PCR實(shí)驗(yàn)教學(xué)組織

1、pcr特異性擴(kuò)增特異性擴(kuò)增dna片段片段 北京四中北京四中 趙曉剛趙曉剛課標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)課標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)活動(dòng)建議活動(dòng)建議嘗試嘗試pcrpcr（ polymerase chain reaction）技術(shù)的基）技術(shù)的基本操作和應(yīng)用本操作和應(yīng)用用某一片段進(jìn)行用某一片段進(jìn)行pcrpcr擴(kuò)增擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 1、pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增特異性技術(shù)擴(kuò)增特異性dnadna2 2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備三、教學(xué)組織三、教學(xué)組織一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備1、pcr儀儀（1）美國(guó)）美國(guó)mj research minicycler （

2、2）德國(guó)）德國(guó)eppendorf產(chǎn)品產(chǎn)品 一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備2、移液器、移液器（1）德國(guó)德國(guó)eppendorf（2）芬蘭芬蘭 thermo scientific finnpipette一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備3、滅菌鍋、滅菌鍋一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備4、離心機(jī)、離心機(jī)一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備5、電泳儀、電泳儀北京六一儀器廠北京六一儀器廠川布蘭公司川布蘭公司一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備三、教學(xué)組織三、教學(xué)組織二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（課前）（課前）（一）（一）pcrpcr準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作1 1、人性別鑒定試劑盒、人性別鑒定試劑盒（克隆（克隆y y染色

3、體染色體srysry基因）基因）組成成分含量加ddh2o量ddh2o220l10xbuffer+mgcl230ldntp mixture7l引物引物0.1od40l引物引物0.1od40l taq dna聚合酶聚合酶5l（1 1）在引物管中各加入）在引物管中各加入40l ddh40l ddh2 2o o，充分溶解，充分溶解 ，離心備用，離心備用（2 2）4 4位同學(xué)一組，上課前位同學(xué)一組，上課前1515分鐘，每個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)上擺放好一個(gè)兩面分鐘，每個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)上擺放好一個(gè)兩面板（上面要擺上板（上面要擺上2 2個(gè)滅菌的個(gè)滅菌的0.2ml0.2ml離心管離心管），一個(gè)冰盒（含上表試），一個(gè)冰盒（含上表試劑）

4、，劑），2 2支移液器，一盒滅菌支移液器，一盒滅菌10l10l吸頭，一把剪刀，一個(gè)廢液缸吸頭，一把剪刀，一個(gè)廢液缸（燒杯），（燒杯），1 1記號(hào)筆。記號(hào)筆。4人一組的儀人一組的儀器和試劑器和試劑2.2.學(xué)生操作學(xué)生操作10xbuffer10xbuffer 4l 4ldntp mixturedntp mixture0.8l0.8l引物引物 1l 1l引物引物 1l 1lddhddh2 2o o12.6l12.6ltaq dnataq dna聚合酶聚合酶 0.6l 0.6l 1ul12.4ul教師與提供試劑公司進(jìn)行協(xié)調(diào)，技術(shù)人員做預(yù)實(shí)驗(yàn)教師與提供試劑公司進(jìn)行協(xié)調(diào)，技術(shù)人員做預(yù)實(shí)驗(yàn)3.pcr3.pc

5、r程序設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì) 循環(huán)溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)預(yù)變性9430s變性9420s25次退火5220s延伸7220s保溫7230s（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（二）電泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1、瓊脂糖凝膠電泳試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳試劑盒組成成分組成成分分裝量分裝量瓊脂糖40.25gdna marker30l50電泳緩沖液20ml核酸熒光染料80l6loading buffer80l0.5ml的離心管1包（25個(gè)/包）（1 1）將）將5050電泳緩沖液稀釋成電泳緩沖液稀釋成1 1電電泳緩沖液（即泳緩沖液（即20ml 5020ml 50電

6、泳緩沖電泳緩沖液中加入液中加入980ml 980ml 蒸餾水，稀釋成蒸餾水，稀釋成1l1l的的1 1電泳緩沖液）電泳緩沖液）（2 2）制備）制備2 2塊膠備用塊膠備用（3 3）將）將6 6loading bufferloading buffer和核酸熒光染料各取和核酸熒光染料各取30l30l，充分混勻，然后取充分混勻，然后取2424個(gè)個(gè)0.2ml 0.2ml 離心管，每管分離心管，每管分2l2l的混合的混合物，置于學(xué)生的兩面板上備用物，置于學(xué)生的兩面板上備用一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備三、三、教學(xué)組織（教學(xué)組織（2節(jié)課時(shí)間）節(jié)課時(shí)間）三、教學(xué)組織三、教學(xué)組織（2節(jié)課時(shí)間

7、）節(jié)課時(shí)間）（一）第（一）第1節(jié)課節(jié)課1 1、pcrpcr條件和原理?xiàng)l件和原理（10min10min）2 2、移液器的使用、移液器的使用（5min5min）3 3、配置反應(yīng)體系、配置反應(yīng)體系（10min10min）4 4、pcrpcr程序設(shè)計(jì)和反應(yīng)程序設(shè)計(jì)和反應(yīng)5 5、教師將反應(yīng)后體系、教師將反應(yīng)后體系-20-20保存保存三、教學(xué)組織三、教學(xué)組織（2節(jié)課時(shí)間）節(jié)課時(shí)間）（二）第（二）第2節(jié)課節(jié)課1 1、電泳原理、電泳原理（5min5min）2 2、膠的制備、膠的制備（5min5min）3 3、染色、點(diǎn)樣、染色、點(diǎn)樣（5min5min）4 4、電泳約、電泳約20min20min（繼續(xù)按進(jìn)度講課或

8、學(xué)生觀摩）（繼續(xù)按進(jìn)度講課或?qū)W生觀摩）5 5、觀察、觀察（下課前（下課前5min5min）三、教學(xué)組織三、教學(xué)組織 （僅供參考）（僅供參考）問(wèn)題問(wèn)題1.1.體內(nèi)體內(nèi)dnadna復(fù)制的條件？復(fù)制的條件？問(wèn)題問(wèn)題2.2.體內(nèi)體內(nèi)dnadna復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制的特點(diǎn)？問(wèn)題問(wèn)題3.3.如果只復(fù)制特定如果只復(fù)制特定dnadna片片段（段（gene2gene2）呢？）呢？一、一、pcrpcr的原理和條件（的原理和條件（10min10min）( (一一) )、pcrpcr的原理和條件的原理和條件1.1.原理原理 變性變性 退火退火 延伸延伸 2.2.條件條件 模板模板dnadna 引物（保證復(fù)制的精確起始）引物

9、（保證復(fù)制的精確起始） 4 4種脫氧核糖核苷三磷酸種脫氧核糖核苷三磷酸 dnadna聚合酶聚合酶(二)、pcr實(shí)驗(yàn)操作1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?pcrpcr擴(kuò)增人類(lèi)性別決定基因擴(kuò)增人類(lèi)性別決定基因srysry，并檢測(cè)，并檢測(cè)2.2.實(shí)驗(yàn)材料和器具實(shí)驗(yàn)材料和器具 2.12.1男生男生2 2根帶有明顯毛囊的頭發(fā)根帶有明顯毛囊的頭發(fā) 女生女生2 2根作對(duì)照根作對(duì)照2.2 2.2 移液器、吸頭、移液器、吸頭、 離心管離心管 每取一種試劑更換槍頭每取一種試劑更換槍頭,每位同學(xué)嘗試用移液器一次每位同學(xué)嘗試用移液器一次 2.3 2.3 人性別鑒定試劑人性別鑒定試劑3.3.配制反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系（10min10min）

10、a a10xbuffer 4ldntp mixture0.8l引物 1l引物 1lddh2o12.6ltaq dna聚合酶 0. .6l 循環(huán)溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)1預(yù)變性9430s2變性9420s25次3退火5220s4延伸7220s5保溫7230s4.pcr程序設(shè)計(jì)（10分鐘）b5、教師將反應(yīng)后體系、教師將反應(yīng)后體系-20保存保存作業(yè)：作業(yè)： 已知已知dna聚合酶合成聚合酶合成dna的速度是的速度是1000堿基堿基/min,克隆克隆1500bp基因，基因，75min理論上能合成該基理論上能合成該基因的數(shù)目約是？（已知變性因的數(shù)目約是？（已知變性30s，退火，退火30s） 230 思考：思考：pcrpcr實(shí)驗(yàn)結(jié)束后如何鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后如何鑒定是否克隆到是否克隆到srysry基因呢？基因呢？ 三、電泳三、電泳 1.1.原理原理 瓊脂糖凝膠電泳常用于瓊脂糖凝膠電泳常用于dnadna、 rnarna大片段的分離，大片段的分離，核酸磷酸基團(tuán)核酸磷酸基團(tuán) 帶負(fù)電荷可向陽(yáng)極移動(dòng)，在電