《發(fā)酵工藝原理》綜合實驗小型發(fā)酵罐的使用及發(fā)酵過程中主要生化指標(biāo)測定

1、? ?發(fā)酵工藝原理發(fā)酵工藝原理? ?綜合實驗小型發(fā)酵罐的綜合實驗小型發(fā)酵罐的使用及發(fā)酵過程中主要生化指標(biāo)測定使用及發(fā)酵過程中主要生化指標(biāo)測定攪拌攪拌機(jī)械消泡機(jī)械消泡取樣管取樣管接種口接種口空氣過濾器空氣過濾器空氣過濾器空氣過濾器補(bǔ)料、酸、補(bǔ)料、酸、堿口堿口消泡計入口消泡計入口電極入口電極入口冷凝器冷凝器取樣管取樣管補(bǔ)料、酸、補(bǔ)料、酸、堿口堿口轉(zhuǎn)子流量計轉(zhuǎn)子流量計蠕動泵補(bǔ)料、加蠕動泵補(bǔ)料、加酸堿、消泡劑酸堿、消泡劑電源開關(guān)電源開關(guān)進(jìn)氣壓力進(jìn)氣壓力旋鈕旋鈕保護(hù)罩保護(hù)罩壓力表壓力表排氣閥排氣閥平安閥平安閥閥門代號閥門代號用途或名稱用途或名稱S1蒸氣進(jìn)氣管蒸氣進(jìn)氣管W1夾套注水夾套注水W2水進(jìn)冷凝器水

2、進(jìn)冷凝器W3水進(jìn)盤管水進(jìn)盤管W4水自動進(jìn)盤管水自動進(jìn)盤管V1盤管排水盤管排水V2夾套溢流口夾套溢流口V3消毒蒸氣平衡口消毒蒸氣平衡口V4鐘罩排氣口鐘罩排氣口A1安全閥安全閥J1平衡口彈簧夾平衡口彈簧夾J2無菌空氣反沖無菌空氣反沖彈簧夾彈簧夾四、實驗步驟四、實驗步驟n實驗流程：實驗流程：菌種斜面一級種子（250mL搖瓶培養(yǎng)24h二級種子培養(yǎng)10h培養(yǎng)12h3737)(500mL搖瓶） 37發(fā)酵罐 管路準(zhǔn)備 實罐滅菌37放罐發(fā)酵 810h培養(yǎng)基取樣分析測定一菌種準(zhǔn)備一菌種準(zhǔn)備1、配制培養(yǎng)基、配制培養(yǎng)基 配制種子固體培養(yǎng)基配制種子固體培養(yǎng)基100mL，分，分裝試管，裝試管，0.1MPa滅菌滅菌20m

3、in，然后擺成斜面。然后擺成斜面。配制種子培養(yǎng)液配制種子培養(yǎng)液600mL，分裝，分裝50mL于一個于一個250mL三角瓶中三角瓶中 作 一 級 種 子 瓶 ， 余 下 作 一 級 種 子 瓶 ， 余 下550mL平均分裝于三個平均分裝于三個500mL三角瓶中作二級種子用，三角瓶中作二級種子用，同上滅菌。同上滅菌。2、接種與培養(yǎng)、接種與培養(yǎng)n上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜面，面，3737培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h。n上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級種子上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級種子瓶，瓶， 37 37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)12h12h，然后轉(zhuǎn)接二級，然后轉(zhuǎn)接二級種子瓶

4、，種子瓶， 37 37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)10h10h。二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌n洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管n配制發(fā)酵培養(yǎng)基配制發(fā)酵培養(yǎng)基5.0L5.0L，置發(fā)酵罐內(nèi)，參加幾滴泡敵。，置發(fā)酵罐內(nèi)，參加幾滴泡敵。 n校正校正pHpH電極和溶氧電極和溶氧DODO電極。電極。 n把電極插口、取樣管、補(bǔ)料口、消泡劑料瓶等固定、密封好把電極插口、取樣管、補(bǔ)料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套出、進(jìn)水閥后，開夾套出、進(jìn)水閥V2V2、W1W1，使夾套充滿水，用保護(hù)罩蓋，使夾套充滿水，用保護(hù)罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護(hù)罩頂部排氣住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒

5、螺釘鎖緊法蘭，開保護(hù)罩頂部排氣閥閥V4V4，啟動蒸氣發(fā)生器，啟動攪拌馬達(dá)，調(diào)轉(zhuǎn)速，啟動蒸氣發(fā)生器，啟動攪拌馬達(dá)，調(diào)轉(zhuǎn)速300r/min300r/min，開啟冷凝水出水閥開啟冷凝水出水閥V1V1，開啟蒸氣閥門，開啟蒸氣閥門S1S1，進(jìn)行在位滅菌。，進(jìn)行在位滅菌。 二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌n當(dāng)保護(hù)罩頂部閥門當(dāng)保護(hù)罩頂部閥門V4V4有蒸氣排出時，有蒸氣排出時，2min2min后關(guān)閉閥后關(guān)閉閥門，當(dāng)罐溫接近滅菌溫度時，微開閥門，當(dāng)罐溫接近滅菌溫度時，微開閥V4V4適當(dāng)排氣，適當(dāng)排氣，并調(diào)整蒸氣閥并調(diào)整蒸氣閥S1S1維持罐溫。保溫結(jié)束后，關(guān)蒸氣閥維持罐溫。保溫結(jié)束后，關(guān)蒸氣閥S1

6、S1，全開冷凝水出水閥，全開冷凝水出水閥V1V1，開進(jìn)水閥，開進(jìn)水閥W3W3，將溫度設(shè)，將溫度設(shè)定在定在3737，切入自動。，切入自動。n當(dāng)溫度降到當(dāng)溫度降到100100以下，緩緩開排氣閥以下，緩緩開排氣閥V4V4，使保護(hù)，使保護(hù)罩頂壓力表指示為零，移去保護(hù)罩。罩頂壓力表指示為零，移去保護(hù)罩。 二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌n連接通氣管路，將進(jìn)氣過濾器連接通氣管路，將進(jìn)氣過濾器K7K7口與控制臺左側(cè)口與控制臺左側(cè)空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機(jī)電源，空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機(jī)電源，對發(fā)酵罐進(jìn)行通氣，調(diào)整空氣流量對發(fā)酵罐進(jìn)行通氣，調(diào)整空氣流量3 35L/min

7、5L/min。 n當(dāng)溫度到達(dá)當(dāng)溫度到達(dá)3737時，將預(yù)先滅菌的時，將預(yù)先滅菌的pHpH電極、電極、DODO電電極極75%75%酒精消毒、酒精消毒、UVUV消毒接入發(fā)酵罐，連接消毒接入發(fā)酵罐，連接各電極導(dǎo)線。各電極導(dǎo)線。二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌二上罐前的準(zhǔn)備及實罐滅菌n將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作開關(guān)選擇堿泵，翻開手動開關(guān)，使膠管內(nèi)充滿液開關(guān)選擇堿泵，翻開手動開關(guān)，使膠管內(nèi)充滿液體，將輸出上限設(shè)在體，將輸出上限設(shè)在15%15%，下限設(shè)為，下限設(shè)為“0“0，待一，待一切準(zhǔn)備就緒，將切準(zhǔn)備就緒，將“手動手動開關(guān)調(diào)節(jié)到開關(guān)調(diào)節(jié)到“自動自動狀狀態(tài)。

8、態(tài)。n設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min300r/min、空氣流量、空氣流量2 23L/min3L/min、pH7.0pH7.0、DO100%DO100%，系統(tǒng)進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)。，系統(tǒng)進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)。 三發(fā)酵操作三發(fā)酵操作n當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度到達(dá)并維持在所需溫度后，進(jìn)行當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度到達(dá)并維持在所需溫度后，進(jìn)行如下操作：如下操作：n取樣：松開彈簧夾取樣：松開彈簧夾J2J2，用無菌空氣將取樣管殘液，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2J2，將出料管放入接料瓶，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾松開取樣管彈簧夾J3J3，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開

9、J2J2、J3J3排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J2J2、J3J3。三發(fā)酵操作三發(fā)酵操作n接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點燃酒精棉，在火焰保護(hù)下，翻開接種口，倒入點燃酒精棉，在火焰保護(hù)下，翻開接種口，倒入二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種后立即進(jìn)行第一次取樣，用于測定細(xì)菌后立即進(jìn)行第一次取樣，用于測定細(xì)菌OD值。值。 四發(fā)酵過程中的管理四發(fā)酵過程中的管理n每小時記錄發(fā)酵過程溫度、每小時記錄發(fā)酵過程溫度、pHpH、DODO、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測定數(shù)值，并記錄操作情況。定

10、數(shù)值，并記錄操作情況。n注意發(fā)酵罐運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在適注意發(fā)酵罐運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在適宜的范圍內(nèi)，遇有故障及時排除。宜的范圍內(nèi)，遇有故障及時排除。( (例：當(dāng)在某一時段例：當(dāng)在某一時段泡沫大量生成時，系統(tǒng)消泡不運(yùn)轉(zhuǎn)，可將消泡泵切入泡沫大量生成時，系統(tǒng)消泡不運(yùn)轉(zhuǎn)，可將消泡泵切入到手動參加幾滴消泡劑到手動參加幾滴消泡劑) )。n每小時取一次樣。每次取樣每小時取一次樣。每次取樣50mL50mL。取樣時，用量筒準(zhǔn)。取樣時，用量筒準(zhǔn)確取流出的培養(yǎng)液確取流出的培養(yǎng)液50mL, 50mL, 對號倒入三角瓶中，封口，對號倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。立即放入冰箱保存。五放

11、罐五放罐n經(jīng)過發(fā)酵約經(jīng)過發(fā)酵約10h10h后，菌量增長后，菌量增長ODOD值緩慢時，值緩慢時，便可放罐。排放液需經(jīng)滅菌處理才可進(jìn)入下水道。便可放罐。排放液需經(jīng)滅菌處理才可進(jìn)入下水道。 n 六清洗六清洗n放罐后，將發(fā)酵罐清洗干凈，關(guān)閉所有電源。放罐后，將發(fā)酵罐清洗干凈，關(guān)閉所有電源。七發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的測定七發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的測定 n樣品處理：樣品處理：n 樣品樣品振蕩均勻振蕩均勻取樣取樣5mL測測OD值值 n 離心離心3000rpm，10min)n n 上清液上清液 n 測定總糖測定總糖七發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定七發(fā)酵過程中各生化指標(biāo)的測定n總糖的測定：見食品分析總糖的測定：見食品分

12、析P157“復(fù)原糖的測定復(fù)原糖的測定。n吸光度：吸光度：n 將將721分光光度計開機(jī)，選用分光光度計開機(jī)，選用A600波長，預(yù)熱波長，預(yù)熱20min，用蒸餾水調(diào)節(jié)零點，將對照樣倒入比色杯中，作為空白對用蒸餾水調(diào)節(jié)零點，將對照樣倒入比色杯中，作為空白對照，并對不同樣液依次進(jìn)行測定，對濃度大的菌懸液用對照，并對不同樣液依次進(jìn)行測定，對濃度大的菌懸液用對照樣適當(dāng)稀釋后測定，使其照樣適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在值在0.11.0之間，經(jīng)稀釋之間，經(jīng)稀釋后測定的后測定的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。值。七發(fā)酵過程中各生理指標(biāo)的測定七發(fā)酵過程中各生理指標(biāo)的測

13、定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制n菌體干重：取菌體干重：取10mL離心管，于離心管，于105烘烘2h至恒重，用鑷子夾取入至恒重，用鑷子夾取入枯燥器，待冷卻后于分析天平上稱重枯燥器，待冷卻后于分析天平上稱重W0，精確到小數(shù)后，精確到小數(shù)后4位，位，然后準(zhǔn)確取然后準(zhǔn)確取10mL發(fā)酵液，于發(fā)酵液，于3000rpm離心離心10min，棄去上清液，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，于用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，于100烘至恒重，烘至恒重，用鑷子夾取入枯燥器中冷卻，于分析天平上稱重用鑷子夾取入枯燥器中冷卻，于分析天平上稱重W1，精確，精確到小數(shù)后到小數(shù)后4位，得細(xì)胞干重為位，得細(xì)胞干

14、重為W1W0。n取同一發(fā)酵液，稀釋取同一發(fā)酵液，稀釋2、5、10、20、50倍，于倍，于600nm下測下測OD值。值。n以以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，菌液濃度值為縱坐標(biāo)，菌液濃度g/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五實驗報告內(nèi)容五實驗報告內(nèi)容一整理發(fā)酵過程中所測定的各種數(shù)據(jù)資料。以一整理發(fā)酵過程中所測定的各種數(shù)據(jù)資料。以時間為橫坐標(biāo)，干菌體濃度時間為橫坐標(biāo)，干菌體濃度Xg/L，葡萄糖濃，葡萄糖濃度度Sg/L，pH等為縱坐標(biāo)，觀察并分析各參數(shù)等為縱坐標(biāo)，觀察并分析各參數(shù)的變化規(guī)律。的變化規(guī)律。二以作圖方式求出大腸桿菌的最大比生長速率二以作圖方式求出大腸桿菌的最大比生長速率和以消耗葡萄糖

15、為基準(zhǔn)的平均細(xì)胞得率系數(shù)。和以消耗葡萄糖為基準(zhǔn)的平均細(xì)胞得率系數(shù)。 SXYSX/)/(dtXdXm五實驗報告內(nèi)容五實驗報告內(nèi)容三要求三要求 1、實驗報告以小組為單位、實驗報告以小組為單位(每個小組由每個小組由5-6人組人組成成)，自由組合，但需包括實驗各局部人員。內(nèi)，自由組合，但需包括實驗各局部人員。內(nèi)容：按論文格式，包括摘要、關(guān)鍵詞、前言、容：按論文格式，包括摘要、關(guān)鍵詞、前言、材料與方法、結(jié)果與分析。材料與方法、結(jié)果與分析。 2、實驗報告一律用電腦打印，用、實驗報告一律用電腦打印，用Excel作圖。作圖。 3、實驗報告首頁寫明班級、姓名親筆簽名。、實驗報告首頁寫明班級、姓名親筆簽名。實驗報告完成后由班里統(tǒng)一交齊。實驗報告完成后由班里統(tǒng)一交齊。n注：取樣：每次注：取樣：每次50mL。取樣時松開彈簧夾。取樣時松開彈簧夾J2，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，將出用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，再夾，再夾緊緊J2，發(fā)酵液被壓入接料瓶，發(fā)酵液被壓入接料瓶(或量筒或量筒)，當(dāng)?shù)竭_(dá)，當(dāng)?shù)竭_(dá)40mL時，松開時，松開J2排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊排出取樣管內(nèi)殘