蛋白質(zhì)與酶工程復(fù)習(xí)資料

1、2010級(jí)生物技術(shù)蛋白質(zhì)與酶工程復(fù)習(xí)資料蛋白質(zhì)與酶工程概述1 相關(guān)概念、2 蛋白質(zhì)工程概述、3 酶工程概述一、 相關(guān)概念1、工程：根據(jù)科學(xué)原理和有關(guān)技術(shù)，組合出高效、合理的技術(shù)系統(tǒng)，它除了要考慮技術(shù)的先進(jìn)性和可行性，還要考慮成本和質(zhì)量，做到經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、美觀，要考慮對(duì)環(huán)境的影響，以避免污染它的成功有賴于多種科學(xué)技術(shù)的綜合集成和科學(xué)的管理2、生物工程( Bioengineering, Biologic engineering)：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)，是現(xiàn)代生物學(xué)中一切工程技術(shù)的總稱(chēng)，包括：遺傳工程（基因工程）、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、微生物

2、工程(發(fā)酵工程)、酶工程(生化工程)、生物反應(yīng)器工程3、細(xì)胞工程（cell engineering ）：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和工程學(xué)的原理和技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上，通過(guò)細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器移植或染色體操作，有目的地制造特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的一門(mén)生物技術(shù)（如：改良生物品種，創(chuàng)造新品種，加速繁育動(dòng)植物個(gè)體，或獲得某種有用的物質(zhì)）。在細(xì)胞水平上動(dòng)手，也稱(chēng)細(xì)胞操作技術(shù)。狹義的細(xì)胞工程：指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣義的細(xì)胞工程：所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)（動(dòng)植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、核移植和胚胎移植技術(shù)等）二、比較不同的工程三、 蛋白

3、質(zhì)工程1、定義：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)理化和DNA重組等方法對(duì)基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行有目的地設(shè)計(jì)、改造和修飾，最終獲得滿足人類(lèi)生產(chǎn)和生活需求的新型蛋白質(zhì)（天然蛋白質(zhì)的改造，或是純新蛋白質(zhì)）2、研究?jī)?nèi)容：（1）通過(guò)定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等技術(shù)，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)（2）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。此利于從aa序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，以設(shè)計(jì)合成具有特定功能的全新蛋白質(zhì)。具體包括：蛋白質(zhì)分離純化、結(jié)構(gòu)功能分析、設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)；通過(guò)基因重組或其它手段改造或創(chuàng)造蛋白質(zhì) 3、蛋白質(zhì)工程原理：中心法則、中心法則的逆推4、蛋白質(zhì)工程與基因工程的

4、關(guān)系 1）都以中心法則為根本的理論基礎(chǔ) 2）蛋白質(zhì)工程是基因工程的發(fā)展，“第二代基因工程” 3）基因工程是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)工程的重要手段 4）蛋白質(zhì)工程通過(guò)基因工程加速著蛋白質(zhì)的進(jìn)化過(guò)程5、蛋白質(zhì)工程的目的和主要內(nèi)容 1）目的： 以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過(guò)修飾和合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更符合人類(lèi)需要的新型蛋白質(zhì) 2）蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析：收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息，建立結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，為闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)：根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)一

5、段氨基酸序列的空間結(jié)構(gòu)和功能；反之，也可根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的創(chuàng)造和改造：理化法、生化方法基因重組或人工合成DNA：既可改造蛋白質(zhì)也可從頭合成全新蛋白質(zhì) 3）蛋白質(zhì)工程的基本類(lèi)型從頭合成 理論上：可設(shè)計(jì)合成滿足人類(lèi)需要的各種蛋白質(zhì) 實(shí)際上：要生產(chǎn)這樣的全新蛋白并不容易，技術(shù)不成熟，目前只能合成一些很短小的肽局部修飾或改造：常用，目前主要集中在該領(lǐng)域基因水平的改造：增減一些編碼序列；其前提是知道改變哪些序列可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)性狀的改變；相對(duì)容易蛋白質(zhì)水平的改造：對(duì)生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、加工（磷酸化，糖基化等）?；瘜W(xué)修飾的條件劇烈，且無(wú)特異性，且對(duì)每批蛋白都要進(jìn)

6、行操作，故繁瑣具體方法舉例：隨機(jī)突變【方法：易錯(cuò)PCR、基因改組（DNA shuffling）、基因家族改組（DNA family shuffling)優(yōu)點(diǎn)：在體外模擬自然進(jìn)化的過(guò)程】、定位突變【在已知DNA序列中替換、插入或刪除一定長(zhǎng)度的核苷酸片段。優(yōu)點(diǎn)：突變率高，簡(jiǎn)單易行和重復(fù)性好。方法：*寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?nèi)绾惺酵?cassette mutagenesis)又稱(chēng)片段取代法(DNA fragment replacement)，利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列】、蛋白質(zhì)融合6、 蛋白質(zhì)工程的基本工序1）首先明確所需要的蛋白質(zhì)的特性2）根據(jù)3D結(jié)構(gòu)

7、與生物活性的規(guī)律，設(shè)計(jì)具有上述特性的蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)3）根據(jù)aa序列決定蛋白質(zhì)特定的3D結(jié)構(gòu)的內(nèi)在規(guī)律，設(shè)計(jì)出具有該3D結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的aa序列和編碼之的基因序列4）通過(guò)基因定位突變或其它方法獲得上述基因序列5）通過(guò)基因工程方法獲得該新蛋白6）主要困難：對(duì)aa序列決定蛋白質(zhì)特定的3D結(jié)構(gòu)的內(nèi)在規(guī)律、 3D結(jié)構(gòu)與生物活性之間的確切關(guān)系缺乏足夠的了解7、 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用舉例1）定點(diǎn)突變與蛋白質(zhì)藥物工程：如胰島素2）以融合蛋白形式提高活性3）定點(diǎn)突變提高酶的穩(wěn)定性4）抗體工程：嵌合抗體和生產(chǎn)人源化的抗體等8、蛋白質(zhì)工程小結(jié)1）蛋白質(zhì)工程匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等多學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的最新成就2）它把核酸

8、與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來(lái)研究，開(kāi)創(chuàng)了按照人類(lèi)意愿改造、創(chuàng)造符合人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期 3）它將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時(shí)代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開(kāi)拓了誘人的前景四、酶工程（Enzyme Engineering）1、酶及酶工程的定義1）酶（enzyme)生物催化劑（biocatalyst）由活細(xì)胞產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)、外對(duì)其特異底物起高效催化作用本質(zhì)是蛋白質(zhì)和RNA 2）生物催化（Biocatalysis）：利用酶或有機(jī)體（細(xì)胞或細(xì)胞器等）作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程3）酶工程定義：是由酶學(xué)理論與化學(xué)工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門(mén)新

9、的技術(shù)學(xué)科，是現(xiàn)代生物技術(shù)的主要組成部分之一；它從應(yīng)用的角度，研究酶的生產(chǎn)及其在各方面的應(yīng)用，即是酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程2、酶的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)和RNA，故分為蛋白質(zhì)酶（proteozyme,P酶）：是主要的一類(lèi)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種；數(shù)百種酶得到結(jié)晶，可作用于蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等。核酸類(lèi)酶（ribozyme,核酶，R酶）：也稱(chēng)酶RNA、類(lèi)酶RNA；為數(shù)不多，主要作用于核酸（DNA和RNA）；主要是切割，有些具RNA連接酶、磷酸酶等活性；也作用于多糖等與P酶相比，其催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。3、酶的兩個(gè)特點(diǎn)和一個(gè)優(yōu)點(diǎn)兩個(gè)特點(diǎn)：高效和專(zhuān)一。高效：指酶強(qiáng)大的催化能力；專(zhuān)一：一種酶只作用于具有

10、一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（底物）一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：常溫、常壓下發(fā)揮作用4、酶工程應(yīng)用：利用酶的催化作用進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化-合成有用物，分解有害物；目前主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域5、酶工程任務(wù)：通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，再由人工操作而獲得大量所需的酶，并通過(guò)各種方法使酶發(fā)揮最大的催化功能。因?yàn)槊甘歉咝?、?zhuān)一地催化特定化學(xué)反應(yīng)，并且反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物容易純化，因此，酶促反應(yīng)能耗低、污染小、操作簡(jiǎn)單、容易控制。故而較之傳統(tǒng)的化工反應(yīng)，具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力6、酶工程的主要內(nèi)容：酶制劑的來(lái)源酶的制備酶和細(xì)胞固定化酶分子改造（又稱(chēng)：酶分子修飾）有機(jī)介質(zhì)中的酶反應(yīng) 酶?jìng)鞲衅鳎ㄓ址Q(chēng)酶電極）酶反應(yīng)器酶技術(shù)的應(yīng)用研究7、酶

11、工程發(fā)展史（小結(jié)）酶工程是在人類(lèi)原始的應(yīng)用酶的催化作用的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來(lái)的50年代酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用有了迅速發(fā)展，這一時(shí)期主要是溶液酶的應(yīng)用60年代出現(xiàn)固定化酶技術(shù)，并很快應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)70年代出現(xiàn)固定化細(xì)胞（產(chǎn)酶的細(xì)胞）等技術(shù)，發(fā)展了包括輔助因子再生的固定化多酶反應(yīng)體系的研究80年代以來(lái)出現(xiàn)并應(yīng)用了酶修飾技術(shù)及基因工程蛋白質(zhì)與酶工程之酶學(xué)基本理論一、酶學(xué)基本理論1-1 酶的概念1）酶的現(xiàn)行定義:是由活細(xì)胞產(chǎn)生、在細(xì)胞內(nèi)外均對(duì)其特異底物起高效催化作用的生物催化劑，包括蛋白質(zhì)和RNA，分別稱(chēng)為P酶和R酶2）據(jù)其是天然存在、還是誘導(dǎo)后出現(xiàn)，分為： （1）結(jié)構(gòu)酶(固有酶)：細(xì)胞中天然存在的酶 （2

12、）誘導(dǎo)酶：當(dāng)細(xì)胞遇到特定情況后（如誘導(dǎo)劑）誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶1-2 酶的催化作用及特點(diǎn)1）酶所催化的反應(yīng)稱(chēng)為酶促反應(yīng),在酶促反應(yīng)中被催化的物質(zhì)稱(chēng)為底物(S),反應(yīng)的生成物稱(chēng)為產(chǎn)物(P),酶所具有的催化能力稱(chēng)為酶活性2）作為生物催化劑，具有一般催化劑的共性-反應(yīng)前后其質(zhì)和量不變, 只催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)，即自由能由高向低轉(zhuǎn)變的化學(xué)反應(yīng),降低反應(yīng)的活化能，縮短平衡到達(dá)的時(shí)間,不改變平衡常數(shù)k3）酶是生物大分子，又具有其特點(diǎn)（個(gè)性）（1）高效率：比非催化高 10x810x20倍 比非酶催化高 10x710x13倍（2）高度專(zhuān)一性(specificity) ：即一種酶只作用一種或一類(lèi)化合物,只催化一定的

13、化學(xué)反應(yīng)并生成一定的產(chǎn)物, 這是酶最重要的特點(diǎn)之一，也是與一般催化劑最主要的區(qū)別 酶的專(zhuān)一性可分為絕對(duì)特異性：酶只催化一種底物進(jìn)行一種化學(xué)反應(yīng)相對(duì)特異性：酶催化同一類(lèi)化合物或同一種化學(xué)鍵進(jìn)行同一類(lèi)型化學(xué)反應(yīng)立體異構(gòu)特異性：酶僅作用于立體異構(gòu)體中的一種（3）酶的不穩(wěn)定性要求反應(yīng)條件：溫和 37、1atm、pH7（4）部分酶的活力與其輔助因子有關(guān)（5) 酶的催化活性是可調(diào)控的.例如：抑制劑和激活劑、代謝物或產(chǎn)物的變化等都可抑制或激活酶的活性；還有別構(gòu)調(diào)控、酶原激活等1-4 兩類(lèi)酶的區(qū)別舉例1）P酶:只能催化其它分子進(jìn)行反應(yīng)；R酶:既能催化其它分子進(jìn)行反應(yīng)也能催化酶分子本身 2）催化大分子水解生成小

14、分子的酶，在R酶叫剪切酶，在P酶則叫水解酶，意在便于區(qū)別R酶和P酶二、 酶及其活性中心的組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和活力測(cè)定2-1 酶的分子組成1）酶分為簡(jiǎn)單酶（單純酶）和結(jié)合酶簡(jiǎn)單酶：僅由肽鏈構(gòu)成，如脲酶 脂酶 淀粉酶等 結(jié)合酶：由蛋白部分（酶蛋白，Apoenzyme）和非蛋白部分（輔助因子，Cofactor）組成酶蛋白+輔助因子-全酶（Holoenzyme）這兩部分都是酶催化活性所必需的，即只有全酶才具有催化活性2）根據(jù)蛋白的特點(diǎn)，分為- （1）單體酶：由單條肽鏈組成；為數(shù)不多，均為水解酶（溶菌酶、胰蛋白酶和核糖核酸酶等） （2）寡聚酶：由多個(gè)相同或不同的亞基以非共價(jià)鍵連接而成，如磷酸化酶、3-磷酸甘

15、油醛脫氫酶等 （3）多酶體系：細(xì)胞內(nèi)存在的、由幾種不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶復(fù)合體，它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，如丙酮酸脫氫酶體系、脂肪酸合成酶復(fù)合體。在多酶體系中，能夠影響整條代謝途徑方向和速度的酶是關(guān)鍵酶，它通常催化單向不平衡反應(yīng)，或是該多酶體系中催化活性最低的限速酶3）酶的輔助因子 （1）輔酶（Coenzyme）：以非共價(jià)鍵與酶蛋白疏松結(jié)合，可用透析、超濾法分離 （2）輔基（Prosthetic group ）：以共價(jià)鍵與酶蛋白牢固結(jié)合，不易分離；在反應(yīng)中輔基不能離開(kāi)酶蛋白 （3）金屬離子：多為酶的輔基，約2/3的酶含有之，常見(jiàn)的是K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等，其作用是多方

16、面的：參與酶的活性中心；在酶蛋白與底物之間起橋梁作用；維持酶分子發(fā)揮催化作用所必需的構(gòu)象；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力（4）小分子有機(jī)化合物：有的屬輔酶（NAD+、NADP+） 有的屬輔基（FAD、FMN） 它們是維生素樣的物質(zhì)，參與酶的催化過(guò)程，在反應(yīng)中傳遞電子、質(zhì)子或一些基團(tuán)各種維生素的輔酶（輔基）形式4）1種酶蛋白+1種輔助因子=1種特異的酶only) 1種輔助因子+N種酶蛋白=N種特異性酶（以催化N種化學(xué)反應(yīng)）5）每一種輔助因子都具有特殊的功能，可以特定地催化某一類(lèi)型的反應(yīng)輔助因子-決定酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型（反應(yīng)專(zhuān)一性）酶蛋白-決定所催化的底物類(lèi)型（底物專(zhuān)一性）2-2 酶的活性部位（

17、active site）1）定義：是酶與底物結(jié)合并將之轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，又稱(chēng)活性中心2）酶活性中心的特點(diǎn) （1）是由在線性多肽鏈中可能相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維小區(qū) （2）在酶分子的總體中只占小的部分 （3）是位于亞基或結(jié)構(gòu)域之間的裂隙或是表面的凹陷部位（為裂縫或凹陷）（4）其與底物的形狀并非正好互補(bǔ)，而是誘導(dǎo)契合，即它在構(gòu)象上具有柔性或可運(yùn)動(dòng)性（5）對(duì)單純酶：它由一些aa殘基的側(cè)鏈基團(tuán)組成，對(duì)結(jié)合酶：還包括部分輔酶或輔基的結(jié)構(gòu)3）酶活性部位的組成，由必需基團(tuán)組成 (1)必需基團(tuán)：參與酶活性中心組成、對(duì)維持該中心的空間構(gòu)象所必需的那些基團(tuán)。包括： 結(jié)合基團(tuán)：它與底物結(jié)合，生成ES 催化基團(tuán)

18、：它影響底物分子中某些化學(xué)鍵的穩(wěn)定性，催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從S轉(zhuǎn)變?yōu)镻有的必需基團(tuán)同時(shí)兼有這兩種功能有些化學(xué)基團(tuán)，位于酶活性中心外，但也是維持該中心構(gòu)象所必需的，稱(chēng)為酶活性中心以外的必需基團(tuán) 酶活性中心-必需基團(tuán)（結(jié)合基團(tuán) + 催化基團(tuán)）4) 構(gòu)成酶活性中心的常見(jiàn)基團(tuán)：組氨酸的咪唑基、絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基、谷氨酸的-羧基5）酶的別構(gòu)中心 (調(diào)節(jié)部位)多數(shù)寡聚酶除有結(jié)合S的活性中心外，還有可結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心，兩個(gè)中心分別在酶分子的不同部位 2-3 酶原及其激活1）定義：沒(méi)有活性的酶的前體稱(chēng)為“酶原”，酶原轉(zhuǎn)變成酶的過(guò)程稱(chēng)為酶原激活，其實(shí)質(zhì)是酶活性部位形成或暴露的過(guò)程2）舉例：胃蛋白

19、酶和胰蛋白酶在最初合成和分泌時(shí)，沒(méi)有催化活性-胃蛋白酶原在H+作用下，自N端切下幾個(gè)多肽碎片，形成酶催化所需的空間結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為胃蛋白酶胰蛋白酶原隨胰液進(jìn)入小腸時(shí)被腸激酶激活，自N端切除一個(gè)6肽，促使酶的構(gòu)象變化，形成活性中心，轉(zhuǎn)變成有活性的胰蛋白酶3）酶（聯(lián)）級(jí)聯(lián)反應(yīng)1)定義：一種酶原的激活常會(huì)引發(fā)一系列酶的激活，這樣的系列激活反應(yīng)即酶（聯(lián)）級(jí)聯(lián)反應(yīng) 2）意義（1）放大信號(hào)或生化過(guò)程（2）也給調(diào)控提供了機(jī)會(huì)3）舉例 （1）凝血過(guò)程中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（2）細(xì)胞凋亡啟動(dòng)過(guò)程中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（3）MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)4）酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中進(jìn)行why?酶原的激活具有重要的生

20、理意義：（1）保護(hù)細(xì)胞本身不受酶的水解破壞（2）保證酶只在特定部位或環(huán)境中發(fā)揮催化作用2-4 同工酶、變構(gòu)酶和抗體酶1）同工酶（isozymes）具有不同的分子形式、但卻催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶，發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)同工酶（1959年）是乳酸脫氫酶（LDH）它在NADH存在下，又催化丙酮酸逆轉(zhuǎn)化生成乳酸2）別（變）構(gòu)酶(allosteric enzyme)（1）變構(gòu)效應(yīng)：一些物質(zhì)結(jié)合于酶活性部位以外的其它部位（變構(gòu)部位），引起酶分子的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致酶活性改變的現(xiàn)象（2）變構(gòu)酶：具有變構(gòu)效應(yīng)的酶。除有與底物結(jié)合的活性部位外，還有與變構(gòu)劑非共價(jià)結(jié)合的調(diào)節(jié)部位（3）引起變構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)稱(chēng)為變構(gòu)效應(yīng)劑3）

21、抗體酶（abzyme）或催化抗體（catalytic antibody)定義：是具有催化功能的抗體本質(zhì)：免疫球蛋白，其易變區(qū)被賦予了酶的屬性，即具有催化作用的免疫球蛋白抗體酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設(shè)計(jì)適合于市場(chǎng)需要的蛋白質(zhì)，即人為地設(shè)計(jì)、制作酶。它是酶工程的一個(gè)全新領(lǐng)域.利用動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的高度專(zhuān)一性，可以得到一系列高度專(zhuān)一性的抗體酶，使抗體酶不斷豐富。隨之出現(xiàn)大量針對(duì)性強(qiáng)、藥效高的藥物 將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槊钢饕ㄟ^(guò)下列方法a誘導(dǎo)法：利用反應(yīng)過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗b引入法：借助基因工程和蛋白質(zhì)工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上，使其獲

22、得催化功能c拷貝法：主要根據(jù)抗體生成過(guò)程中抗原-抗體互補(bǔ)性來(lái)設(shè)計(jì)Pollack等以硝基苯酚磷酸膽堿酯作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生單抗，經(jīng)篩選找到加快水解反應(yīng)1.2萬(wàn)倍的抗體酶 抗體酶的應(yīng)用及前景a抗體酶可催化多種化學(xué)反應(yīng)，包括酯水解、酰胺水解、?；D(zhuǎn)移、光誘導(dǎo)反應(yīng)、氧化還原分應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)等；甚至過(guò)去沒(méi)有酶能催化的反應(yīng)和熱力學(xué)上無(wú)法進(jìn)行的反應(yīng)b在第一批應(yīng)用的抗體酶中，有與蛋白酶相似的抗體，可以在特定氨基酸序列上切割蛋白質(zhì)，從而建立具有各種專(zhuān)一性的切割蛋白質(zhì)的抗體酶庫(kù)，猶如限制性內(nèi)切酶庫(kù)一樣供研究者選用抗體酶的應(yīng)用及前景c一種抗體酶可切開(kāi)血纖維蛋白（血凝塊的主要成分），可以用于溶栓治療d一些抗體酶可固定

23、在癌細(xì)胞突出的蛋白質(zhì)上，破壞癌細(xì)胞膜，將用于癌癥治療e一些抗體酶可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解，從而防止病毒與靶細(xì)胞結(jié)合f立體專(zhuān)一性抗體酶的研究，使生產(chǎn)高純度立體專(zhuān)一性的藥物成為現(xiàn)實(shí)，因此隨之出現(xiàn)大量針對(duì)性強(qiáng)、藥效高的藥物g有機(jī)化學(xué)家則希望利用抗體酶技術(shù)提供新的催化劑，使那些現(xiàn)在還不能利用天然酶催化的復(fù)雜反應(yīng)得以催化。h抗體酶的固定化已獲得成功，將大大地推進(jìn)工業(yè)化進(jìn)程 2-6 酶的活力及其測(cè)定1）酶活力（enzyme activity)：也稱(chēng)酶活性，是酶性質(zhì)的重要參數(shù)，其實(shí)質(zhì)是酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力2）酶活力測(cè)定：指采用各種檢測(cè)手段，確定酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力大小的技術(shù)過(guò)程，是酶的研究、生產(chǎn)和

24、應(yīng)用過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié) 酶活力大小不能用重量或體積來(lái)表示，可以用在一定條件下酶所催化的反應(yīng)的初速度表示。外界條件相同的情況下，反應(yīng)初速度越大，意味著酶活力越高 酶催化反應(yīng)的速度通常用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示3)常用的酶活力單位（active unit）是人們定義的一種酶量單位，用來(lái)衡量酶活力高低（1）國(guó)際單位（IU)：1961年國(guó)際生化與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)規(guī)定的: 酶在一定條件下（溫度25、pH等條件；均采用最適條件），每1分鐘催化1µmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量叫做1個(gè)酶活力單位，也即IU，即1IU=1µmol/min 酶的含量就可以用每克或每毫升酶制

25、劑含有多少酶活力單位來(lái)表示（IU/g, IU/ml)(2) Kat：在最適條件下，每秒催化1mol 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量叫做1個(gè)酶活力單位，1 Kat6×107 IU*為比較酶制劑的純度和活力高低，引入了比活力（specific activity)，即特定條件下，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)或RNA所具有的酶活力單位數(shù)*對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō)，比活力愈高，酶愈純 比活力活力單位數(shù) / 毫克（蛋白 或RNA) 酶制劑的總活力比活力 × 總體積 (ml)或總量（mg) 純化倍數(shù)每次純化后的比活力 / 初制品的比活力 回收率（）（每次純化后的總活力/初制品的總活力）×1004）酶活力測(cè)定

26、方法：要求-快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，化學(xué)測(cè)定法、光學(xué)測(cè)定法、氣體測(cè)定法等一般包括五個(gè)步驟：選擇適宜的一定濃度的底物；確定酶促反應(yīng)的條件；將一定量的酶液和底物溶液混合，記錄反應(yīng)開(kāi)始時(shí)間；反應(yīng)到一定時(shí)間（因要測(cè)定酶促反應(yīng)初速度），取出反應(yīng)液終止反應(yīng)；通過(guò)各種生化檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量（一般多以產(chǎn)物的生成量來(lái)表示）* 終止反應(yīng)的常用方法-沸水浴，加熱使酶滅活加入適宜的酶變性劑使酶失活（三氯醋酸等）加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液遠(yuǎn)離最適pH而終止立即冷藏，使反應(yīng)液溫度迅速降低到10以下而終止反應(yīng)實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)酶的特性、反應(yīng)底物和產(chǎn)物的性質(zhì)、酶活力測(cè)定方法等來(lái)具體選擇三、酶的作用機(jī)制3-1 鎖

27、與鑰匙 (lock and key)學(xué)說(shuō)1894年，由Fisher提出， 即酶與底物如鎖與鑰匙的關(guān)系,以此說(shuō)明酶與底物結(jié)構(gòu)上的互補(bǔ)性，或底物的形狀與酶的活性部位彼此相適合，這是一種剛性的、固定的組合3-2 Henri中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)1902年Henri的“中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)”即酶催化時(shí)，酶活性中心首先與底物結(jié)合生成一種酶-底物復(fù)合物(ES)，此復(fù)合物再分解，釋放出酶，并生成產(chǎn)物，即E+S ES E+P 該學(xué)說(shuō)已為實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，且分離到若干種ES結(jié)晶3-3 米氏學(xué)說(shuō)1913年， Michaelis 和 Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)進(jìn)行數(shù)學(xué)推導(dǎo)，得出V與S的數(shù)學(xué)方程式，即米-曼氏方程式Km是米氏常數(shù)，是酶的特

28、征性常數(shù)之一，只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)Km值為1/2Vmax時(shí)的底物濃度該方程式是：當(dāng)Km和Vmax一定時(shí)，酶反應(yīng)速度與S之間的定量關(guān)系3-4 誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（induced-fit hypothesis ） 當(dāng)發(fā)現(xiàn)酶具有相當(dāng)?shù)娜嵝院螅?958年Koshland提出“誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)”-*底物的結(jié)合誘導(dǎo)酶活性部位的構(gòu)象變化；*酶也可使底物變形，迫使其構(gòu)象近似于它的過(guò)渡態(tài)，即：酶與底物相互結(jié)合的過(guò)程是相互誘導(dǎo)、相互變形、相互適應(yīng)的柔性過(guò)程3-5 操作子學(xué)說(shuō)1961年，法國(guó)巴斯德研究所著名的科學(xué)家 Jacob 和 Monod提出“乳糖操縱子學(xué)說(shuō)”調(diào)節(jié)乳糖催化酶產(chǎn)生的操縱

29、子*解釋了原核基因調(diào)控的原理 *闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制-通過(guò)誘導(dǎo)和解除阻遏，可顯著提高酶的產(chǎn)量乳糖操作子學(xué)說(shuō)之調(diào)控機(jī)制 1）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)控（1)抑制作用：在無(wú)乳糖（Lac)的環(huán)境，I基因轉(zhuǎn)錄、合成的阻遏蛋白與操縱基因O結(jié)合，致RNA聚合酶不能與啟動(dòng)基因P結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因便不能轉(zhuǎn)錄、合成酶蛋白，即該操縱子處于阻遏狀態(tài) （2）誘導(dǎo)作用：有乳糖時(shí)，乳糖代謝產(chǎn)生別乳糖，后者與阻遏蛋白結(jié)合并改變其構(gòu)象，以致不能再與O結(jié)合（去阻遏），RNA聚合酶便與P序列結(jié)合，從而激活結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯出酶蛋白,使半乳糖苷酶在細(xì)胞內(nèi)的含量增加1000倍。此即乳糖對(duì)該操縱子的誘導(dǎo)作用（3）負(fù)反饋：當(dāng)胞質(zhì)中有了-半乳

30、糖苷酶后，便催化分解乳糖（生成半乳糖和葡萄糖）。乳糖被分解利用后，于是阻遏蛋白又與操縱基因結(jié)合，使結(jié)構(gòu)基因處于阻遏狀態(tài) 2） CAP的正性調(diào)控：CAP分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及cAMP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)沒(méi)有葡萄糖及cAMP濃度較高時(shí)，cAMP與CAP結(jié)合于乳糖啟動(dòng)序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之提高50倍；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降3） 乳糖操縱子的強(qiáng)誘導(dǎo)：既需要有乳糖的存在，又需要沒(méi)有葡萄糖可供利用對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)制的解釋?zhuān)河纱丝梢?jiàn)，對(duì)乳糖操縱子來(lái)說(shuō) CAP是正性調(diào)節(jié)因素，乳糖阻遏蛋白是負(fù)性調(diào)節(jié)因素。兩種調(diào)節(jié)機(jī)制根據(jù)存在的碳源性質(zhì)及水平協(xié)

31、調(diào)調(diào)節(jié)乳糖操縱子的表達(dá)狀態(tài)，以決定大腸桿菌的代謝方式：*有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌優(yōu)先選擇葡萄糖供能。葡萄糖通過(guò)降低 cAMP濃度，阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌只能利用葡萄糖*在無(wú)葡萄糖而只有乳糖的條件下，阻遏蛋白與 O序列解聚，CAP結(jié)合cAMP后與乳糖操縱子的CAP位點(diǎn)，激活轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)菌可利用乳糖作為能源 四、 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)4-1 酶反應(yīng)速度：在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)某化學(xué)反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的速度；或者產(chǎn)物濃度增加的速度，單位: mol/L/s, mol/L/min, mol/L/h*測(cè)定酶反應(yīng)速度時(shí)，一般要求非常高的底物濃度，以保證實(shí)驗(yàn)測(cè)定的起始反應(yīng)速度與酶濃度成

32、正比*當(dāng)研究某一因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，體系中的其它因素保持不變，而只變動(dòng)所要研究的因素4-2 酶對(duì)反應(yīng)速度的影響，當(dāng)?shù)孜?>> 酶或當(dāng)?shù)孜镒銐虼髸r(shí)，酶促反應(yīng)速度 酶4-3 底物對(duì)酶反應(yīng)速度的影響 根據(jù)米-曼氏方程，當(dāng)Km和Vmax一定時(shí)，酶反應(yīng)速度與S之間具有定量關(guān)系4-3 底物對(duì)酶反應(yīng)速度的影響1）當(dāng)S較低時(shí)，V與S呈正比關(guān)系（一級(jí)反應(yīng)）2）隨著S的增高，V的增加逐步減慢（混合級(jí)反應(yīng)）3）增到一定程度時(shí)，酶的活性中心已被S飽和 ，V不再增加，而是趨于穩(wěn)定（零級(jí)反應(yīng)）4）當(dāng)SKm 時(shí)，v = Vmax S/Km，V與S成正比5）當(dāng)S Km 時(shí) ，vVmax，V達(dá)到最大，再增加

33、S也不影響V 反應(yīng)級(jí)數(shù)及特征一級(jí)反應(yīng)：反應(yīng)速率與反應(yīng)物的濃度的一次方成正比。二級(jí)反應(yīng)：反應(yīng)速率與兩種物質(zhì)濃度的乘積成正比。零級(jí)反應(yīng)：反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)而受它種因素影響而改變的反應(yīng)。4-4 pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響 1）每一種酶只能在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)活力，酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的pH稱(chēng)為酶的最適pH2）最適pH的微小偏離可使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化而降低酶的活性3）偏離較大時(shí)，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價(jià)鍵受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白的變性4）酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)，其受酶的純度、底物的種類(lèi)和濃度、緩沖液的種類(lèi)和濃度等的影響5）一般酶的最適pH在4-8之間植物和微生物體內(nèi)的酶最適pH多在

34、4.5-6.5，動(dòng)物體內(nèi)的最適pH多在6.5-8，多在6.8左右例外，如胃蛋白酶最適pH為1.9，胰蛋白酶的最適pH為8.1，肝精氨酸酶的最適pH為9.06）Vo與pH的關(guān)系圖形是鐘形曲線pH影響酶活力的機(jī)制過(guò)酸、過(guò)堿都會(huì)使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變pH的改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離pH也會(huì)影響底物分子的解離狀態(tài)4-5 溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響溫度對(duì)Vo關(guān)系的圖形是一條曲線，它表示出最適溫度多數(shù)哺乳動(dòng)物的酶最適溫度在37左右，植物體內(nèi)酶的最適溫度在50左右，有些微生物的酶（Taq酶）適應(yīng)在高溫或低溫下工作升溫對(duì)酶促反應(yīng)速度由雙重影響提高反應(yīng)速度和酶遇熱易變性失活最終決定酶反應(yīng)速度的是這兩個(gè)

35、相反效應(yīng)間的平衡*反應(yīng)體系的溫度低于最適溫度時(shí)，加熱可使反應(yīng)速度加快，每升高10,反應(yīng)速度增加12倍*當(dāng)反應(yīng)溫度高于最適溫度時(shí)，反應(yīng)速度則因酶受熱變性而降低酶的最適溫度不是酶的特征性常數(shù)，它與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)若酶促反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間短暫，則最適溫度要高些；反之，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，則最適溫度要低些低溫，一般不破壞酶，只是降低酶活性，當(dāng)溫度恢復(fù)后，活性仍可恢復(fù)。因此醫(yī)學(xué)上可用低溫保持生物制品如酶(固態(tài)最好）、菌種等4-6 激活劑對(duì)反應(yīng)速度的影響凡能使酶活性從無(wú)到有、從低到高的物質(zhì)，即為酶的激活劑（activator）-必需激活劑：對(duì)酶促反應(yīng)是不可缺少的，常是金屬離子，如Mg2+、K+ 、Mn2+ 等 Mg2+

36、是多種激酶和合成酶的必需激活劑非必需激活劑：其不存在時(shí)，酶仍有一定活性，但加了這些激活劑，酶活性增加。包括有機(jī)化合物和Cl-等（如：膽汁酸鹽是胰脂肪酶，Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活劑）激活劑種類(lèi)1)無(wú)機(jī)離子 2)金屬離子3)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)(蛋白酶) 4)中等大小的有機(jī)分子 如：EDTA(乙二胺四乙酸）一些還原劑(半胱氨酸、谷胱甘肽)4-7 抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響1） 酶抑制劑（1）酶活性的抑制：由于酶的必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而引起的酶活性降低或喪失，非酶變性所致 酶的抑制劑：導(dǎo)致酶活性降低或喪失而不導(dǎo)致酶分子變性的物質(zhì) 酶的失活(inactivation)：是由于酶分子變性而引起

37、的酶活力喪失的現(xiàn)象2）抑制作用的類(lèi)型及特征 可逆和不可逆抑制兩類(lèi)，以可逆抑制更重要 （1）不可逆抑制作用 定義：抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合而致酶活力喪失；不能用透析、超濾或凝膠過(guò)濾等物理方法去除抑制劑而使酶復(fù)活，故稱(chēng)。但是，可用某些藥物解毒，使酶恢復(fù)活性如：農(nóng)藥敵百蟲(chóng)、敵敵畏、1059等有機(jī)磷化合物能特異地與膽堿酯酶活性中心的絲氨酸羥基結(jié)合，使酶失活，導(dǎo)致乙酰膽堿不能水解而積蓄，從而出現(xiàn)迷走神經(jīng)興奮的中毒狀態(tài) 解磷定（PAM）可解除有機(jī)磷化合物對(duì)羥基酶的抑制作用，顯然這類(lèi)解毒藥物與有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合的強(qiáng)度大于與酶結(jié)合再如：重金屬鹽引起的巰基酶中毒，可用絡(luò)合劑或加入其他過(guò)量的巰基化合物，如二巰

38、基丙醇（BAL）來(lái)解毒（2）可逆抑制作用（reversible inhibition） 定義：抑制劑與酶和/或ES以非共價(jià)鍵方式可逆結(jié)合而引起酶活力的降低或喪失，能夠用物理的方法除去抑制劑而使酶復(fù)活 分類(lèi)：競(jìng)爭(zhēng)性抑制；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（competitive inhibition） 定義：抑制劑與酶的底物結(jié)構(gòu)相似，可與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而阻礙酶與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物或者降低酶和底物的親和力，而抑制酶的活性和酶促反應(yīng)速度；但是，隨底物濃度的增加，抑制劑與酶結(jié)合的幾率就降低甚至消除。因此，其Vmax不變，但是Km增大 Vmax：是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度

39、成正比 Km：是Vmax/2時(shí)的底物濃度; 與酶濃度無(wú)關(guān)競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：1.抑制劑與底物分子結(jié)構(gòu)相似（往往是底物類(lèi)似物或反應(yīng)產(chǎn)物），并且與酶的結(jié)合部位相同。因此，抑制劑與底物之間有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系2.I越大，則抑制作用越大；抑制程度與I成正比，與S成反比；增大S可減輕或消除抑制作用3.動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vmax值不變利用競(jìng)爭(zhēng)性抑制是藥物設(shè)計(jì)的主要思路 例如： 磺胺類(lèi)藥的抗菌機(jī)理-1）其與對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似2）其與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)菌葉酸形成，抑制細(xì)菌繁殖3）人可以通過(guò)食物直接補(bǔ)充葉酸，所以，其對(duì)人無(wú)害 競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用舉例非競(jìng)爭(zhēng)抑制作用(noncompetitiv

40、e inhibition)概念：抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無(wú)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系抑制劑既與E結(jié)合，也與ES結(jié)合，后者生成的三元復(fù)合物（ESI）不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物（死端復(fù)合物），從而抑制酶活性反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitive inhibition） 定義：抑制劑只與ES結(jié)合，使ES的量下降和形成非活性形式ESI，從而使酶失去活性反競(jìng)爭(zhēng)抑制作用特點(diǎn)： 1.抑制劑與底物分子結(jié)構(gòu)不同,可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合 2.抑制劑只與ES結(jié)合，因此底物的存在是抑制劑與酶結(jié)合的先決條件 3.抑制程度取決于I和ES 4. Vmax和Km都變小，并且Vmax和Km隨I的增加而減小，但Vmax/

41、Km比值不變其它可逆抑制 產(chǎn)物抑制：產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用在生物體中較為常見(jiàn)在細(xì)胞內(nèi)，酶反應(yīng)的產(chǎn)物雖然不斷被另外的酶作用，但S和P總是同時(shí)存在的酶工程之酶的分離純化一、概述1-1 酶提取與分離純化的定義 將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來(lái)，再與其它物質(zhì)分開(kāi)，從而獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程 1）酶的純化程度根據(jù)需要而定 2）純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是2種或2種以上聯(lián)合應(yīng)用提取 分離 純化1-2 提取純化之目的 1)酶催化功能的應(yīng)用 2)酶學(xué)研究 酶的結(jié)構(gòu)、功能、催化機(jī)制、催化動(dòng)力學(xué) 酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等 1-3 純化的必要性1)生物細(xì)胞中同時(shí)存在多種多樣的酶2)多酶可能作用于同一個(gè)

42、底物3)酶在生物細(xì)胞中的分布并不是均一的1-4 酶分離純化的主要步驟 抽提、分離純化、結(jié)晶1）提取：將酶從含酶原料中提取出來(lái)，包括細(xì)胞破碎、提取和濃縮破碎細(xì)胞：獲取胞內(nèi)酶的第一步就是破壞細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)提取(抽提)：一般用緩沖液進(jìn)行抽提。緩沖液的類(lèi)型由酶的種類(lèi)和理化特性決定濃縮：提取液或發(fā)酵液中酶濃度很低，必須濃縮富集2）分離純化：就是去除雜質(zhì)的過(guò)程 目的是：提高酶純度 與此同時(shí)酶的總量也將不可避免的損失3）結(jié)晶：溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過(guò)程，也是酶分離純化的一種手段 濃縮液經(jīng)過(guò)各種方法去除雜質(zhì)后，再通過(guò)結(jié)晶析出靶酶，可得到較純的結(jié)晶形式的酶產(chǎn)品二、酶的提取2-1 了解所分離酶在細(xì)胞中的分布

43、 1)細(xì)胞外酶：由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于水解酶，通常含量高，容易得到2)細(xì)胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。該類(lèi)酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞器結(jié)合，不僅有一定的區(qū)域性，而且催化的反應(yīng)具有一定順序性補(bǔ)充：酶在細(xì)胞內(nèi)的集中存在和隔離分布對(duì)代謝的調(diào)節(jié)：（1）.真核細(xì)胞的胞核、線粒體、高爾基體以及細(xì)胞質(zhì)等均呈分室狀態(tài)（2）.分室的膜調(diào)節(jié)著各種物質(zhì)的出入，因此： *各分室間的PO2、PCO2、ATP/ADP的比例等保持一定差異 *代謝受所在分室代謝物、酶及其它因素的調(diào)節(jié) *各分室有不同功能，以實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝的精細(xì)調(diào)節(jié) *分室間隔的破壞會(huì)引起代謝的紊亂（3）另外，各室

44、中的酶系分布也有部位效應(yīng)，從而對(duì)代謝進(jìn)行有序調(diào)節(jié) 如：同是線粒體 外膜-與電子轉(zhuǎn)移及氧化磷酸化有關(guān)的酶系 內(nèi)膜-含有脂肪酸氧化等的酶系真核細(xì)胞內(nèi)酶的分布：細(xì)胞膜：ATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等細(xì)胞核：DNA聚合酶、連接酶和RNA聚合酶等線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質(zhì)合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶溶酶體：各種水解酶等葉綠體：參與光合作用形成ATP、NADPH有關(guān)的酶類(lèi)、與暗反應(yīng)有關(guān)的酶系線粒體主要酶的分布（約有120種酶）部 位酶 的 名 稱(chēng)外 膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-細(xì)胞色素C還原酶、脂類(lèi)代謝

45、有關(guān)的酶（?；o酶A合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：?jiǎn)伟费趸改?間 隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶內(nèi) 膜細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、NADH脫氫酶、肉堿?；D(zhuǎn)移酶、b-羥丁酸和 b-羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：細(xì)胞色素（c）氧化酶基 質(zhì)檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：蘋(píng)果酸脫氫酶2-2 起始材料的選擇原則：1）選取酶含量高的材料 2）可以是天然的動(dòng)植物 3）或人工培養(yǎng)的微生物、動(dòng)植物細(xì)

46、胞等注意事項(xiàng)：注意材料的年齡 注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料和成本的限制，因此，目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來(lái)獲得大量的酶制劑2-3 細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破碎1）主要方法：2）選擇原則： 1）不影響或最小影響酶活性的前提下 2）到較好的破碎效果 不同的生物體或同一生物體的不同組織細(xì)胞，其細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)（細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）也可能不同，應(yīng)根據(jù)具體情況選用適宜的方法；必要時(shí)2種或2種以上的方法聯(lián)合應(yīng)用例如：大的組織塊需先搗碎或研磨，再勻漿3）常用方法 動(dòng)植物組織：凍融 組織搗碎器研磨 加石英砂等（助磨劑）研磨 細(xì)菌：加砂或氧化鋁研磨或超聲波振蕩2-4 酶的提取或

47、抽提1）酶的抽提之定義：在適當(dāng)條件下，用適當(dāng)?shù)奶崛∫禾幚砗冈?，使酶充分溶于其中的過(guò)程影響酶提取的主要因素：酶在溶劑中的溶解度 酶向溶劑相中的擴(kuò)散速度2）提取液的選擇根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解特性來(lái)選擇適當(dāng)?shù)奶崛∫簶O性物質(zhì)易溶解于極性溶劑，反之。即相似相溶 酸性物質(zhì)易溶解于堿性溶液，反之3）常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進(jìn)行抽提4）有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑抽提，如： 丙酮粉：有助于酶與脂肪或磷脂膜分離 高離子強(qiáng)度：有助于酶從結(jié)合的膜上解析下來(lái)5）主要的提取方法（1）鹽溶液提取 該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶

48、的提取 常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L， 較多的P酶用該法提取 ，R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象 鹽析現(xiàn)象：當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象（2）酸溶液提取 在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法。如：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液（3）堿溶液提取 在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用。如：細(xì)菌L-天冬酰胺酶可用pH11-12.5的溶液（4）有機(jī)溶劑提?。喝缑概c脂質(zhì)結(jié)合牢固，或含有較多非極性基團(tuán)的酶，可用與水混溶的有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），如：P酶：膽堿酯酶、細(xì)

49、胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用丁醇萃取，有較好效果 R酶：可用苯酚水溶液提取主要的提取方法小結(jié)6）影響酶提取的其它重要因素 （1）溫度：適當(dāng)提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的擴(kuò)散速度；過(guò)高則引起酶失活 （2）pH: 在等電點(diǎn)條件下，酶的溶解度最?。粸樘岣呷芙舛?，要避開(kāi)酶的等電點(diǎn);但是，也不宜偏離pI太遠(yuǎn)（過(guò)高或過(guò)低），以免引起酶變性失活（3）提取液體積 *適當(dāng)增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率 *過(guò)量，則降低酶，增加后續(xù)分離純化的難度 一般為原始材料的3-5倍，且分3次使用 （4）加入保護(hù)劑，以提高酶的穩(wěn)定性。如酶的底物、輔酶和某些抗氧化劑3-1 分離純化方法分類(lèi)1）基于分子大小或質(zhì)量：(1)離心

50、(2)透析 (3)凝膠過(guò)濾 (4)超過(guò)濾2）基于電荷：(1) 離子交換色譜 (2) 電泳 (3) 等電聚焦3）基于溶解度：改變pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)等實(shí)現(xiàn)的沉淀分離(1) 鹽析法(2) 復(fù)合沉淀法 (3) 有機(jī)溶劑沉淀法(4) 等電點(diǎn)沉淀法 (5) 選擇性變性沉淀法蛋白質(zhì)變性、沉淀和凝固之間的關(guān)系蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出即沉淀 蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱(chēng)為凝固補(bǔ)充：變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性的 凡凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生了變性 4）基于特異性結(jié)合位置/親和力的差異：親和色譜5）其它方法（略）：（1）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法（2）基于疏

51、水作用的差異：疏水層析（3）在磷酸鈣凝膠柱上分級(jí)吸附（4）羥基磷灰石色譜（5）冷凍干燥（濃縮）3-2 常用的分離純化方法1）離心2）凝膠過(guò)濾3）透析4）超濾5）離子交換層析6）電泳7）層析聚焦8）沉淀分離9）親和層析10）吸附層析11）濃縮和干燥1）離心（centrifugation)（1）定義：利用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的顆粒分離的技術(shù)過(guò)程 *優(yōu)點(diǎn)：處理量大，可達(dá)幾升 *離心條件的選擇：以靶酶與雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件 （2）離心機(jī)（centrifuge)分類(lèi)按分離形式不同：分為沉降式和過(guò)濾式按離心操作形式：分為間歇式

52、、連續(xù)式和半連續(xù)式按使用目的：分為分析用、制備用和分析-制備用按離心機(jī)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式、管式和蝶式等按其最大轉(zhuǎn)速，分為:常速、高速和超速（3）離心機(jī)的常用分類(lèi)常速/低速離心機(jī)：主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)扔行挝镔|(zhì)分離，也可分離較大顆粒的酶結(jié)晶分離高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速2.5萬(wàn)。在酶的分離中，主要用于沉淀及細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離為防止離心過(guò)程中溫度升高而致酶失活，最好用高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5-12x104rpm。主要用于DNA、RNA（酶）、蛋白質(zhì)(酶）等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化等（4）離心方法的選擇 對(duì)于常速和高速離心機(jī)，由于分離的顆粒大小和密度

53、差異較大，所以只需要選擇離心速度和時(shí)間就能夠達(dá)到分離效果 如果需要從中分離出2種以上不同的顆粒，則需要采用差速離心 對(duì)于超速離心，則可根據(jù)需要而采用差速離心、密度梯度離心（速率-區(qū)帶）或平衡密度梯度離心等差速離心（differential centrifugation)：即采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離。主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡(jiǎn)單、方便，但是分離效果差 密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成 連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用，使樣品中的組份依據(jù)其沉降速率和密度的不同而分層、分離這類(lèi)分離又分為： 速率-區(qū)帶（RateZonal，R-Z）

54、等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度離心補(bǔ)充：對(duì)產(chǎn)生梯度的介質(zhì)的要求*能產(chǎn)生密度梯度，且密度高而粘度卻不高*pH中性或易調(diào)為中性*濃度大時(shí)，滲透壓不大*不與樣品中的組份發(fā)生反應(yīng)，也不引起樣品中組份的凝集、變形或失活*常用的介質(zhì)：氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖A.速率-區(qū)帶(R-Z)：是根據(jù)分離的顆粒在梯度液中沉降速度的不同，并使之處于不同的密度梯度層內(nèi)，從而形成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的 方法：是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、CsCl等），待分離的樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過(guò)程中由于不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時(shí)刻形成了數(shù)個(gè)分別含不同組

55、份顆粒的區(qū)帶-各自歸位 注意事項(xiàng)：1）離心過(guò)程在沉降得最快的組份形成沉淀前就停止。即樣品是在沉降過(guò)程中被收集的，而不是到其形成沉淀時(shí)，因此對(duì)其離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種顆粒在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前2）如果離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部，“前功盡棄”3）離心時(shí)間不足，各區(qū)帶沒(méi)有形成，也無(wú)法分離4）梯度液的最大密度 < 樣品中各組分的密度B.平衡密度梯度離心法（equilibrium density gradient centrifigation)/等密度梯度離心法：當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)，在離心力作用下，不同浮力密度的顆?；虺两?、或上浮，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就可以一直移動(dòng)到與它們各