間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病課件

1、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病1間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病2間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（indirect haemagglutination test, iha） 以紅細(xì)胞為載體以紅細(xì)胞為載體吸附預(yù)先制備的特異性抗原或抗體作為試劑吸附預(yù)先制備的特異性抗原或抗體作為試劑檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原血清學(xué)方法血清學(xué)方法特點(diǎn)：抗原與其抗體之間的特異性反應(yīng)特點(diǎn)：抗原與其抗體之間的特異性反應(yīng) 紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病3國(guó)外最早于國(guó)外最早于1955年應(yīng)用于檢測(cè)馬抗血清年應(yīng)用于

2、檢測(cè)馬抗血清國(guó)內(nèi)陶義訓(xùn)等（國(guó)內(nèi)陶義訓(xùn)等（1958）首先應(yīng)用于診斷）首先應(yīng)用于診斷 日本血吸蟲(chóng)病日本血吸蟲(chóng)病楊贊元等（楊贊元等（1976）應(yīng)用冰凍干燥方法）應(yīng)用冰凍干燥方法 制備試劑制備試劑間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病4一、基本概念一、基本概念 （一）凝集反應(yīng)（一）凝集反應(yīng) 是指細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原加入相應(yīng)抗體，是指細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原加入相應(yīng)抗體，并在適量電解質(zhì)存在的條件下，兩者特異性并在適量電解質(zhì)存在的條件下，兩者特異性結(jié)合且進(jìn)一步凝聚成肉眼可見(jiàn)的小塊。結(jié)合且進(jìn)一步凝聚成肉眼可見(jiàn)的小塊。 凝集反應(yīng)分為直接凝集和間接凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)分為直接凝集和間接凝集反應(yīng)。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸

3、蟲(chóng)病5（二）間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（二）間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 原原 理理日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原 載體顆粒載體顆粒綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及o型人紅細(xì)胞型人紅細(xì)胞致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用只能使用23天天致敏前將紅細(xì)胞醛化，可長(zhǎng)期保存而不溶血致敏前將紅細(xì)胞醛化，可長(zhǎng)期保存而不溶血常用的醛類(lèi)有甲醛、戊二醛、丙酮醛常用的醛類(lèi)有甲醛、戊二醛、丙酮醛間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病6（三）間接血凝的類(lèi)型（三）間接血凝的類(lèi)型 iha：用抗原致敏紅細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本中抗體：用抗原致敏紅細(xì)胞檢測(cè)

4、標(biāo)本中抗體反向間接血凝試驗(yàn)：用特異性抗體致敏紅反向間接血凝試驗(yàn)：用特異性抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原間接血凝抑制試驗(yàn)間接血凝抑制試驗(yàn)反向間接血凝抑制試驗(yàn)反向間接血凝抑制試驗(yàn)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病7（正向）間接凝集反應(yīng)（正向）間接凝集反應(yīng)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病8反向間接凝集反應(yīng)反向間接凝集反應(yīng)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病9間接凝集抑制反應(yīng)間接凝集抑制反應(yīng)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病10（一）血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原制備（一）血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原制備 分離蟲(chóng)卵分離蟲(chóng)卵 脫水、脫酯干燥脫水、脫酯干燥 研磨成細(xì)粉研磨成細(xì)粉 凍融凍融 超聲粉碎超聲粉碎 普通離心普通離心

5、 高速離心。高速離心。 經(jīng)離心后的上清液，即為蟲(chóng)卵抗原原液，保存于經(jīng)離心后的上清液，即為蟲(chóng)卵抗原原液，保存于-20-20中備用。中備用。二、凍干致敏紅細(xì)胞的制備二、凍干致敏紅細(xì)胞的制備間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病11理想抗原理想抗原敏感性高，特異性強(qiáng)，能區(qū)別不同感染度，敏感性高，特異性強(qiáng)，能區(qū)別不同感染度，能區(qū)別現(xiàn)在感染還是過(guò)去感染，價(jià)廉。能區(qū)別現(xiàn)在感染還是過(guò)去感染，價(jià)廉。 但目前還沒(méi)有，今后可能依靠雜交瘤技術(shù)、但目前還沒(méi)有，今后可能依靠雜交瘤技術(shù)、dna技術(shù)而獲得理想的抗原。技術(shù)而獲得理想的抗原。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病12取人取人“o”型血紅細(xì)胞型血紅細(xì)胞3份（不同個(gè)體）份（不同個(gè)

6、體）混合混合 ，用生理鹽水洗滌，用生理鹽水洗滌 。置冰浴內(nèi)，將戊。置冰浴內(nèi)，將戊二醛溶液慢慢滴入紅細(xì)胞懸液中，邊加邊二醛溶液慢慢滴入紅細(xì)胞懸液中，邊加邊搖，醛化搖，醛化1h。用。用1/10000的柳硫汞蒸餾水配的柳硫汞蒸餾水配成成10%的紅細(xì)胞懸液，置于的紅細(xì)胞懸液，置于4備用。備用。（二）紅細(xì)胞醛化（二）紅細(xì)胞醛化間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病13 醛化紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)醛化紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)克服了個(gè)體差異，保證實(shí)驗(yàn)重復(fù)性克服了個(gè)體差異，保證實(shí)驗(yàn)重復(fù)性延長(zhǎng)紅細(xì)胞的保存時(shí)間，在延長(zhǎng)紅細(xì)胞的保存時(shí)間，在4可保存可保存1年年避免操作過(guò)程中因振蕩、低滲、凍融使紅細(xì)避免操作過(guò)程中因振蕩、低滲、凍融使紅細(xì)胞破裂、溶血胞

7、破裂、溶血間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病14取取1/10000鞣酸溶液與等量鞣酸溶液與等量2.5%紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液混勻，置于混勻，置于37 中中15min，并不斷搖動(dòng)。洗，并不斷搖動(dòng)。洗滌，去除多余的鞣酸。滌，去除多余的鞣酸。（三）紅細(xì)胞鞣化（三）紅細(xì)胞鞣化間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病15鞣化紅細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)鞣化紅細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)鞣化后紅細(xì)胞易吸附蛋白抗原。鞣化后紅細(xì)胞易吸附蛋白抗原。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病16取蟲(chóng)卵抗原原液取蟲(chóng)卵抗原原液1:100稀釋?zhuān)c稀釋?zhuān)c2.5%的鞣化紅的鞣化紅細(xì)胞等量混合，置于細(xì)胞等量混合，置于37水浴中水浴中30min，并不斷搖，并不斷搖動(dòng)，然后離心，洗滌，去

8、除多余抗原。動(dòng)，然后離心，洗滌，去除多余抗原。用含有用含有5%蔗糖及蔗糖及1%正常兔血清（正常兔血清（56滅活）滅活）的的ph7.2pbs保護(hù)液，配成保護(hù)液，配成10%濃度的致敏紅細(xì)胞濃度的致敏紅細(xì)胞懸液。懸液。致敏效果與抗原的活性及純度有關(guān)。致敏效果與抗原的活性及純度有關(guān)。（四）紅細(xì)胞致敏（四）紅細(xì)胞致敏間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病17將上述致敏紅細(xì)胞懸液搖勻，分裝于將上述致敏紅細(xì)胞懸液搖勻，分裝于2ml安瓿安瓿內(nèi)。每支內(nèi)。每支0.4ml，立即放入，立即放入-40冰箱冰凍，待全部冰箱冰凍，待全部分裝完畢后，移入冰凍干燥機(jī)內(nèi)，冰凍干燥約分裝完畢后，移入冰凍干燥機(jī)內(nèi)，冰凍干燥約24h，干燥后封

9、口，保存于干燥后封口，保存于4中備用。中備用。冰凍干燥具有高科技含量不是單純干燥，在冰冰凍干燥具有高科技含量不是單純干燥，在冰凍狀態(tài)下使水分子升華，不使紅細(xì)胞破裂，不影凍狀態(tài)下使水分子升華，不使紅細(xì)胞破裂，不影響抗原活性。響抗原活性。（五）致敏紅細(xì)胞的冰凍干燥（五）致敏紅細(xì)胞的冰凍干燥間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病18三、操作步驟三、操作步驟（一）取生理鹽水（一）取生理鹽水2ml，加入裝有冰凍干，加入裝有冰凍干燥紅細(xì)胞的安瓿中，配成燥紅細(xì)胞的安瓿中，配成2.0%的紅細(xì)胞的紅細(xì)胞懸液，搖勻。懸液，搖勻。（二）在（二）在“v”型微量血凝反應(yīng)板的第型微量血凝反應(yīng)板的第1孔孔中加生理鹽水中加生理鹽水1

10、00l, 第第2、3孔中各加孔中各加25l。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病19（三）第（三）第1孔中加待檢血清孔中加待檢血清25l，混勻后吸，混勻后吸出出25l加于第加于第2孔中，在第孔中，在第2孔中混勻后，吸孔中混勻后，吸出出25l加于第加于第3孔中，混勻后棄去孔中，混勻后棄去25l。此時(shí)。此時(shí)第第1、2、3孔中的血清稀釋度依次為孔中的血清稀釋度依次為1:5 、1:10 、1:20。（四）在第（四）在第2、第、第3孔中各加致敏紅細(xì)胞懸液孔中各加致敏紅細(xì)胞懸液25l，將反應(yīng)板放在振蕩器上振蕩，將反應(yīng)板放在振蕩器上振蕩1min，室，室溫下靜置溫下靜置45min，觀(guān)察反應(yīng)結(jié)果。，觀(guān)察反應(yīng)結(jié)果。間接

11、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病20四、反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)四、反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)（一）陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞全部下沉在（一）陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞全部下沉在凹底部，形成緊密的圓點(diǎn)，周?chē)R凹底部，形成緊密的圓點(diǎn)，周?chē)R清晰。清晰。 （二）陽(yáng)性反應(yīng)：待檢者血清以（二）陽(yáng)性反應(yīng)：待檢者血清以1:10稀釋度出現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽(yáng)性起點(diǎn)稀釋度出現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽(yáng)性起點(diǎn)間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病21（三）反應(yīng)強(qiáng)度（三）反應(yīng)強(qiáng)度“-”：紅細(xì)胞全部下沉在凹底部，形成緊密：紅細(xì)胞全部下沉在凹底部，形成緊密的的 圓點(diǎn)，周?chē)R清晰圓點(diǎn)，周?chē)R清晰“+”：多數(shù)紅細(xì)胞下沉在凹底部形成圓點(diǎn)，：多數(shù)紅細(xì)胞下沉在凹底部形成圓點(diǎn)，周?chē)梢?jiàn)少量凝集紅細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)少

12、量凝集紅細(xì)胞“+”：凹底部可見(jiàn)明顯的紅點(diǎn)，凝集紅細(xì)：凹底部可見(jiàn)明顯的紅點(diǎn)，凝集紅細(xì)胞在底部形成小薄層胞在底部形成小薄層間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病22“+”：凹底部可見(jiàn)很弱的紅點(diǎn)，紅細(xì)胞呈：凹底部可見(jiàn)很弱的紅點(diǎn)，紅細(xì)胞呈疏松的顆粒凝集疏松的顆粒凝集“+”：紅細(xì)胞呈明顯的顆粒凝集，均勻：紅細(xì)胞呈明顯的顆粒凝集，均勻散布于凹底部周?chē)纬杀樱袝r(shí)呈皺褶狀散布于凹底部周?chē)纬杀?，有時(shí)呈皺褶狀效價(jià)效價(jià)(滴度滴度)：發(fā)生凝集現(xiàn)象最高的血清稀釋度。發(fā)生凝集現(xiàn)象最高的血清稀釋度。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病23五、影響因素及注意事五、影響因素及注意事（一）試劑：保存、對(duì)照、效價(jià)、搖勻。（一）試劑：保存

13、、對(duì)照、效價(jià)、搖勻。 （二）反應(yīng)板：（二）反應(yīng)板：“v”型，底角應(yīng)為型，底角應(yīng)為90。反復(fù)沖洗。反復(fù)沖洗。（三）毛細(xì)吸管：校正、垂直。（三）毛細(xì)吸管：校正、垂直。（四）血清樣本：新鮮為宜，保存在冰盒（四）血清樣本：新鮮為宜，保存在冰盒內(nèi)。溶血樣本將影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。內(nèi)。溶血樣本將影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病24（五）生理鹽水：用于稀釋?zhuān)ㄎ澹┥睇}水：用于稀釋iha試劑、陽(yáng)試劑、陽(yáng)參、陰參、血清樣本的生理鹽水必須保參、陰參、血清樣本的生理鹽水必須保持無(wú)菌。持無(wú)菌。（六）判斷反應(yīng)結(jié)果：在判斷反應(yīng)結(jié)果（六）判斷反應(yīng)結(jié)果：在判斷反應(yīng)結(jié)果時(shí)應(yīng)在反應(yīng)板下面襯一張白紙，使反應(yīng)時(shí)應(yīng)

14、在反應(yīng)板下面襯一張白紙，使反應(yīng)結(jié)果更加清晰。先觀(guān)察空白對(duì)照、陰參、結(jié)果更加清晰。先觀(guān)察空白對(duì)照、陰參、陽(yáng)參，再觀(guān)察樣本。陽(yáng)參，再觀(guān)察樣本。間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲(chóng)病25六、評(píng)價(jià)六、評(píng)價(jià)iha的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，陽(yáng)性符合率在敏感性高，陽(yáng)性符合率在90%以上，對(duì)糞檢陽(yáng)以上，對(duì)糞檢陽(yáng)性者可高達(dá)性者可高達(dá)95%，假陽(yáng)性率一般不超過(guò)，假陽(yáng)性率一般不超過(guò)4%。操作方便，用血量少，便于現(xiàn)場(chǎng)使用。操作方便，用血量少，便于現(xiàn)場(chǎng)使用。試劑生產(chǎn)方便，成本低，符合國(guó)情。試劑生產(chǎn)方便，成本低，符合國(guó)情。iha的缺點(diǎn)：的缺點(diǎn)：特異性欠強(qiáng)、與其它吸蟲(chóng)有較高的交叉反應(yīng)。特異性欠強(qiáng)、與其它吸蟲(chóng)有較高的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)主要在肺吸蟲(chóng)感染，可達(dá)交叉反應(yīng)主要在肺吸蟲(chóng)感染，可達(dá)50%以上。以上。間接紅細(xì)胞凝集試