流式細(xì)胞檢測技術(shù)講座

1、流式細(xì)胞技術(shù)原理及其在臨床流式細(xì)胞技術(shù)原理及其在臨床&科研中的應(yīng)用科研中的應(yīng)用（Flow Cytometry, FCM)北京利文商貿(mào)有限責(zé)任公司李建廷主要內(nèi)容主要內(nèi)容z 流式細(xì)胞技術(shù)概念z 流式細(xì)胞技術(shù)原理z 流式實驗的設(shè)計z 流式細(xì)胞技術(shù)在臨床&科研上的應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)概述流式細(xì)胞技術(shù)概述z 流式細(xì)胞技術(shù)的概念z 流式細(xì)胞技術(shù)的特點z 流式細(xì)胞儀的檢測范圍z BD公司流式細(xì)胞儀z 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)什么是什么是 FCM ？z 流式細(xì)胞術(shù)：利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析及分選的技術(shù)z 激光技術(shù)+流體力學(xué)+光電測量技術(shù)+計算機技術(shù)+細(xì)胞熒光化

2、學(xué)技術(shù)+單克隆抗體技術(shù)FCM的特點的特點z 測量速度快：最快可在1秒種內(nèi)檢測上萬個細(xì)胞z 可進(jìn)行多參數(shù)測量：可以對同一個細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量z 具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況z 高分辨率(CVPEPerCP-Cy5.5FITCPerCP z 4. 抗原密度 z 高表達(dá)的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測，而較低表達(dá)的抗原（如細(xì)胞因子）則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標(biāo)記的抗體檢測，從而達(dá)到有效區(qū)分陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞的目的。z 如血小板活化檢測試劑：z PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP 熒光抗體組合的選擇熒光抗

3、體組合的選擇z 5. 熒光光譜之間的重疊z 在多色分析中，雖然可以通過熒光補償消除熒光光譜重疊的影響，但使用熒光探針的種類越多，補償?shù)膹?fù)雜程度增加，因此選擇光譜重疊越少的組合越好z 6. 自發(fā)熒光z 每個細(xì)胞群體的自發(fā)熒光水平都不同，自發(fā)熒光在高波長范圍里（600nm）迅速降低。因此檢測自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時，使用發(fā)射光波長較長的熒光染料（如APC），可得到較好的S/N比z 7. 熒光素濃度、配伍不當(dāng)、試劑的質(zhì)量均導(dǎo)致假陰性/ 假陽性結(jié)果z 一個抗體組合內(nèi)的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。盡量選擇同一家公司的試劑可以減少干擾

4、。 常用熒光染料組合常用熒光染料組合z FITCPE：最常用的雙色組合z FITCPEPerCP：最常用的三色組合，進(jìn)行多色熒光染色時熒光光譜重疊補償很小，但PerCP光量子產(chǎn)量并不太高，最好應(yīng)用在檢測表達(dá)較高的抗原上，如CD4/8/3z FITCPEPerCP+APC：最常用的四色組合，一般PE和APC用于檢測表達(dá)較低的抗原上，而FITC和PerCP用于檢測表達(dá)較高的抗原上，如CD3/8/45/4z PerCP-Cy5.5與PE之間的重合光譜范圍很小，也可用于四色組合z PE-Cy7可與FITC、PE、APC標(biāo)記的抗體一同使用，熒光補償小z PE-Cy5可與FITC、PE同時使用，但不能與A

5、PC同時使用，二者之間熒光干擾太大z PE-Texas Red盡量不與PE同時使用，二者之間熒光補償非常大z 臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合，如：z 血小板活化檢測：z 造血干細(xì)胞計數(shù)：z z 但對于白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止尚沒有統(tǒng)一的抗體組合常用單抗組合常用單抗組合熒光抗體PEFITC或PerCP對照管IgG1CD45試驗管CD34CD45熒光抗體FITCPEPerCP對照管PAC-1+RGDSIgG1CD61試驗管PAC-1CD62PCD61小結(jié)小結(jié)z 單細(xì)胞懸液（組織分離過200目濾網(wǎng)，上機前過300-400目濾網(wǎng)）z 盡可能減少死細(xì)胞（比例根據(jù)實驗決定，一般5%）z 染色前細(xì)胞計數(shù)每管細(xì)胞數(shù)為106，體積0.5-1mLz 根據(jù)抗原特性及實驗?zāi)康倪x擇抗體組合z 設(shè)補償對照和