實時定量PCR實驗故障排除.

1、實時定量pcr實驗故障排除擴增曲線原始數(shù)據(jù)spectra：各波長的原始信號沒有標準曲線沒有標準曲線沒有擴增曲線原始數(shù)據(jù)只有1個循環(huán)spectra 只有1個循環(huán)的數(shù)據(jù)原因：1.收集數(shù)據(jù)的步驟只有一個循環(huán)，只收集了一個數(shù)據(jù)點2.電腦為了節(jié)省電源而休眠，通訊中斷，1個循環(huán)后的數(shù)據(jù)丟失原因1：pcr參數(shù)設置錯誤原因2：硬盤休眠從原始數(shù)據(jù)找原因從第1-第9個循環(huán)，rox的信號升高并逐漸下降。在所設定的4-13基線范圍內，rox信號值是變化的，而fam的信號值基本上是固定的，經過fam/rox的校正后，比值自然不相等，所以基線不是水平的直線，而有下滑部分。rox的信號變化與所用試劑的質量有關。應

2、該取10-20為合理的基線范圍。解決方法修改基線范圍為10-20，重新分析。重新分析的結果基線范圍取10-20，重新分析后的圖譜。第1-9循環(huán)的信號為負數(shù)，由于試劑質量引起。增曲線分成兩段擴增曲線斷裂 原因：基線的終點大于ct值，通常是因為模板dna濃度偏高，ct值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分擴增信號，導致標準偏差偏大，閾值過高解決方法：減小基線終點，至ct值前4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)樣品濃度跨度太大直線擴增曲線原因：探針部分降解v形擴增曲線v形擴增曲線v形擴增曲線擴增微弱或者信號很弱rox信號不穩(wěn)定擴增曲線不光滑原因：信號太弱解決方法使用高質量的探針補救方法：1

3、.7000的sds軟件升級到v1.12.關閉rox校正，重新分析數(shù)據(jù)關閉rox校正的效果rox幫助故障診斷(1)現(xiàn)象：重復性很差正常的原始數(shù)據(jù)原因：蓋子未蓋緊，溶液蒸發(fā)排除蒸發(fā)的數(shù)據(jù)后rox幫助故障診斷(2)現(xiàn)象：山坡形擴增曲線原始數(shù)據(jù)顯示有蒸發(fā)引物二聚體sybr green i®化學，dissociation curve試驗推薦措施：提高引物設計質量，避免形成引物二聚體補救措施：優(yōu)化引物濃度和退火溫度也許：專設80度步驟收集信號？書是我們時代的生命別林斯基書籍是巨大的力量列寧書是人類進步的階梯高爾基書籍是人類知識的總統(tǒng)莎士比亞書籍是人類思想的寶庫烏申斯基書籍舉世之寶梭羅好的書籍是最貴重的珍寶別林斯基書是唯一不死的東西丘特書籍使人們成為宇宙的主人巴甫連柯書中橫臥著整個過去的靈魂卡萊爾人的影響短暫而微弱，書的影響則廣泛而深遠普希金人離開了書，如同離開空氣一樣不能生活科洛廖夫書不僅是生活，而且是現(xiàn)在、過去和未來文化生活的源泉 庫法耶夫書籍把我們引入最美好的社會，使我們認識各個