實驗六抗菌藥物的體外藥效試驗

1、實驗六、抗菌藥物的體外藥效試驗（藥敏試驗）各種病原菌對抗菌藥物的敏感性不同，同種細菌的不同菌株對同一藥物的敏感性有差異，檢測細菌對抗菌藥物的敏感性，可篩選最有療效的藥物，用于臨床對控制細菌性傳染病的流行至關(guān)重要。此外，通過藥物敏感試驗可為新抗菌藥物的篩選提供依據(jù)。藥敏試驗的方法很多，普遍使用的有濾紙片擴散試驗（kirby-baueer dice diffusion）；最低抑菌濃度試驗（minimum inhibitory concentration, mic）和最低殺菌濃度試驗（minimum bactericidal concentration, mbc）。目的要求1、熟悉體外抗菌試驗操作技

2、術(shù)。2、掌握藥物抗菌能力體外測定的常用方法及其用途。實驗原理常用的體外測定藥物抑菌能力的方法有兩大類：瓊脂滲透法與濃度系列稀釋法。瓊脂滲透法時利用藥物能夠滲透至瓊脂培養(yǎng)基的性能，將實驗菌混入瓊脂培養(yǎng)基后傾注成平板；或?qū)⒃囼灳鶆蛲坑诃傊桨宓谋砻?，然后用不同的方法將藥物置于已含試驗菌的瓊脂平板上。根?jù)加藥的操作方法不同而有濾紙片法、打洞法、管碟法及挖溝法等。經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后觀察藥物的抑菌能力。濃度系列稀釋法時把藥物稀釋成不同的系列濃度，混入培養(yǎng)基內(nèi)，加入一定量的試驗菌，經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后觀察結(jié)果，求得藥物的最低抑菌濃度（mic）。1、細菌：所用細菌應(yīng)包括主要致病菌。革蘭氏陽性球菌包括金黃色葡萄球

3、菌(產(chǎn)酶與不產(chǎn)酶菌株)、表皮葡萄球菌，鏈球菌、腸球菌等。革蘭氏陰性球菌如淋球菌等。革蘭氏陰性桿菌包括流感桿菌、腸桿菌科細菌810種，綠膿桿菌與其它假單孢菌屬及不動桿菌屬等，厭氧菌包括脆弱類桿菌、消化球菌和消化鏈球菌等。對臨床應(yīng)用有代表性的菌株數(shù)量，創(chuàng)新藥應(yīng)不小于1000株。其它類新藥根據(jù)新藥抗菌譜寬窄可作200-500株。試驗時應(yīng)包括有國際公認質(zhì)控菌株(如金葡菌atcc25925，大腸桿菌atcc25922和綠膿桿菌atcc27853等)。 2、培養(yǎng)基：選mh(muelkr-hintop)培養(yǎng)基。鏈球菌、流感桿菌需接種到巧克力瓊脂平板或加5羊血。淋球菌接種到哥倫比亞培養(yǎng)基上。 3、藥物配制：試

4、驗樣品與陽性對照藥品均應(yīng)用稱重法求出效價并按鹽基比例折算出實際效價。所試藥物用磷酸緩沖液或滅菌注射用水溶解，配制成溶液。少數(shù)難溶藥物可加少許相應(yīng)助溶劑，再用緩沖液或滅菌注射用水稀釋至所需濃度。4、試驗方法： 最小抑菌濃度(mic)測定法，采用平皿或試管二倍稀釋法測無細菌生長平皿或試管中所含藥物的最小濃度即為最小抑菌濃度。 最小殺菌濃度（mbc）測定法，先測出mic，再依次存未見細苗生長各管培養(yǎng)物分別吸取0.1ml，傾倒于平皿上，37再培養(yǎng)18小時，平皿上菌落數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度。 殺菌曲線（kcs）實驗 ，將所試菌液約105菌落計數(shù)單位(cfuml)與抗菌藥物混合，

5、定量取樣于平皿培養(yǎng)基，孵育后計算其活菌數(shù)，并繪制出時間殺菌曲線。實驗應(yīng)設(shè)空白對照管與已知藥物對照試驗。 5、培養(yǎng)條件對mic的影響： ph值的影響，將培養(yǎng)基的ph調(diào)整，測定藥物對所試細菌(臨床常見致病菌)12株mic的影響。 細菌接種量的影響, 在其它條件不變時改變細菌接種量，比較不同菌量對mic的影響。 血清蛋白結(jié)合的影響：如采用25、50、75等不同的血清濃度與不含血清的培養(yǎng)基觀察血清含量對mic的影響。試驗內(nèi)容（一） 濾紙片法（圓紙片擴散試驗） 材料無菌平皿1只, 無菌1ml吸管1支,無菌小濾紙片, 待檢藥（1個平板可做1種或多種藥物實驗）, 瓊脂培養(yǎng)基（瓶裝或定量分裝1520ml于大試

6、管，滅菌，備用）, 實驗菌肉湯培養(yǎng)基，鑷子，95酒精等。方法 瓊脂培養(yǎng)基置于水浴中加熱融化，冷卻至50左右，用無菌操作法吸取菌液（制備每只平板約需0.10.2ml）加入瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，傾注于無菌平皿內(nèi)，素轉(zhuǎn)動平皿使細菌均勻分布其中，水平放置待凝（也可預(yù)先在平皿中鋪一層瓊脂培養(yǎng)基作底層，冷卻后再加一薄層含菌瓊脂培養(yǎng)基，如此，可使抑菌圈更加清晰）。 鑷子沾酒精后通過火焰，燒灼滅菌，反復(fù)3次，鑷取無菌濾紙片，浸沾藥液，貼于平板表面，各紙片間的距離藥大致相等。37培養(yǎng)一晝夜后，觀察此濾紙片周圍有無抑菌圈，并量取其直徑。抑菌圈即無菌生長區(qū)，藥液在一定濃度范圍內(nèi)，抑菌圈的大小表示抑菌作用的強弱。結(jié)

7、果判定根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，來判斷該菌對各種藥物的敏感程度。依次可分為：高度敏感，中毒敏感，低度敏感，不敏感四種。細菌對磺胺類藥物的敏感度的標準，按hawking所定，若磺胺藥物濃度在每毫升10g即能抑制細菌生長者，則該細菌對磺胺藥很敏感；如需每毫升50g才能抑制生長，為敏感；每毫升1000g才能抑制為中度敏感；每毫升超過1000g仍不能抑菌者，則為耐藥菌株。 （二） 試管稀釋法材料菌種：金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物；培養(yǎng)基：普通肉湯；抗菌藥物：含青霉素64iu/ ml；其他材料：麥氏比濁管，滅菌1 ml刻度吸管，橡皮膠頭，無菌試管。方法以葡萄球菌對青霉素的敏感性為例。將1ml/

8、管排成一列，編上19的管號，在第一個管內(nèi)加入含64iu/ ml青霉素肉湯1 ml?；靹蚝笪? ml到第二管，混勻，再取1 ml至第3管，以此類推至第八管。第9管不含青霉素的肉湯做為對照管。然后每管加入0.1 ml含菌當量相當于麥氏比濁管第1管1/2的金黃色葡萄球菌（相當于1.5億/ ml），操作術(shù)式見表 試管號123456789藥物濃度（g）321684210.50.25肉湯（ml）111111111青霉（ml）11111111 棄1ml細菌（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1（三）平板稀釋法材料無菌平皿，5 ml無菌吸管，1 ml無菌吸管，10 ml無菌吸管，無菌

9、試管，待檢藥液，滅菌蒸餾水，緩沖液（ph依藥物穩(wěn)定性而定），實驗菌肉湯培養(yǎng)物，瓊脂培養(yǎng)基（大試管定量分裝成9 ml/支）。 方法1、細菌蒸餾水或緩沖液把待檢藥液配成一系列濃度梯度：1：1，1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，（方法同試管稀釋法中的二倍稀釋）。 2、將每種濃度的待檢藥液1 ml，加入9ml5055瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻傾注于無菌平板中，制成一系列藥物濃度遞減的平板。3、對照不加藥液，即將培養(yǎng)基直接傾入無菌平皿，待冷凝即成。4、將不同試驗菌經(jīng)適當稀釋后，點種再含藥平板及對照平板上，接種量約為10cfu/點(colony-forming un

10、it,cfu菌落形成單位)。5、37培養(yǎng)1824小時后，觀察藥物對試驗的最大稀釋度，再乘以10，得出最大抑制稀釋度（即mic）。 注意事項 1、實驗中所用試管、吸管。棉簽、鑷子、紙片及各種藥液配制均應(yīng)無菌，并按照生物實驗常規(guī)進行操作。 2、濾紙片法：到平板時，平板中瓊脂培養(yǎng)基的厚薄需均勻一致，以免影響抑菌圈大小。瓊脂板的厚度可影響抑菌圈的大小，一般為23mm。制備含菌平板時，應(yīng)特別注意混入菌液時的溫度，不能太高，以免燒死細菌。菌液和培養(yǎng)基混合后應(yīng)迅速搖勻，使均勻分布。培養(yǎng)溫度和時間以37、18小時最佳，要求溫度均勻。培養(yǎng)石匠過場可能影響抑菌圈的清晰度。濾紙片沾取藥液時不要太多，以免再平板中流淌

11、，影響抑菌圈形狀和大小。 3、試管稀釋法：稀釋的準確性 每稀釋一種濃度換一支吸管，較一支吸管稀釋到底準確些。加入菌液的濃度 菌液濃度大時，則最小抑菌濃度藥高，反之亦然。菌齡 一般認為幼齡菌較敏感，所以多用細菌的6小時培養(yǎng)液。思考題1、怎樣判斷最后的結(jié)果時抑菌還是殺菌？抑菌濃度大還是殺菌濃度大？2、用試管稀釋法測定藥物的最低抑菌濃度時，主要有哪些因素影響試驗結(jié)果？3、如藥物是一種脂溶性或不太溶于水的物質(zhì)，是否也可以測定其最定抑菌濃度？如可以，如何進行？ 4、比較青霉素g鈉、慶大霉素、丁胺卡那霉素、頭孢呋新、諾氟沙星在體外抑菌的強弱。5、體外篩選具有抗菌作用的藥物能否直接應(yīng)用于臨床? 為什么?實驗

12、七、抗菌藥物的體內(nèi)藥效觀察在體外實驗中呈現(xiàn)抗菌作用的藥物還可能由于毒性大或體內(nèi)過程、代謝動力學(xué)等原因，在體內(nèi)發(fā)揮不出抗菌效果，需進一步了解其對感染動物是否有效。體內(nèi)實驗不僅測定敏感性，還包括影響新藥治療的其他的變化因素，如宿主反應(yīng)，藥物到達感染部位的能力，藥物的滅活等。如果在體內(nèi)也有效，且毒性不大，才有可能過渡到臨床，另外，還應(yīng)注意許多體外無抗菌作用的中草藥用于治療感染性疾病可能會有較好療效。實驗?zāi)康?、了解細菌感染實驗治療方法的基本過程；2、觀察青霉素的體內(nèi)抗菌作用及ed50的測定。實驗材料1、實驗動物及選擇原則：小白鼠30只（1822g）；選用有合格證動物提供的健康小鼠，體重1822g，雌

13、雄各半，隨機分組，每組動物至少10只。2、實驗器材及藥品等：注射器(1ml)；小試管；試管架；mh培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌液；5胃膜素懸液；青霉案g鈉；2.5碘酊；70乙醇；5石炭酸溶液。3、感染菌種：根據(jù)所試藥物的抗菌作用特點選擇不同菌株進行試驗。常用致病菌如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、腸桿菌、氏肺炎桿菌、桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌等。試驗廣譜抗生素時感染菌株應(yīng)包括金葡菌與革蘭氏陰性菌各l2種。創(chuàng)新與陰性菌均需作2種以上，每一種菌2株以上，并包括有臨床分離的致病菌。方法1、菌液制備：將保存的金黃色葡萄球菌接種mh培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)，16-18小時。用平皿表面計數(shù)法測定實驗感染用的活菌

14、數(shù)(如條件一致，則不必每次測定)。將上述菌液用生理鹽水以10倍順序稀釋為10-1、10-2、10-3等不同濃度菌液；再取此不同濃度的菌液1ml加5胃膜素懸液9ml。即做成濃度力10-2、10-3、10-4.的菌懸液用。藥物名稱劑 量（mg/kg）對數(shù)劑量 x動物數(shù)(只)死亡動物數(shù)（只）ed50和95可信限受試藥物對照藥物2、預(yù)試驗：將不同濃度的菌懸液分別腹腔注射于35只小鼠，每只0.5ml，觀察其死亡情況。正式實驗時選用最小致死量，即感染后引起小鼠80-100死亡的菌液濃度進行感染。常用的病菌的參考用量見本實驗附錄。肺炎鏈球菌和鏈球菌的腹腔感染可不用胃膜素稀釋，而是將在血清mh培養(yǎng)基中培養(yǎng)16

15、-18小時的菌液腹腔注射0.20.5m1，觀察24-48動物死亡情況。感染菌量：感染前需先測出所試菌株的最小致死量(mld)，即能引起80-00動物死亡的菌液濃度)作為感染菌量。感染途徑：菌源液用5胃膜素(或干酵母)稀釋至所需濃度，經(jīng)腹腔或尾靜脈注射相當于100致死量的菌液感染小鼠。3、實驗治療：取1822g的小鼠30只。雌雄均可，雌者須無孕。按性別體重隨機分為6組，每組10只。用預(yù)試中選定并適當稀釋的菌懸液，每鼠腹腔注射0.1ml，以感染各組小鼠。第1-5組于感染的同時及感染后6小時肌內(nèi)注射不同劑量青霉素，劑量分別為20萬u、40萬u、98萬u、6.9萬u、4.8萬ukg體重(亦可實驗前根據(jù)

16、細菌敏感情況調(diào)整用量)。連續(xù)觀察7天，記錄各組小鼠死亡情況。計算半數(shù)有效量數(shù)(ed50)及95可信限。實驗必需設(shè)不給藥組與已知同類藥物陽性對照組。注意事項1、本實驗須按照生物實駐中處理感染動物常規(guī)進行，嚴防菌液污染。2、實驗樣結(jié)束后，應(yīng)將全部接種過菌液的動物不淪死活進行焚化或丟入置有5石炭酸溶液的缸內(nèi)，用肥皂洗手后用碘酊及酒精擦手，以防傳播疫病。報告要點 實驗結(jié)果按下表填寫并計算該藥的半數(shù)有效量(ed50)及95可信限。并根據(jù)其半數(shù)致死量計算治療指數(shù)。治療指數(shù)=ld50/ed50思考題1、抗菌藥物的體內(nèi)抗菌實驗包括哪些基本步驟？應(yīng)如何進行?2、治療指數(shù)有何意義？附1：5胃膜素懸液制備法稱取胃膜素5g放于研缽內(nèi)，加少量生理鹽水研磨，邊研邊加水，最后加至100ml，于10磅加壓10分鐘滅菌即可。臨用時調(diào)整其ph至中性。附2：活菌數(shù)測定法將培養(yǎng)基的菌懸液依10倍順序稀釋使其濃度為10-1，10-2、10-3、.10-（即以9ml無菌生理鹽水加1ml菌懸液為10-1，依次累推）選求適當濃度的菌懸液0.1ml放在mh瓊脂培養(yǎng)基平板上，輕輕推開菌液，注意不要碰到平板邊緣，以免影響計數(shù)。共作作3個平皿，都放入37孵箱，培養(yǎng)1820小時后計算菌落群數(shù)。平板玻璃蓋可換為瓦蓋(因瓦改能吸水，可免細菌在平板上繁殖成一片)。挑選