 植物細(xì)胞培育中用法最多的碳源是糖類， 植物細(xì)胞培育中用法最多的碳源是糖類，對次級代謝產(chǎn)物 的影響主要取決于所用法的糖類的種類及細(xì)胞次級代謝產(chǎn) 物的生物合成過程。 物的生物合成過程。 植物細(xì)胞培育基常用的培育基有幾十種。 MS( 下表) 常用的培育基有幾十種 。 如 MS ( 下表 ) 、 B5 、 E1 、 N6 培育基等。其中以MS、 等應(yīng)用較為廣泛。 培育基等。其中以MS、B5等應(yīng)用較為廣泛。大量元素(

28、20 大量元素 ) NH4NO3 KNO3 CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4FeSO4 7H2O (200) 用量 (mg/L母液 母液) 母液 33000 38000 8800 7400 3400 5560 7460 20210 400 微量元素(200) 微量元素 KI H3BO3 MnSO4 4H2O ZnSO4 7H2O Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O 煙酸(200) 煙酸 VB1(200) VB6(200) 用量 (mg/L母液 母液) 母液 166 1240 4460 1720 50 5 100 20 100 Na2.EDTA 7H2O 肌醇

29、(200) 肌醇 甘氨酸(200) 甘氨酸 3、植物生長調(diào)整劑植物生長調(diào)整劑在植物細(xì)胞培育中起著特別重要的作用， 植物生長調(diào)整劑在植物細(xì)胞培育中起著特別重要的作用，可能是關(guān)鍵 性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無肯定的規(guī)律可循， 性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無肯定的規(guī)律可循，必需通 過認(rèn)真的試驗觀看才能確定其合適的數(shù)量和種類。 過認(rèn)真的試驗觀看才能確定其合適的數(shù)量和種類。 與植物細(xì)胞培育和組織培育有關(guān)的主要激素：IAA、GA、 與植物細(xì)胞培育和組織培育有關(guān)的主要激素：IAA、GA、CTK 4、誘導(dǎo)子生產(chǎn)某些植物次級代謝物質(zhì)需要刺激性物質(zhì)。 生產(chǎn)某些植物次級代謝物質(zhì)需要刺激性物質(zhì)。 植

30、物抗毒素(phytoalexins) 植物抗毒素(phytoalexins)是指在植物防備系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進(jìn) 攻的某些次級代謝產(chǎn)物 依據(jù)其功能又稱為“后感染防備物質(zhì)” 次級代謝產(chǎn)物( 攻的某些次級代謝產(chǎn)物(依據(jù)其功能又稱為“后感染防備物質(zhì)”)。 盡管在有些狀況下代謝產(chǎn)物可能會連 續(xù)合成， 盡管在有些狀況下代謝產(chǎn)物可能會連續(xù)合成，但在另外一些狀況下只 有細(xì)胞被刺激時才能產(chǎn)生植物抗毒素， 有細(xì)胞被刺激時才能產(chǎn)生植物抗毒素，或僅在被誘導(dǎo)時其產(chǎn)量才能增 加。 (三)植物細(xì)胞培育技術(shù)培育罐類型、通氣、攪拌和培育方法等。 培育罐類型、通氣、攪拌和培育方法等。 1、培育容器 小規(guī)模試驗室培育所用的培育容器

31、 50500ml) 小規(guī)模試驗室培育所用的培育容器(50500ml) 培育容器( 具有較高的氧轉(zhuǎn)移率，通過簡潔的定期攪拌， 具有較高的氧轉(zhuǎn)移率 ， 通過簡潔的定期攪拌 ， 培 養(yǎng)物的每個部位均可得到比大規(guī)模培育更好的氧 供應(yīng)。 供應(yīng)。 工業(yè)化生產(chǎn)全部培育容器就是大型發(fā)酵罐 500L 工業(yè)化生產(chǎn)全部培育容器就是大型發(fā)酵罐(500L 大型發(fā)酵罐( 以上) 以上)。 2、培育方法 、單細(xì)胞培育 從植物組織器官分別得到單細(xì)胞， 從植物組織器官分別得到單細(xì)胞，在特定條件下可以形成具有不同性 狀的愈傷組織(細(xì)胞系) 或者發(fā)育成完整的植株試管苗。 試管苗。 狀的愈傷組織(細(xì)胞系),或者發(fā)育成完整的植株 試管

32、苗 懸浮細(xì)胞培育 是指單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于培育液中進(jìn)行生長的過程。 是指單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于培育液中進(jìn)行生長的過程。主要用 于代謝物的生產(chǎn)，如屬于次級代謝物質(zhì)，則需加中間體或誘導(dǎo)子等。 于代謝物的生產(chǎn)，如屬于次級代謝物質(zhì)，則需加中間體或誘導(dǎo)子等。 大規(guī)模細(xì)胞培育 類似于微生物發(fā)酵的培育過程，其產(chǎn)物可以是細(xì)胞， 類似于微生物發(fā)酵的培育過程，其產(chǎn)物可以是細(xì)胞，也可以是代謝產(chǎn) 初級、次級產(chǎn)物) 物(初級、次級產(chǎn)物)。 固定化細(xì)胞培育 與前述一樣，是將細(xì)胞包埋在固體材料中，細(xì)胞保持活性。 與前述一樣，是將細(xì)胞包埋在固體材料中，細(xì)胞保持活性。下面將詳 細(xì)商量。 細(xì)商量。 (四)植物細(xì)胞培育在

33、制藥中的應(yīng)用1、三七細(xì)胞干粉制備 、三七， 五加科人參屬多年生草本植物， 三七 ， 五加科人參屬多年生草本植物 ， 主產(chǎn) 于云南文山地區(qū)， 是我國珍貴的藥食植物之一， 于云南文山地區(qū) ， 是我國珍貴的藥食植物之一 ， 被譽(yù)為“ 人參之王” 金不換” 之名。 被譽(yù)為 “ 人參之王 ” , 有 “ 金不換 ” 之名 。 主要 藥效為止血、補(bǔ)血和強(qiáng)身抗衰。 藥效為止血、補(bǔ)血和強(qiáng)身抗衰。 由于生境要求苛刻， 無法廣泛栽種， 由于生境要求苛刻 ， 無法廣泛栽種 ， 利用細(xì) 胞培育技術(shù)制備三七細(xì)胞干粉， 胞培育技術(shù)制備三七細(xì)胞干粉 ， 可謂三七藥材新 來源。 來源。 三七細(xì)胞干粉制備工藝路途消毒 消毒 消

34、毒 70%乙醇 乙醇2min 乙醇 誘導(dǎo) 誘導(dǎo) 誘導(dǎo) MS培育基，培育 培育基， 培育基 三七外植體0.1%升汞 升汞20min 升汞 種子制備 種子制備 種子制備 無菌粗根2,4-D;CTK;椰乳 椰乳 25,40d 愈傷組織 MS培育液，pH5.55.8,25,120rpm 培育液， 培育液 ， 振搖 大規(guī)模培育 大規(guī)模培育 大規(guī)模培育 培育液同上 種子細(xì)胞 10L攪拌罐反應(yīng)器，25,30d,60rpm攪拌通風(fēng) 攪拌罐反應(yīng)器， 攪拌罐反應(yīng)器 ， 攪拌通風(fēng) 過濾，干燥 過濾，干燥 過濾 3040真空干燥，或凍干 真空干燥， 懸浮培育液 三七細(xì)胞干粉 2、大蒜細(xì)胞培育生產(chǎn)SOD 、大蒜細(xì)胞培育

35、生產(chǎn)SOD大蒜( 大蒜 ( Allium sativum L.)是 SOD含量較高的自然?植物 ) 含量較高的自然?植物 之一，可由它提取出SOD來生產(chǎn)功能性食品。利用大蒜細(xì) 來生產(chǎn)功能性食品。 之一，可由它提取出 來生產(chǎn)功能性食品 胞培育生產(chǎn)SOD具有成本低、有用性強(qiáng)的優(yōu)點，易實現(xiàn)工 具有成本低、 胞培育生產(chǎn) 具有成本低 有用性強(qiáng)的優(yōu)點， 業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。 業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。 基本流程： 基本流程：外植體誘導(dǎo)培育基 愈傷組織大規(guī)模培育 懸浮培育基 懸浮細(xì)胞 或組織塊 大量細(xì)胞 收集、 收集、破裂 提取、 提取、濃縮 SOD粗品 粗品 SOD功能食品 功能食品 精制 SOD精品 精品 SOD藥品 藥

36、品 大蒜細(xì)胞培育生產(chǎn)SOD1、大蒜細(xì)胞種質(zhì)的選擇與處理 、 先將大蒜放在8的低溫環(huán)境中貯藏 個月 以打破其休眠期， 個月， 先將大蒜放在 的低溫環(huán)境中貯藏1個月，以打破其休眠期，取出剝?nèi)ケ?護(hù)葉后用無菌水沖洗蒜瓣，再在無菌條件下用70%乙醇漂洗15 護(hù)葉后用無菌水沖洗蒜瓣，再在無菌條件下用 %乙醇漂洗 30s,置 ， 取出經(jīng)無菌水沖洗三遍， 于0 .1%的升汞溶液中消毒 %的升汞溶液中消毒8min,取出經(jīng)無菌水沖洗三遍，備用。 取出經(jīng)無菌水沖洗三遍 備用。 2、愈傷組織的誘導(dǎo) 、 蒜瓣切成0.5cm0.3cm0.2cm帶表皮的蒜塊， 接種于盛有愈傷組織誘 帶表皮的蒜塊， 蒜瓣切成 帶表皮的蒜塊

37、 導(dǎo)培育基的三角瓶中，培育溫度25 光照度600lx,每天循環(huán)光照 導(dǎo)培育基的三角瓶中 ， 培育溫度 , 光照度 ， 每天循環(huán)光照12h, , 左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中， 過20d左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中，在相同條件下培 左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中 養(yǎng)20d。如此重復(fù)移植培育 5 次。 。如此重復(fù)移植培育4 愈傷組織的誘導(dǎo)培育基： %蔗糖，添加0.8%瓊脂， 愈傷組織的誘導(dǎo)培育基：3%蔗糖，添加 %瓊脂，pH5.8。添加 。添加2mg/kg 二氯苯氧乙醇( 的 2,4-二氯苯氧乙醇 ( 植物細(xì)胞生長素 ) 和 0.1mg/kg的 6-糠 基氨

38、基嘌呤 二氯苯氧乙醇 植物細(xì)胞生長素) 的 糠基氨基嘌呤 植物細(xì)胞分裂素)對誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的形成有明顯的促進(jìn)作用。 (植物細(xì)胞分裂素)對誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的形成有明顯的促進(jìn)作用。 大蒜細(xì)胞培育生產(chǎn)SOD3、大蒜細(xì)胞懸浮培育 、 將處于對數(shù)生長期(約培育15d)的大蒜愈傷組織 ， 接種于懸浮培育基 將處于對數(shù)生長期 ( 約培育 ) 的大蒜愈傷組織， 中進(jìn)行液體培育。培育溫度為25 范圍內(nèi)， 中進(jìn)行液體培育 。 培育溫度為 30, pH在56范圍內(nèi)， 以 28、 在 范圍內(nèi) pH5.8為好。 經(jīng)過 的培育后，單細(xì)胞和部分小細(xì)胞團(tuán)從結(jié)構(gòu)松散的愈 為好。 的培育后， 為好 經(jīng)過7d的培育后 傷組織上脫

39、落下來， 傷組織上脫落下來，由此獲得的單細(xì)胞作為懸浮培育種子進(jìn)行液體懸浮 擴(kuò)大培育或深層發(fā)酵。 擴(kuò)大培育或深層發(fā)酵。 4、大蒜細(xì)胞擴(kuò)大培育 、 最初的大蒜細(xì)胞形態(tài)大小不一， 次移種培育后， 最初的大蒜細(xì)胞形態(tài)大小不一，經(jīng)34次移種培育后，細(xì)胞趨于整齊一 次移種培育后 以圓形或橢圓形為主，可以此為種子液進(jìn)行深層發(fā)酵擴(kuò)大培育。 致，以圓形或橢圓形為主，可以此為種子液進(jìn)行深層發(fā)酵擴(kuò)大培育。 增殖培育基與誘導(dǎo)培育基相同，只是新添加了 的酪蛋白水解物。 增殖培育基與誘導(dǎo)培育基相同，只是新添加了0.02%的酪蛋白水解物。 的酪蛋白水解物 5、SOD提取純化 、 提取純化 與前面(其次章)的方法相同。 與前面(其次章)的方法相同。 四、細(xì)胞固定化技術(shù)與細(xì)胞反應(yīng)器1、固定化細(xì)胞技術(shù)利用物理或化學(xué)的手段將游離的細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域， 利用物理或化學(xué)的手段將游離的細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其 保持活性并可反復(fù)用法的技術(shù)稱為細(xì)胞的固定化，該細(xì)胞稱為固定化 保持活性并可反復(fù)用法的技術(shù)稱為細(xì)胞的固定化，該細(xì)胞稱為固定化 細(xì)胞。 細(xì)胞。 固定化細(xì)胞有如下幾方面的優(yōu)點： 固定化細(xì)胞有如下幾方面的優(yōu)點： 它不需進(jìn)行破裂細(xì)胞而挺直利用胞內(nèi)酶，降低了制備成本； 它不需進(jìn)行破裂細(xì)胞而挺直利用胞內(nèi)酶，降低了制備成本；