生物制藥 第二章 生物制藥技術通論 第三節(jié) 細胞工程制藥技術

1、生物制藥 第二章 生物制藥技術通論 第三節(jié) 細胞工程制藥技術 其次章 生物制藥技術通論第一節(jié) 生物藥物的制備技術 其次節(jié) 發(fā)酵工程制藥技術 第三節(jié) 細胞工程制藥技術 第四節(jié) 酶工程制藥技術 第五節(jié) 基因工程制藥技術 第三節(jié) 細胞工程制藥技術一、細胞工程的概述 二、動物細胞工程及特點 三、植物細胞工程及特點 四、細胞固定化技術與細胞反應器 Engineering) 一、細胞工程概述(Cell Engineering) 細胞工程概述(1、細胞工程的定義 、細胞工程也稱細胞技術 細胞工程 也稱細胞技術， 是指應用現(xiàn)代細胞生物 也稱 細胞技術， 發(fā)育生物學、 學 、 發(fā)育生物學 、 遺傳學和分子生物學

2、的理論與 方法，根據(jù)人們的需要和設計，通過細胞融合 細胞融合、 方法 ， 根據(jù)人們的需要和設計 ， 通過 細胞融合 、 核質移植、染色體移植以及組織和細胞培育等方 以及組織和細胞培育 核質移植 、 染色體移植 以及 組織和細胞培育 等方 法 ， 快速繁殖和培育出人們所需要的新物種的生 物工程技術。 物工程技術。 發(fā)酵技術也屬于細胞工程的范疇。 發(fā)酵技術也屬于細胞工程的范疇。 也屬于細胞工程的范疇 2、細胞工程的內容(細胞操作技術) 、細胞工程的內容(細胞操作技術)細胞融合 細胞核移植 細胞器移植 染色體添加 外源染色體導入 胚胎移植 細胞培育 組織培育 細胞融合在自發(fā)或人工誘導下， 在自發(fā)或人

3、工誘導下，兩個 不同基因型的細胞或原生質 體融合形成一個雜種細胞。 體融合形成一個雜種細胞。 基本過程 1 細胞融合形成異核體 細胞融合形成異核體 2 異核體通過細胞有絲分裂 進行核融合 進行核融合 3 形成單核的雜種細胞 形成單核的雜種細胞 有性繁殖時發(fā)生的精卵結合 有性繁殖時發(fā)生的精卵結合 是正常的細胞融合， 是正常的細胞融合，即由兩 個配子融合形成一個新的的 二倍體。 二倍體。 細胞核移植 細胞核移植技術，就是將供體細胞核 供體細胞核移入 細胞核移植技術，就是將供體細胞核移入 去核的卵母細胞中 除去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)過精子 穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、 穿透等有性過程即無

4、性繁殖即可被激活、 分裂并發(fā)育成新個體， 分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因 得到完全復制。 得到完全復制。 基本過程 1 供體核的獲得 去核的卵母細胞 供體細胞核 2 受體細胞的獲得及其去核 3 核卵重組 4 細胞融合 激活 細胞融合/激活 5 重構胚的培育與移植 以供體核的來源不同可分為胚細胞核移植 以供體核的來源不同可分為胚細胞核移植 體細胞核移植兩種 兩種。 與體細胞核移植兩種。 胚胎移植 細胞核移植 細胞器移植 細胞器移植，是將一個物種 細胞器 分 細胞器移植，是將一個物種的細胞器分 一個物種的 離出來，通過與另一物種的原生質體混合 另一物種的原生質體 離出來，通過與另一物種的原生

5、質體混合 及原生質體的胞飲作用 培育及原生質體的胞飲作用， 培育及原生質體的胞飲作用，把細胞器攝 入到細胞內，進行作物的遺傳改良。 入到細胞內，進行作物的遺傳改良。目前 討論較多的主要是葉綠體的攝入 葉綠體的攝入。 討論較多的主要是葉綠體的攝入。 顯微操作技術是指在高倍復式顯微鏡下， 顯微操作技術是指在高倍復式顯微鏡下， 是指在高倍復式顯微鏡下 利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作 的一種方法。 的一種方法。顯微操作器是用以掌握顯微 注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。 注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。 顯微操作技術包括細胞核移植、 顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注 嵌合體技術、 射、嵌

6、合體技術、胚胎移植以及顯微切割 等。 染色體添加染色體工程( 染色體工程(chromosome engineering) engineering) 按設計有方案削減 添加和代換同種或異種染色體的方法 按設計有方案削減、添加和代換同種或異種染色體的方法 削減、 和技術。也稱為染色體操作 染色體操作。 和技術。也稱為染色體操作。 它不僅在改良植物的遺傳基礎培育新品種上受到重視， 它不僅在改良植物的遺傳基礎培育新品種上受到重視，而 且也是基因定位，和染色體轉移等基礎討論的有效手段。 且也是基因定位，和染色體轉移等基礎討論的有效手段。 胚胎移植胚胎移植又稱受精卵移植 俗稱人 胚胎移植又稱 受精卵移植

7、， 俗稱 人 受精卵移植， 工授胎或 借腹懷胎， 工授胎 或 借腹懷胎 ， 是指將雌性動 物的早期胚胎， 物的早期胚胎 ， 或者通過體外受精 及及其他方式得到的胚胎， 及及其他方式得到的胚胎 ， 移植到 同種的、 同種的 、 生理狀態(tài)相同的其他雌性 動物體內， 動物體內 ， 使之連續(xù)發(fā)育為新個體 的技術。 的技術。 胚胎分割移植 是指采納機械方法將早期胚胎切割 等份、 等份或8等份等， 成2等份、4等份或8等份等，經(jīng)移植 獲得同卵雙胎或多胎的技術。 獲得同卵雙胎或多胎的技術。 胚胎移植 細胞核移植 細胞培育 (1)原代培育 是指從供體內取出組織后， 是指從供體內取出組織后，經(jīng)機械以及消 化分別

8、成單個細胞或單一型細胞群， 化分別成單個細胞或單一型細胞群，使之 在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、 在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當 溫度和肯定的養(yǎng)分條件下，生存、 溫度和肯定的養(yǎng)分條件下，生存、生長和 繁殖。 繁殖。 傳代培育 原代細胞培育勝利以后， 原代細胞培育勝利以后，需要進行分別培 養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過 養(yǎng)分障礙，影響細胞生長。 大，養(yǎng)分障礙，影響細胞生長。細胞由原 培育瓶內分別稀釋后傳到新的培育瓶中培 養(yǎng)的過程稱之為傳代培育。 養(yǎng)的過程稱之為傳代培育。傳代細胞允許 培育的細胞擴增(形成細胞株 形成細胞株), 培育的細胞擴增 形成細胞株 ， 可以進行 細胞克隆，易于

9、保存， 細胞克隆，易于保存，但可能丟失一些特 殊的細胞和分化特征。 殊的細胞和分化特征。 組織培育 在無菌的條件下， 在無菌的條件下 ， 將植物 的器官或組織的一部分切下來， 的器官或組織的一部分切下來， 放在適當?shù)娜斯づ嘤线M行 培育， 培育，這些組織器官就會進行 細胞分裂， 細胞分裂，形成沒有分化的一 團薄壁細胞，叫愈傷組織。 團薄壁細胞，叫愈傷組織。 在適合的光照、 在適合的光照 、 溫度和一 定的養(yǎng)分物質與激素的條件下， 定的養(yǎng)分物質與激素的條件下， 愈傷組織開頭分化， 愈傷組織開頭分化，發(fā)育成一 棵完整的植株。 棵完整的植株。 二、動物細胞工程及特點(一)動物細胞培育的特點1、污染

10、可能概率大細胞生長緩慢，培育時需要添加抗生素。 細胞生長緩慢，培育時需要添加抗生素。 關鍵：培育環(huán)境無菌 關鍵： 2、養(yǎng)分成分要求高養(yǎng)分成分：氨基酸、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、激 養(yǎng)分成分：氨基酸、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、 素和生長因子； 素和生長因子； 常用：血清、 常用：血清、胚胎浸出液 3、培育環(huán)境適應性差生產用動物細胞必需依據(jù)生產形式需要，經(jīng)過較長時 生產用動物細胞必需依據(jù)生產形式需要， 間的馴化， 無血清培育的馴化、 間的馴化，如：無血清培育的馴化、懸浮培育的馴化 和高密度培育環(huán)境的馴化。 和高密度培育環(huán)境的馴化。 4、培育條件要求嚴常用空氣、氧氣、CO2和氮氣的混合氣體進行供氧。

11、 和氮氣的混合氣體進行供氧。 常用空氣、氧氣、 5、代謝廢物毒性大在進行培育時，保持細胞生存環(huán)境無污染、 在進行培育時，保持細胞生存環(huán)境無污染、準時清除 代謝物等，維持細胞生存的基本條件。 代謝物等，維持細胞生存的基本條件。 6、檢測掌握指標多在整個細胞培育過程中，需要對動物淡薄啊的形態(tài)結 在整個細胞培育過程中， 構、倍增時間、產物表達狀況、表達產物的結構特征 倍增時間、產物表達狀況、 等進行檢測和掌握。 等進行檢測和掌握。 7、載體生長依靠強載體：中空纖維、 載體：中空纖維、微珠載體 (二)動物細胞系1.原代細胞系 .挺直取自 動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞。 挺直取自動物組織、

12、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞。 2.二倍體細胞系 .是原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆， 是原代細胞經(jīng)過傳代 、 篩選 、 克隆 ， 從多種細胞成分的組織中選擇出 來的具有某種特征的細胞株。 來的具有某種特征的細胞株。 3.連續(xù)細胞系 .是從正常細胞轉化而來，分化不成熟的、 是從正常細胞轉化而來 ， 分化不成熟的 、 獲得了無限增殖力量的一種 細胞。 細胞。 4.基因工程細胞系 .通過基因工程技術，把編碼蛋白質的基因在分子水平上進行設計、 通過基因工程技術 ， 把編碼蛋白質的基因在分子水平上進行設計 、 改 重組， 所獲得細胞系。 造、重組， 所獲得細胞系。 動物細胞培育的基本程序 (三)冷凍

13、保存慢凍速溶 液氮溫度( 保存10年以上 年以上。 液氮溫度(-196),保存 年以上。 -80保存細胞， -70- 保存細胞，短期內對細胞的活性無 - 明顯影響，但隨著凍存時間延長， 明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明 顯降低。 顯降低。- 40 0范圍內保存細胞的效果不 佳。 常用愛護劑：甘油、 常用愛護劑：甘油、二甲亞砜 (四)動物細胞培育基的組成及常用培育基1、動物細胞培育基的組成(1)氨基酸 ( 2 ) 維生素 。 最低基本培育基只含 B 族維生素 ， 其它都 維生素。 最低基本培育基只含B 族維生素， 靠從血清中獲得。 靠從血清中獲得。 (3)無機鹽 (4)葡萄糖 ( 5)

14、 激素和生長素 。 一般加血清即可滿足需要 ， 常用的 激素和生長素。一般加血清即可滿足需要， 有小牛血清、胎牛血清、人血清等。 有小牛血清、胎牛血清、人血清等。 2、動物細胞培育常用培育基 、(1)自然?培育基主要有生物性體液(如血清) 組織浸出液( 主要有生物性體液(如血清)、組織浸出液(如胚胎浸出 水解乳蛋白等。 液)、水解乳蛋白等。 (2)合成培育基依據(jù)自然?培育基的成分， 依據(jù)自然?培育基的成分，用化學物質對動物體內生存環(huán)境 中各種已知物質在體外人工條件下的模擬， 中各種已知物質在體外人工條件下的模擬，經(jīng)過反復試驗 篩選、強化和重新組合后形成的培育基。 篩選、強化和重新組合后形成的培

15、育基。 (3)無血清培育基無血清培育基一般是由基礎培育基和替代血清的補充因子 所組成。 所組成。 (五)動物細胞培育條件1、溫度昆蟲細胞培育溫度一般25 28 昆蟲細胞培育溫度一般 25 28, 哺乳動物細胞的培育溫度一般 37。 37 2、pH動物細胞培育適合的pH一般在 動物細胞培育 適合的pH一般在7.27.4,低于6.8或高于7.6都不利 一般在7 低于6 或高于7 于細胞生長，嚴峻時會導致細胞死亡。 于細胞生長，嚴峻時會導致細胞死亡。 3、溶氧及氣體環(huán)境培育初期要求較低的溶氧水平，對數(shù)生長期或培育后期， 培育初期要求較低的溶氧水平，對數(shù)生長期或培育后期，溶氧水平 要求增加。 要求增加

16、。 除了氧氣供應外，還應留意培育基的氧氣和 除了氧氣供應外，還應留意培育基的氧氣和CO2的平衡。 氧氣和CO 的平衡。 4、滲透壓動物細胞滲透壓的維持一般采納平衡鹽溶液 動物細胞滲透壓的維持一般采納平衡鹽溶液。 平衡鹽溶液。 (六)動物細胞培育技術 1.灌注懸浮培育 . 2.貼壁細胞培育 . 3.固定化細胞培育 . 1、灌注懸浮培育 、 懸浮培育是指細胞在培育器中自由懸浮生 懸浮培育是指細胞在培育器中自由懸浮生 長的培育方法， 長的培育方法，它是在微生物發(fā)酵的基礎 上進展起來的一種動物細胞培育技術。 上進展起來的一種動物細胞培育技術。 非貼壁依靠性細胞如血細胞 淋巴細胞、 非貼壁依靠性細胞如血

17、細胞、淋巴細胞、 如血細胞、 某些腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞) 某些腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞)以及某 些轉化細胞，可以采納此法進行培育。 些轉化細胞，可以采納此法進行培育。 2、貼壁細胞培育 、 貼壁細胞培育指必需將細胞貼附在固體介質表面上才能進行細胞培育 的方式，主要用于非淋巴組織等貼壁依靠性細胞的培育。培育時， 貼壁依靠性細胞的培育 的方式，主要用于非淋巴組織等貼壁依靠性細胞的培育。培育時，在 固體載體表面上生長并擴展成一單層，所以又稱為單層培育 單層培育或 固體載體表面上生長并擴展成一單層，所以又稱為單層培育或微載體 系統(tǒng)培育法。 系統(tǒng)培育法。 由于大部分動物細胞無細胞壁，屬于貼壁依靠性細

18、胞， 由于大部分動物細胞無細胞壁，屬于貼壁依靠性細胞，所以貼壁培育 是動物細胞培育的一種重要方法。 是動物細胞培育的一種重要方法。 3、固定化細胞培育 、 固定化細胞培育是指將細胞限制或定 固定化細胞培育 是指將細胞限制或定 位于特定空間位置的培育技術。 位于特定空間位置的培育技術。 采納載體使整個細胞固定化。 采納載體使整個細胞固定化。 載體使整個細胞固定化 常見的固定化培育是包埋培育， 常見的固定化培育是包埋培育 ， 常用 凝膠( 海藻酸鈣、 瓊脂糖、 凝膠 ( 海藻酸鈣 、 瓊脂糖 、 血纖維蛋 白等) 來包埋細胞， 白等 ) 來包埋細胞 ， 能使細胞處于活 性狀態(tài)進行培育。 性狀態(tài)進行

19、培育。 (七)動物細胞培育在制藥中 的應用1、單克隆抗體的生產 、(Monoclonal antibady,McAb) 單克隆抗體：指由一個 細胞分化增殖的子代細胞( 細胞分化增殖的子代細胞 單克隆抗體：指由一個B細胞分化增殖的子代細胞(漿細 產生的針對單一抗原決定簇的抗體。 胞)產生的針對單一抗原決定簇的抗體。 雜交瘤細胞：以人工方法將產生特異性抗體的 細胞 細胞與 雜交瘤細胞：以人工方法將產生特異性抗體的B細胞與骨 髓瘤細胞融合 具有骨髓瘤細胞無限繁殖的特性， 融合， 髓瘤細胞融合，具有骨髓瘤細胞無限繁殖的特性，又具 細胞分泌特異性抗體的力量的細胞。 有B細胞分泌特異性抗體的力量的細胞。

20、細胞分泌特異性抗體的力量的細胞 B淋巴細胞：壽命短，分泌特異系性抗體 淋巴細胞：壽命短， 淋巴細胞 骨髓瘤細胞： 骨髓瘤細胞：壽命長 雜交瘤細胞：壽命長， 雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體 抗原決定簇 單特異性決定簇 多價抗原 多特異性決定簇 多價抗原 雜交瘤技術這一技術的基礎是細胞融合技術。 這一技術的基礎是細胞融合技術。 骨髓瘤細胞在體外可以連續(xù)傳代， 骨髓瘤細胞在體外可以連續(xù)傳代 ， 而 脾細胞是終末細胞， 不能在體外繁殖。 脾細胞是終末細胞 ， 不能在體外繁殖 。 如 將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌某種抗體或因 胞融合， 子的淋巴細 胞融合，則融合細胞既具有腫 瘤細胞無限繁殖的特性， 瘤細胞無

21、限繁殖的特性 ， 又具有淋巴細胞 能分泌特異性抗體或因子的力量， 能分泌特異性抗體或因子的力量 ， 同時也 克服了免疫淋巴細胞不能在體外繁殖的缺 細胞稱為淋巴細胞雜交瘤。 點，融合的 細胞稱為淋巴細胞雜交瘤。 1984年， 兩位科學家獲得諾貝爾醫(yī)學 年 與生理學獎。 與生理學獎。 1984年，人-鼠雜交瘤構建技術。 年 鼠雜交瘤構建技術。 1986年，生產人源化單抗。 年 生產人源化單抗。 1988年，第一次商業(yè)性臨床試驗。 年 第一次商業(yè)性臨床試驗。 單克隆抗體的應用領域高度靈敏的診斷分析 這是單抗的主要用途。目前已有很多這樣的單抗診斷藥盒。 這是單抗的主要用途。目前已有很多這樣的單抗診斷藥

22、盒。 防治某些癌癥生物導彈 防治某些癌癥生物導彈 把抗癌細胞的單抗與放射性同位素、 把抗癌細胞的單抗與放射性同位素、化療藥物或細胞毒素相結 定向地與癌細胞結合，并在原位殺死該細胞。 合，定向地與癌細胞結合，并在原位殺死該細胞。 應用于方案生育 已勝利制成抗孕酮的單克隆抗體，注射這種抗體， 已勝利制成抗孕酮的單克隆抗體，注射這種抗體，能夠阻擋受 抗孕酮的單克隆抗體 精卵在子宮粘膜上著床，達到長 期避孕的目的。 精卵在子宮粘膜上著床，達到長期避孕的目的。 在器官移植后，消退異體細胞，免除排斥反應， 在器官移植后，消退異體細胞，免除排斥反應，是器官移植存活 率大大提高。 率大大提高。 利用單克隆抗體

23、的特異結合力量，有效地純化酶 利用單克隆抗體的特異結合力量，有效地純化酶、激素和干擾素 等制品。如用單克隆抗體提純干擾素，是產量提高5000倍 等制品。如用單克隆抗體提純干擾素，是產量提高5000倍。 2、疫苗生產 、疫苗的種類傳統(tǒng)疫苗： 第一代疫苗傳統(tǒng)疫苗：減毒活疫苗、滅活疫苗、工程疫苗 第一代疫苗 傳統(tǒng)疫苗 減毒活疫苗、滅活疫苗、 亞基疫苗： 其次代疫苗亞基疫苗：組分疫苗、多糖疫苗、合成肽疫苗 其次代疫苗 亞基疫苗 組分疫苗、多糖疫苗、 核酸疫苗： 第三代疫苗核酸疫苗：表達特定抗原蛋白的核酸(DNA和RNA) 第三代疫苗 核酸疫苗 表達特定抗原蛋白的核酸( 和 ) 疫苗生產的一般程序 滅活

24、 檢定 毒株 毒種 收獲 大量細胞 檢疫 動物 組織 分散 培育 細胞懸液 活疫苗 稀釋 原苗 檢定 接種 滅活疫苗 乙 腦 毒 培育 培育 接種于長成致密單層Vero細胞瓶中 接種于長成致密單層 細胞瓶中 乙腦SA14-14-2 乙腦 無血清維持液， 無血清維持液，35 乙腦病毒液 棄 離 去 心 沉 淀 液 ， 清液 毒 乙腦 毒 0.22m 清液 100,000D ,35 三、植物細胞工程及特點(一)植物細胞的培育特性1、 細胞個體較大 ( 較微生物細胞大的多) , 有纖維細胞壁， 細胞個體較大(較微生物細胞大的多) 有纖維細胞壁， 細胞抗剪切力差； 細胞抗剪切力差； 2、 細胞生長速度

25、較慢 ， 簡單被微生物污染 ， 培育時需添加 細胞生長速度較慢，簡單被微生物污染， 抗生素； 抗生素； 3、細胞培育過程中易聚集成團，較難進行懸浮培育； 細胞培育過程中易聚集成團，較難進行懸浮培育； 4、 培育時需供氧 ， 但培育液黏度較大 ， 不能耐受強力通風 培育時需供氧，但培育液黏度較大， 攪拌； 攪拌； 5、植物細胞具有群體效應及解除抑制性； 植物細胞具有群體效應及解除抑制性； 6、細胞培育產物滯留于細胞內，產量低； 細胞培育產物滯留于細胞內，產量低； 7、植物細胞具有結構和功能全能性。 植物細胞具有結構和功能全能性 全能性。 植物細胞全能性植物的每個細胞都包含著該物種的全 部遺傳信息

26、， 部遺傳信息 ， 從而具備發(fā)育成完整植株 的遺傳力量。在適合條件下， 的遺傳力量 。 在適合條件下 ， 任何一個 細胞都可以發(fā)育成一個新個體。 細胞都可以發(fā)育成一個新個體 。 植物 細 胞全能性是植物組織培育的理論基礎。 胞全能性是植物組織培育的理論基礎。 (二)培育基組成1、基本培育基 基本培育基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培育的物質 基礎，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產物累積時更是如此。 基礎，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產物累積時更是如此。 2、碳源 碳源通常以光自養(yǎng)培育中的CO 碳源通常以光自養(yǎng)培育中的CO2或異養(yǎng)培育中的糖類兩種 形式供應， 形式供應，其性質和數(shù)量往往對培育細胞的生物量有很大 的

27、影響。 的影響。CO2可以誘導某些特征反應，如在金蘋果的懸浮 可以誘導某些特征反應， 細胞培育中，高濃度CO 可產生一種特有的蘋果香味。 細胞培育中，高濃度CO2可產生一種特有的蘋果香味。 植物細胞培育中用法最多的碳源是糖類， 植物細胞培育中用法最多的碳源是糖類，對次級代謝產物 的影響主要取決于所用法的糖類的種類及細胞次級代謝產 物的生物合成過程。 物的生物合成過程。 植物細胞培育基常用的培育基有幾十種。 MS( 下表) 常用的培育基有幾十種 。 如 MS ( 下表 ) 、 B5 、 E1 、 N6 培育基等。其中以MS、 等應用較為廣泛。 培育基等。其中以MS、B5等應用較為廣泛。大量元素(

28、20 大量元素 ) NH4NO3 KNO3 CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4FeSO4 7H2O (200) 用量 (mg/L母液 母液) 母液 33000 38000 8800 7400 3400 5560 7460 20210 400 微量元素(200) 微量元素 KI H3BO3 MnSO4 4H2O ZnSO4 7H2O Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O 煙酸(200) 煙酸 VB1(200) VB6(200) 用量 (mg/L母液 母液) 母液 166 1240 4460 1720 50 5 100 20 100 Na2.EDTA 7H2O 肌醇

29、(200) 肌醇 甘氨酸(200) 甘氨酸 3、植物生長調整劑植物生長調整劑在植物細胞培育中起著特別重要的作用， 植物生長調整劑在植物細胞培育中起著特別重要的作用，可能是關鍵 性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無肯定的規(guī)律可循， 性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無肯定的規(guī)律可循，必需通 過認真的試驗觀看才能確定其合適的數(shù)量和種類。 過認真的試驗觀看才能確定其合適的數(shù)量和種類。 與植物細胞培育和組織培育有關的主要激素：IAA、GA、 與植物細胞培育和組織培育有關的主要激素：IAA、GA、CTK 4、誘導子生產某些植物次級代謝物質需要刺激性物質。 生產某些植物次級代謝物質需要刺激性物質。 植

30、物抗毒素(phytoalexins) 植物抗毒素(phytoalexins)是指在植物防備系統(tǒng)內能對抗微生物進 攻的某些次級代謝產物 依據(jù)其功能又稱為“后感染防備物質” 次級代謝產物( 攻的某些次級代謝產物(依據(jù)其功能又稱為“后感染防備物質”)。 盡管在有些狀況下代謝產物可能會連 續(xù)合成， 盡管在有些狀況下代謝產物可能會連續(xù)合成，但在另外一些狀況下只 有細胞被刺激時才能產生植物抗毒素， 有細胞被刺激時才能產生植物抗毒素，或僅在被誘導時其產量才能增 加。 (三)植物細胞培育技術培育罐類型、通氣、攪拌和培育方法等。 培育罐類型、通氣、攪拌和培育方法等。 1、培育容器 小規(guī)模試驗室培育所用的培育容器

31、 50500ml) 小規(guī)模試驗室培育所用的培育容器(50500ml) 培育容器( 具有較高的氧轉移率，通過簡潔的定期攪拌， 具有較高的氧轉移率 ， 通過簡潔的定期攪拌 ， 培 養(yǎng)物的每個部位均可得到比大規(guī)模培育更好的氧 供應。 供應。 工業(yè)化生產全部培育容器就是大型發(fā)酵罐 500L 工業(yè)化生產全部培育容器就是大型發(fā)酵罐(500L 大型發(fā)酵罐( 以上) 以上)。 2、培育方法 、單細胞培育 從植物組織器官分別得到單細胞， 從植物組織器官分別得到單細胞，在特定條件下可以形成具有不同性 狀的愈傷組織(細胞系) 或者發(fā)育成完整的植株試管苗。 試管苗。 狀的愈傷組織(細胞系),或者發(fā)育成完整的植株 試管

32、苗 懸浮細胞培育 是指單細胞或小的細胞團塊懸浮于培育液中進行生長的過程。 是指單細胞或小的細胞團塊懸浮于培育液中進行生長的過程。主要用 于代謝物的生產，如屬于次級代謝物質，則需加中間體或誘導子等。 于代謝物的生產，如屬于次級代謝物質，則需加中間體或誘導子等。 大規(guī)模細胞培育 類似于微生物發(fā)酵的培育過程，其產物可以是細胞， 類似于微生物發(fā)酵的培育過程，其產物可以是細胞，也可以是代謝產 初級、次級產物) 物(初級、次級產物)。 固定化細胞培育 與前述一樣，是將細胞包埋在固體材料中，細胞保持活性。 與前述一樣，是將細胞包埋在固體材料中，細胞保持活性。下面將詳 細商量。 細商量。 (四)植物細胞培育在

33、制藥中的應用1、三七細胞干粉制備 、三七， 五加科人參屬多年生草本植物， 三七 ， 五加科人參屬多年生草本植物 ， 主產 于云南文山地區(qū)， 是我國珍貴的藥食植物之一， 于云南文山地區(qū) ， 是我國珍貴的藥食植物之一 ， 被譽為“ 人參之王” 金不換” 之名。 被譽為 “ 人參之王 ” , 有 “ 金不換 ” 之名 。 主要 藥效為止血、補血和強身抗衰。 藥效為止血、補血和強身抗衰。 由于生境要求苛刻， 無法廣泛栽種， 由于生境要求苛刻 ， 無法廣泛栽種 ， 利用細 胞培育技術制備三七細胞干粉， 胞培育技術制備三七細胞干粉 ， 可謂三七藥材新 來源。 來源。 三七細胞干粉制備工藝路途消毒 消毒 消

34、毒 70%乙醇 乙醇2min 乙醇 誘導 誘導 誘導 MS培育基，培育 培育基， 培育基 三七外植體0.1%升汞 升汞20min 升汞 種子制備 種子制備 種子制備 無菌粗根2,4-D;CTK;椰乳 椰乳 25,40d 愈傷組織 MS培育液，pH5.55.8,25,120rpm 培育液， 培育液 ， 振搖 大規(guī)模培育 大規(guī)模培育 大規(guī)模培育 培育液同上 種子細胞 10L攪拌罐反應器，25,30d,60rpm攪拌通風 攪拌罐反應器， 攪拌罐反應器 ， 攪拌通風 過濾，干燥 過濾，干燥 過濾 3040真空干燥，或凍干 真空干燥， 懸浮培育液 三七細胞干粉 2、大蒜細胞培育生產SOD 、大蒜細胞培育

35、生產SOD大蒜( 大蒜 ( Allium sativum L.)是 SOD含量較高的自然?植物 ) 含量較高的自然?植物 之一，可由它提取出SOD來生產功能性食品。利用大蒜細 來生產功能性食品。 之一，可由它提取出 來生產功能性食品 胞培育生產SOD具有成本低、有用性強的優(yōu)點，易實現(xiàn)工 具有成本低、 胞培育生產 具有成本低 有用性強的優(yōu)點， 業(yè)化生產規(guī)模。 業(yè)化生產規(guī)模。 基本流程： 基本流程：外植體誘導培育基 愈傷組織大規(guī)模培育 懸浮培育基 懸浮細胞 或組織塊 大量細胞 收集、 收集、破裂 提取、 提取、濃縮 SOD粗品 粗品 SOD功能食品 功能食品 精制 SOD精品 精品 SOD藥品 藥

36、品 大蒜細胞培育生產SOD1、大蒜細胞種質的選擇與處理 、 先將大蒜放在8的低溫環(huán)境中貯藏 個月 以打破其休眠期， 個月， 先將大蒜放在 的低溫環(huán)境中貯藏1個月，以打破其休眠期，取出剝去保 護葉后用無菌水沖洗蒜瓣，再在無菌條件下用70%乙醇漂洗15 護葉后用無菌水沖洗蒜瓣，再在無菌條件下用 %乙醇漂洗 30s,置 ， 取出經(jīng)無菌水沖洗三遍， 于0 .1%的升汞溶液中消毒 %的升汞溶液中消毒8min,取出經(jīng)無菌水沖洗三遍，備用。 取出經(jīng)無菌水沖洗三遍 備用。 2、愈傷組織的誘導 、 蒜瓣切成0.5cm0.3cm0.2cm帶表皮的蒜塊， 接種于盛有愈傷組織誘 帶表皮的蒜塊， 蒜瓣切成 帶表皮的蒜塊

37、 導培育基的三角瓶中，培育溫度25 光照度600lx,每天循環(huán)光照 導培育基的三角瓶中 ， 培育溫度 , 光照度 ， 每天循環(huán)光照12h, , 左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中， 過20d左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中，在相同條件下培 左右移植于盛有愈傷組織增殖培育基的三角瓶中 養(yǎng)20d。如此重復移植培育 5 次。 。如此重復移植培育4 愈傷組織的誘導培育基： %蔗糖，添加0.8%瓊脂， 愈傷組織的誘導培育基：3%蔗糖，添加 %瓊脂，pH5.8。添加 。添加2mg/kg 二氯苯氧乙醇( 的 2,4-二氯苯氧乙醇 ( 植物細胞生長素 ) 和 0.1mg/kg的 6-糠 基氨

38、基嘌呤 二氯苯氧乙醇 植物細胞生長素) 的 糠基氨基嘌呤 植物細胞分裂素)對誘導大蒜愈傷組織的形成有明顯的促進作用。 (植物細胞分裂素)對誘導大蒜愈傷組織的形成有明顯的促進作用。 大蒜細胞培育生產SOD3、大蒜細胞懸浮培育 、 將處于對數(shù)生長期(約培育15d)的大蒜愈傷組織 ， 接種于懸浮培育基 將處于對數(shù)生長期 ( 約培育 ) 的大蒜愈傷組織， 中進行液體培育。培育溫度為25 范圍內， 中進行液體培育 。 培育溫度為 30, pH在56范圍內， 以 28、 在 范圍內 pH5.8為好。 經(jīng)過 的培育后，單細胞和部分小細胞團從結構松散的愈 為好。 的培育后， 為好 經(jīng)過7d的培育后 傷組織上脫

39、落下來， 傷組織上脫落下來，由此獲得的單細胞作為懸浮培育種子進行液體懸浮 擴大培育或深層發(fā)酵。 擴大培育或深層發(fā)酵。 4、大蒜細胞擴大培育 、 最初的大蒜細胞形態(tài)大小不一， 次移種培育后， 最初的大蒜細胞形態(tài)大小不一，經(jīng)34次移種培育后，細胞趨于整齊一 次移種培育后 以圓形或橢圓形為主，可以此為種子液進行深層發(fā)酵擴大培育。 致，以圓形或橢圓形為主，可以此為種子液進行深層發(fā)酵擴大培育。 增殖培育基與誘導培育基相同，只是新添加了 的酪蛋白水解物。 增殖培育基與誘導培育基相同，只是新添加了0.02%的酪蛋白水解物。 的酪蛋白水解物 5、SOD提取純化 、 提取純化 與前面(其次章)的方法相同。 與前面(其次章)的方法相同。 四、細胞固定化技術與細胞反應器1、固定化細胞技術利用物理或化學的手段將游離的細胞定位于限定的空間區(qū)域， 利用物理或化學的手段將游離的細胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其 保持活性并可反復用法的技術稱為細胞的固定化，該細胞稱為固定化 保持活性并可反復用法的技術稱為細胞的固定化，該細胞稱為固定化 細胞。 細胞。 固定化細胞有如下幾方面的優(yōu)點： 固定化細胞有如下幾方面的優(yōu)點： 它不需進行破裂細胞而挺直利用胞內酶，降低了制備成本； 它不需進行破裂細胞而挺直利用胞內酶，降低了制備成本；