雙水相萃取的原理及應(yīng)用

1、雙水相萃取的原理及應(yīng)用Aqueous two-phase extractionAqueous two-phase extraction2014210918 2014210918 康文淵康文淵組員:NF-B信號(hào)通路 劉文榮 王嘉犀 范倩 何亞玲英英釋義 內(nèi)容內(nèi)容 Content1、雙水相萃取的歷史2.雙水相萃取的基本原理3.雙水相萃取的特點(diǎn)4.雙水相萃取的應(yīng)用ATPE 的歷史：ATPE 的歷史：Beijerinck （？-） 早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),得到一個(gè)混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉), 這種現(xiàn)象

2、被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueous two phase system,ATPS)。ATPE 的歷史：ATPE 的歷史： 1956年瑞典lund大學(xué)的Albertsson教授及其同事開始對(duì)雙水相系統(tǒng)進(jìn)行比較系統(tǒng)研究。測(cè)定了許多雙水相系統(tǒng)的相圖，為雙水相萃取系統(tǒng)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。只局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的測(cè)定和理論研究。ATPE 的歷史：ATPE 的歷史： Kula教授研究小組對(duì)雙水相的應(yīng)用、工藝流程、操作參數(shù)、工程設(shè)備、成本分析等進(jìn)行了大量研究，在應(yīng)用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術(shù)用于酶的大規(guī)模分離純化。ATPE 的歷史：ATPE 的歷史： 雙水相萃取可分離多肽、蛋

3、白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組織，以及重金屬離子等，近年來，還應(yīng)用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應(yīng)系統(tǒng)用于酶反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 萃取：利用物質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進(jìn)行分離的技術(shù)。 有機(jī)溶劑萃取：以與水互不相溶的有機(jī)溶劑作萃取劑從水相中萃取目的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)。用于蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的分離很少成功。 反萃?。菏褂盟芤簭挠袡C(jī)溶劑中萃取水溶性的物質(zhì)。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 反膠團(tuán)萃?。豪帽砻婊钚詣?/p>

4、在有機(jī)相中形成的反膠團(tuán)（reversed micelles），從而在有機(jī)相內(nèi)形成分散的親水微環(huán)境。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 反膠團(tuán)萃?。菏股锓肿釉谟袡C(jī)相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團(tuán)的親水微環(huán)境中，消除了生物分子，特別是蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難于溶解在有機(jī)相中或在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。 超臨界萃?。?ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 以上方法對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化有不同的缺陷。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 到目前為止，雙水相技術(shù)幾乎在所有的生物物質(zhì)如:氨基酸、多肽、核酸、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、各類細(xì)胞、病毒等的分離純化中得到應(yīng)用, 特別是成功地應(yīng)用在

5、蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 雙水相萃取與水-有機(jī)相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時(shí),物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等) 的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG) / 葡聚糖(簡稱Dextran) 高聚物/無機(jī)鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/ 無機(jī)鹽體系為: PEG/ 硫酸鹽或磷

6、酸鹽體系。 常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)Kpi = 磷酸鉀DX = 葡聚糖(dextran)常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理PEG/Dx體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細(xì)胞等，PEG/無機(jī)鹽體系主要用來大規(guī)模地提純酶，這是因?yàn)镻EG/無機(jī)鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價(jià)格昂貴的緣故。 ATPE 的基本原理各各種種類類型型的的雙雙水水相相體體系系相圖:相平衡時(shí)物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系 ATPE 的基本原理相圖:相平衡時(shí)物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系 ATPE 的基本原理雙節(jié)線(bi-nodal)：圖中

7、的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS 。 系線(tie line)：雙節(jié)線上連兩點(diǎn)的直線。K點(diǎn)：K點(diǎn)為臨界點(diǎn)，表示兩相差別消失。相圖:相平衡時(shí)物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系 ATPE 的基本原理系線反映的信息 杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同 的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則 性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對(duì)差別的尺度, 系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理聚合物分子量的影響： 對(duì)于給定的相系統(tǒng)，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物

8、質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側(cè)分配。 影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理聚合物分子量的影響： 如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40（MW 40 000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質(zhì)如細(xì)胞色素C分配系數(shù)增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質(zhì)，如過氧化氫酶的分配系數(shù)可增大到原來的67倍。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理pH 值的影響：改變兩相的電位差 如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大， 則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。 pH值的變化也會(huì)影響磷酸鹽的離解程度，導(dǎo)致組成體系的物質(zhì)電性發(fā)生變化，

9、也會(huì)使被分離物質(zhì)的電荷發(fā)生改變，從而影響分配的進(jìn)行。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理離子環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響: 在雙水相聚合物系統(tǒng)中，加入電解質(zhì)時(shí)，其陰陽離子在兩相間會(huì)有不同的分配。 同時(shí)，由于電中性的約束, 存在一穿過相界面的電勢(shì)差(Donnan電勢(shì)) ,它是影響荷電大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分配的主要因素。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理例如，DNA萃取時(shí)，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉(zhuǎn)移到另一相。 ATPE 的基本原理離子液體BmimPF6直接萃取DNA ATPE 的基本原理基于離子液體BmimPF6的雙水相體系直接萃取牛血清蛋白。雙水相的特點(diǎn)

10、 ATPE 的特點(diǎn)對(duì)生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化方面的優(yōu)勢(shì)：(1)含水量高(7090)，在接近生理環(huán)境的體系中進(jìn)行萃取，避免生物活性物質(zhì)失活或變性。(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或酶），可直接提取細(xì)胞內(nèi)酶，避免破碎或過濾等步驟。雙水相的特點(diǎn) ATPE 的基本原理(3)分相時(shí)間短，自然分相時(shí)間一般為5min15 min。(4)界面張力小(10-7 10-4mNm)，利于兩相之間的質(zhì)量傳遞。(5)不存在有機(jī)溶劑殘留問題，高聚物不易揮發(fā)，對(duì)人體無害。雙水相的特點(diǎn) ATPE 的基本原理(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去。(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純

11、工序可直接相連接，無需進(jìn)行特殊處理。(8)操作條件溫和，在常溫常壓下進(jìn)行。(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。雙水相的特點(diǎn) ATPE 的基本原理雖然該技術(shù)在應(yīng)用方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但幾乎都是建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，到目前為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機(jī)理以及生物分子在系統(tǒng)中的分配機(jī)理。雙水相的特點(diǎn) ATPE 的基本原理不足之處:如易乳化、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等,雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的基本原理雙水相系統(tǒng)平衡時(shí)間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境。它還具備操作簡便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)、易于放大。據(jù)報(bào)道，系統(tǒng)可從10ml直

12、接放大到1m3規(guī)模（105倍）,而各種試驗(yàn)參數(shù)均可按比例放大，產(chǎn)物收率并不降低。 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的基本原理英英釋義1、蛋白質(zhì)、酶的純化2、多肽的分離純化3、核酸的分離純化4、其它分離純化雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的基本原理主要是分離蛋白質(zhì) ，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細(xì)胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的基本原理1) 蛋白質(zhì)、酶的純化2) 多肽的分離純化雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的基本原理目前，用此法來提純的酶已達(dá)數(shù)十種，其分離過程也達(dá)到相當(dāng)規(guī)模，I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4

13、體系從Trichoderma koningii發(fā)酵液中分離純化-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數(shù)33。 ATPE 的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第一步：所選擇的條件應(yīng)使蛋白質(zhì)產(chǎn)物分配在富PEG的上相中, 而細(xì)胞碎片及雜質(zhì)蛋白質(zhì)等進(jìn)入下相。 ATPE 的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第二步：分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質(zhì)、蛋白質(zhì)也進(jìn)入下相,而所需的蛋白質(zhì)再次進(jìn)入富含PEG的上相。 ATPE 的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水

14、相分離過程的原則流程:第三步：向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質(zhì)進(jìn)入富鹽的下相,以與大量的PEG分開。蛋白質(zhì)與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術(shù)。 ATPE 的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用3) 核酸的分離純化 ATPE 的應(yīng)用4) 病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞的分離 ATPE 的應(yīng)用4) 病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞的分離雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取 甘草、銀杏液、黃芩苷等的有效成分分離。 謝濤等利用 PEG 4000/ K2HPO4 組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷,回收率為

15、96 %。 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取( 1 )將 PEG和 K2HPO4 配成一定濃度的濃溶液; ( 2)在常溫下, 取三七濃縮液置于10ml的離心試管中, 加入一定體積的成相物質(zhì)濃溶液,振蕩搖勻,在離心機(jī)中以一定轉(zhuǎn)速離心 5min, 使其分相; 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取( 3 )分別讀取上下相體積, 并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用5）中草藥成分的提取 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的

16、應(yīng)用6）雙水相萃取分析 黃毒苷的免疫測(cè)定雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用7）稀有金屬/貴金屬分離 克服溶劑萃取法的不足。 在聚乙二醇 2000/硫酸按/偶氮胂（shen四聲） ( )雙水相體系中 ,實(shí)現(xiàn)了 Ti ( )與 Zr（鋯gao） ( )的分離 雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用7）稀有金屬/貴金屬分離 分別在 60 ml 分液漏斗中加入不同 pH 值的緩沖溶液 2 ml , 偶氮胂 溶液 0. 6 ml , PEG 溶液 5ml和一定量的金 屬離子溶液 , 用 水定容到 10ml , 再加入 2g 固體(NH4) 2SO 4, 振蕩 3 5min , 靜置 , 待兩相分層清楚后 , 將下層水相放入 25ml 比色管中 , 測(cè)定金屬離子在下層水相中的殘留量 , 從而計(jì)算萃取率 。雙水相萃取的應(yīng)用 ATPE 的應(yīng)用7）稀有金屬/貴金屬分離 雙水相萃取的發(fā)展 ATPE 的發(fā)展1）開發(fā)廉價(jià)雙水相體系 2）將雙水相同其它分離技術(shù)相結(jié)合，從而提高分離效率，使雙水相萃取技術(shù)能夠有更高的生命活力！雙水相萃取的發(fā)展 ATPE 的發(fā)展兩種雙水相體系的比較雙水相萃取的發(fā)展 ATPE 的發(fā)展變性淀粉PPT-PEG體系已被用來從發(fā)酵液中分離過氧化氫酶，-半乳糖苷酶等。蛋白溶解度大。粘度小。價(jià)格便宜。雙水相萃取的發(fā)展