項目八 藥物的體外抗菌技術

1、藥物的體外抗菌藥物的體外抗菌技術技術項目八項目八學習目標學習目標v1.1.熟悉藥物體外抗菌試驗的用途及意義熟悉藥物體外抗菌試驗的用途及意義v2.2.掌握體外抗菌試驗的基本方法掌握體外抗菌試驗的基本方法v藥物的體外抗菌試驗：又稱藥敏藥物的體外抗菌試驗：又稱藥敏試驗，是為了檢查藥物的抗菌能試驗，是為了檢查藥物的抗菌能力，主要用于篩選抗菌藥物或測力，主要用于篩選抗菌藥物或測定細菌對藥物的敏感性。定細菌對藥物的敏感性。藥敏藥敏試驗試驗抑菌試驗：抑菌試驗：殺菌試驗：殺菌試驗：只能抑制微生物生只能抑制微生物生 長，不能殺死微生物。長，不能殺死微生物?？梢詺⑺牢⑸锟梢詺⑺牢⑸锼幬锏捏w外抗菌試驗藥物的體外

2、抗菌試驗v用途：用途：v 篩選抗菌藥物、測定血藥濃度篩選抗菌藥物、測定血藥濃度v 測定抗菌譜、耐藥譜、效價測定抗菌譜、耐藥譜、效價v 提取過程中的生物追蹤提取過程中的生物追蹤 v優(yōu)點：方法簡便、需時短、用藥量少，不需優(yōu)點：方法簡便、需時短、用藥量少，不需要動物。要動物。v缺點：不能根據體外試驗結果肯定或否定一缺點：不能根據體外試驗結果肯定或否定一個藥物的抗菌作用。個藥物的抗菌作用。藥物的體外抗菌試驗藥物的體外抗菌試驗抗菌試驗的影響因素抗菌試驗的影響因素v1、試驗菌：、試驗菌：v用專門的供應機構提供的用專門的供應機構提供的標準菌株標準菌株。v北京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所菌種保藏中北京衛(wèi)生部藥品生

3、物制品檢定所菌種保藏中心。心。v試驗菌應合理保藏，用前加以純化及生物學試驗菌應合理保藏，用前加以純化及生物學特征鑒定。特征鑒定。v所用的試驗菌株應處于所用的試驗菌株應處于對數生長期對數生長期，因此期，因此期的微生物對外界因素變化最敏感。的微生物對外界因素變化最敏感。v試驗結果的靈敏度在一定程度上與試驗結果的靈敏度在一定程度上與試驗菌的試驗菌的接種量接種量成反比關系，故應選用適宜的接種量。成反比關系，故應選用適宜的接種量。 抗菌試驗的影響因素抗菌試驗的影響因素2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 v抗菌試驗的培養(yǎng)基應按試驗菌的需求配制，如鏈球抗菌試驗的培養(yǎng)基應按試驗菌的需求配制，如鏈球菌常用含血清的肉湯培養(yǎng)基，抗

4、真菌藥物試驗需用菌常用含血清的肉湯培養(yǎng)基，抗真菌藥物試驗需用沙氏培養(yǎng)基。沙氏培養(yǎng)基。v培養(yǎng)基的酸堿度、電解質、還原性物質等均可影響培養(yǎng)基的酸堿度、電解質、還原性物質等均可影響試驗結果，實驗時應盡可能排除各種影響實驗結果試驗結果，實驗時應盡可能排除各種影響實驗結果因素的摻入。因素的摻入。v經無菌檢查合格。經無菌檢查合格。 抗菌試驗的影響因素抗菌試驗的影響因素3、抗菌藥物、抗菌藥物 v 藥物的濃度、藥物的濃度、pH及含有的其他成分均可及含有的其他成分均可影響試驗結果，特別是中草藥制劑往往含有影響試驗結果，特別是中草藥制劑往往含有色素、雜質和鞣質等，這些均可造成錯誤結色素、雜質和鞣質等，這些均可造成

5、錯誤結果，應加注意。果，應加注意。 抗菌試驗的影響因素抗菌試驗的影響因素4、對照試驗：、對照試驗：v 為精確判斷實驗結果，試驗時應設各種對為精確判斷實驗結果，試驗時應設各種對照，包括試驗菌對照、已知藥物對照及溶劑照，包括試驗菌對照、已知藥物對照及溶劑和稀釋液對照等。和稀釋液對照等。v 在實際工作中，往往可見到體外實驗有在實際工作中，往往可見到體外實驗有作用的藥物，進入機體后由于各種原因而失作用的藥物，進入機體后由于各種原因而失效，有的藥物毒性很大也不能用于臨床。效，有的藥物毒性很大也不能用于臨床。常用的體外抑菌試驗常用的體外抑菌試驗體外抑體外抑菌試驗菌試驗瓊脂擴瓊脂擴散法散法平板挖溝法平板挖溝

6、法紙片擴散法紙片擴散法連續(xù)稀連續(xù)稀釋法釋法液體培養(yǎng)基稀釋法液體培養(yǎng)基稀釋法固體培養(yǎng)基稀釋法固體培養(yǎng)基稀釋法瓊瓊 脂脂 擴擴 散散 法法v原理：原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分，溶解脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分，溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小

7、反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MICMIC呈負相關關系，即抑菌圈愈大，呈負相關關系，即抑菌圈愈大，MICMIC值愈小。值愈小。 v紙片紙片擴散擴散法：法：v 制成含菌平板后，將濾紙片蘸取藥液置制成含菌平板后，將濾紙片蘸取藥液置于平板上，培養(yǎng)后觀察結果，量取抑菌圈直于平板上，培養(yǎng)后觀察結果，量取抑菌圈直徑以此判斷試驗藥物抑菌作用的強弱。徑以此判斷試驗藥物抑菌作用的強弱。v最常用的方法最常用的方法，適用于多種藥物或一種藥物，適用于多種藥物或一種藥物的不同濃度對同一試驗菌的抑菌試驗，多的不同濃度對同一試驗菌的抑菌試驗，多用用于于新藥的初

8、篩及臨床的藥敏試驗。新藥的初篩及臨床的藥敏試驗。 ( (二二) )培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1抗菌藥物紙片抗菌藥物紙片 選擇直徑為選擇直徑為6.35mm，吸，吸水量為水量為20l的的專用藥敏紙片專用藥敏紙片，用逐片加樣，用逐片加樣或浸泡方法使每片含藥量達規(guī)定要求。含或浸泡方法使每片含藥量達規(guī)定要求。含藥紙片密封貯存于藥紙片密封貯存于2-8，且不超過，且不超過1周。周。2培養(yǎng)基培養(yǎng)基 水解酪蛋白（水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基是兼是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，4保存。保存。試驗程序1.用接種環(huán)分別在瓊脂平板上挑取形態(tài)相似用接種環(huán)分別

9、在瓊脂平板上挑取形態(tài)相似 的大腸桿菌菌落的大腸桿菌菌落45個，接種于個，接種于35mL肉肉湯管中湯管中2.35溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)28h，與標準比濁管比較，與標準比濁管比較，若菌液濃度太濃時，可用肉湯或生理鹽水若菌液濃度太濃時，可用肉湯或生理鹽水稀釋至與稀釋至與0.5麥氏標準比濁管濁度麥氏標準比濁管濁度相同相同3.在在15min內，用無菌棉簽蘸取菌液，并在管內，用無菌棉簽蘸取菌液，并在管壁上擠去多余的菌液后涂布于壁上擠去多余的菌液后涂布于M-H瓊脂平瓊脂平板上（注意：涂布要均勻、致密），待干板上（注意：涂布要均勻、致密），待干（三）試驗步驟三）試驗步驟4. 用鑷子蘸取用鑷子蘸取95%乙醇并通過火焰

10、，待乙醇并通過火焰，待燒干后再蘸取乙醇重復上述操作，共燒干后再蘸取乙醇重復上述操作，共三次即可達到滅菌的效果。待冷卻后，三次即可達到滅菌的效果。待冷卻后，用此無菌鑷子夾取不同藥敏紙片，按用此無菌鑷子夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，即兩一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，即兩紙片間距不小于紙片間距不小于24 mm，紙片距平板邊，紙片距平板邊緣不小于緣不小于15mm。5. 35溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)1824h觀察結果。觀察結果。（四）結果判斷和報告（四）結果判斷和報告 用精確度為用精確度為1mm1mm的游的游標卡尺量取抑菌圈直徑。標卡尺量取抑菌圈直徑。根據根據NCCLSNCCLS標準，作出標準，

11、作出“敏感敏感”、“耐藥耐藥”和和“中介中介”的判斷。的判斷。幾種抗生素抑菌環(huán)解釋標準及相應的最低抑菌濃度幾種抗生素抑菌環(huán)解釋標準及相應的最低抑菌濃度481513141210IU慶大霉素慶大霉素GEN0.582314221315IU紅霉素紅霉素ERY0.12921282010IU青霉素青霉素GP-G敏感敏感耐藥耐藥敏感敏感中介中介耐藥耐藥相應的相應的MIC（g/ml）抑菌環(huán)直徑（抑菌環(huán)直徑（mm）紙片紙片含藥量含藥量抗生素抗生素代號代號（五）藥物敏感試驗結果解釋（五）藥物敏感試驗結果解釋 “敏感敏感”（susceptible，S）：表示測試菌可被）：表示測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內達

12、到的血藥濃測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制；度所抑制；“耐藥耐藥”（resistant，R）：表示測試菌不能被在）：表示測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效。臨床治療無效。“中介中介”（intermediate，I）：表示測試菌對常）：表示測試菌對常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應率低于規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效敏感株，使用高于正常給藥量有療效。 v挖溝法：挖溝法：v1、在瓊脂平板上挖溝，溝兩邊垂直劃線接種、在瓊脂平板上挖溝，溝兩邊垂直劃線接種各種試驗菌，溝

13、內加入藥液。各種試驗菌，溝內加入藥液。v2、培養(yǎng)后，根據溝兩邊所生長的試驗菌離溝、培養(yǎng)后，根據溝兩邊所生長的試驗菌離溝的距離來判斷藥物對試驗菌的抗菌作用強弱。的距離來判斷藥物對試驗菌的抗菌作用強弱。v適用于在一個平板上試驗適用于在一個平板上試驗一種藥物對幾種不一種藥物對幾種不同試驗菌同試驗菌的抗菌作用。的抗菌作用。v 瓊脂擴散法具有方法簡便，技術要求不瓊脂擴散法具有方法簡便，技術要求不高，易掌握操作的特點。但精確度不高，一高，易掌握操作的特點。但精確度不高，一般能用于般能用于定性或初步判斷其作用的強弱定性或初步判斷其作用的強弱。v 液體稀釋法是一種測定藥物的抗菌作用液體稀釋法是一種測定藥物的抗

14、菌作用定量方法定量方法，較瓊脂擴散法精確，因而運用較，較瓊脂擴散法精確，因而運用較普遍普遍 。 v凡能抑制試驗菌生長的最高藥物稀釋度為該凡能抑制試驗菌生長的最高藥物稀釋度為該藥的藥的最低抑菌濃度最低抑菌濃度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）。）。 v以培養(yǎng)后無細菌生長的最高藥物稀釋度為以培養(yǎng)后無細菌生長的最高藥物稀釋度為最最小殺菌濃度小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC）。）。 液體連續(xù)稀釋法液體連續(xù)稀釋法v1、在一系列的試管中用液體培養(yǎng)基將試驗藥在一系列的試管中用液體培養(yǎng)基將試驗藥物作連續(xù)對倍稀釋

15、，使藥物的濃度沿試管順物作連續(xù)對倍稀釋，使藥物的濃度沿試管順序成倍遞減。序成倍遞減。v2、再于各管中加入等量的實驗菌，經、再于各管中加入等量的實驗菌，經 1624 h培養(yǎng)后，與陰性及陽性對照管進行對照培養(yǎng)后，與陰性及陽性對照管進行對照觀察。觀察。 v3、將未長細菌的培養(yǎng)液取出，分別轉種瓊脂、將未長細菌的培養(yǎng)液取出，分別轉種瓊脂平皿。如培養(yǎng)后重新長出試驗菌，說明該藥平皿。如培養(yǎng)后重新長出試驗菌，說明該藥僅有抑菌作用。如無菌生長則可以認為該藥僅有抑菌作用。如無菌生長則可以認為該藥物有殺菌作用。物有殺菌作用。 v 在測定中草藥煎劑時，由于有些煎劑顏色在測定中草藥煎劑時，由于有些煎劑顏色較深，肉眼不易

16、分辨是否有效；需再于每管較深，肉眼不易分辨是否有效；需再于每管中取數環(huán)移種于適當的培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后中取數環(huán)移種于適當的培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后觀察有無細菌生長而決定之。觀察有無細菌生長而決定之。體外殺菌試驗技術體外殺菌試驗技術v殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致死活殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致死活性性v1.最低殺菌濃度測定（最低殺菌濃度測定（MBC）v2.活菌計數法活菌計數法v每毫升的活菌每毫升的活菌=菌落數菌落數*稀釋倍數稀釋倍數/稀釋液用量稀釋液用量v致死率致死率=（總菌數（總菌數-活菌數）活菌數）/總菌數總菌數*100%體外殺菌試驗技術體外殺菌試驗技術v3.3.化學消毒劑的效力測定化學消毒劑的效力測定v 標準：苯酚標準：苯酚v酚系數酚系數= =消毒劑的殺菌稀釋度消毒劑的殺菌稀釋度/ /苯酚的殺菌稀苯酚的殺菌稀釋度釋度v酚系數越大，化學消毒劑的效力越高酚系數越大，化學消毒劑的效力越高聯合抗菌試驗技術聯合抗菌試驗技術v主要應用于測定兩種抗菌藥物聯合應用時的主要應用于測定兩種抗菌藥物聯合應用時的相互影響。相互影響。v協(xié)同：