食品安全快速檢測(cè)技術(shù)7分子雜交技術(shù)ppt課件

1、分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)一、分子雜交種類一、分子雜交種類二、分子雜交的普通程序二、分子雜交的普通程序三、雜交樣品膜的制備三、雜交樣品膜的制備 四、標(biāo)志探針的制備四、標(biāo)志探針的制備五、分子雜交與結(jié)果檢測(cè)五、分子雜交與結(jié)果檢測(cè)六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)o 分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中能否含有特定的生物分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中能否含有特定的生物分子的一門技術(shù)。分子的一門技術(shù)。樣 品 制 備電 泳雜 交轉(zhuǎn) 膜結(jié)果顯示探探 針針 制制 備備分分 子子 雜雜 交交 流流 程程 圖圖核酸分子雜交核酸分子雜交一一. . 分子雜交種類分子雜交種類

2、 RNA DNA DNA RNA 蛋白質(zhì)1. 按其分子種類劃分按其分子種類劃分 1 DNA雜交雜交探針為探針為DNA或或RNA 2 RNA雜交雜交探針為探針為DNA或或cDNA 3 蛋白質(zhì)免疫分析蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體探針為抗體2. 按樣品制備過程劃分按樣品制備過程劃分 1 原位雜交原位雜交(in situ hybridization) i. 原位菌落雜交原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交原位噬菌斑雜交 iii. 原位細(xì)胞雜交原位細(xì)胞雜交 iv. 原位組織塊雜交原位組織塊雜交 原位裂解細(xì)胞，不需求分別原位裂解細(xì)胞，不需求分別DNA，RNA或蛋白或蛋白質(zhì)樣品，可同時(shí)處置大量樣品，常用于目的基

3、因的質(zhì)樣品，可同時(shí)處置大量樣品，常用于目的基因的挑選或檢測(cè)某類細(xì)胞或組織中能否存在某一特定的挑選或檢測(cè)某類細(xì)胞或組織中能否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列?；虻鞍踪|(zhì)序列。一一. . 分子雜交種類分子雜交種類 3印跡轉(zhuǎn)移雜交印跡轉(zhuǎn)移雜交(blotting hybridization) 先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分別，轉(zhuǎn)先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分別，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測(cè)出感興趣分子的移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測(cè)出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有：分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 分散法分散法 ii. 毛細(xì)管法毛細(xì)管法 iii.

4、 電泳轉(zhuǎn)移法電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空真空轉(zhuǎn)移法。轉(zhuǎn)移法。 根據(jù)轉(zhuǎn)移對(duì)象的不同分為根據(jù)轉(zhuǎn)移對(duì)象的不同分為Southern印記法印記法DNA、Northern印跡法印跡法RNA和和Western 印跡法蛋白質(zhì)。印跡法蛋白質(zhì)。一一. . 分子雜交種類分子雜交種類 2斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交(dot hybridization) 先分別先分別DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在固體基質(zhì)上進(jìn)展雜交，放射自顯影后，判別能否有雜交及其固體基質(zhì)上進(jìn)展雜交，放射自顯影后，判別能否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改動(dòng)的檢測(cè)，半定量雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改動(dòng)的檢

5、測(cè)，半定量分析。分析。 它利用兩種探針與待測(cè)它利用兩種探針與待測(cè)DNA結(jié)合，先結(jié)合，先將不帶標(biāo)志的探針固定在基質(zhì)上，然后用將不帶標(biāo)志的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測(cè)樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，待測(cè)樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)志的探針雜交。這種方法再與第二種帶標(biāo)志的探針雜交。這種方法可用于粗制可用于粗制DNA樣品，可檢測(cè)出樣品，可檢測(cè)出0.2ng的的DNA樣品樣品 4) 夾心雜交法夾心雜交法(sandwich hybridization)*一一. . 分子雜交種類分子雜交種類 1) DNA和和RNA的雜交的雜交 制備制備DNA或或RNA樣品樣品與固定基質(zhì)結(jié)合與固定基質(zhì)結(jié)合

6、80真空固真空固定定預(yù)雜交預(yù)雜交參與標(biāo)志探針雜交參與標(biāo)志探針雜交洗滌洗滌放射自顯影或顯放射自顯影或顯色反響。色反響。 2蛋白質(zhì)的免疫分析蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定常溫空氣中固定封鎖劑封鎖封鎖劑封鎖 一抗反響一抗反響洗滌洗滌二抗二抗-酶偶聯(lián)物反響酶偶聯(lián)物反響洗滌洗滌顯色反響顯色反響EIA 或或 一抗放射標(biāo)志物一抗放射標(biāo)志物洗滌洗滌放射自顯影放射自顯影RIA二、二、 分子雜交的普通程序分子雜交的普通程序1. 固定基質(zhì)的種類與特性固定基質(zhì)的種類與特性 1硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF)

7、可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，能夠?yàn)楸粍?dòng)吸附。可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，能夠?yàn)楸粍?dòng)吸附。 NCF不能結(jié)不能結(jié) 合小分子合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)20,000優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：i. 用于用于DNA，RNA雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大80g/cm2)；可直接染色；分辨率；可直接染色；分辨率高；高； 不需求預(yù)激活；易于操作不需求預(yù)激活；易于操作 缺陷：缺陷： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)運(yùn)用探針次數(shù)有限結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)運(yùn)用探針次數(shù)有限2-3次次 2重氮化紙：重氮化紙：D

8、BM紙與紙與DPT纖維素紙纖維素紙最大特點(diǎn)是能結(jié)合小分子的最大特點(diǎn)是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同 探針進(jìn)探針進(jìn)展多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的才干差，需求激活，分展多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的才干差，需求激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)志物。這類基質(zhì)對(duì)生物大分子是自動(dòng)吸附。析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)志物。這類基質(zhì)對(duì)生物大分子是自動(dòng)吸附。 三、三、 雜交樣品膜的制備雜交樣品膜的制備 3) 尼龍膜尼龍膜 i. 陽離子尼龍膜陽離子尼龍膜 i) 容量大容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的可結(jié)

9、合不同大小的DNA，RNA和蛋白質(zhì)。和蛋白質(zhì)。 iii) 韌性好韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進(jìn)展反復(fù)多次雜交實(shí)驗(yàn)可進(jìn)展反復(fù)多次雜交實(shí)驗(yàn) vi) 廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。 ii. 尼龍尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽離子形狀轉(zhuǎn)變?yōu)闀r(shí)陽離子形狀轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子形狀，時(shí)陰離子形狀，電轉(zhuǎn)移時(shí)要留意。電轉(zhuǎn)移時(shí)要留意。 4離子膜離子膜 i. DEAE-纖維素紙纖維素紙 ii. CM-纖維素紙纖維素紙三、三、 雜交樣品膜的制備雜交樣品膜的制備

10、2. 固定基質(zhì)的選擇根據(jù)固定基質(zhì)的選擇根據(jù) 1強(qiáng)度，耐久性，操作簡(jiǎn)便強(qiáng)度，耐久性，操作簡(jiǎn)便 2高信噪比低本底高信號(hào)高信噪比低本底高信號(hào) 3生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好三、三、 雜交樣品膜的制備雜交樣品膜的制備 3. 各種雜交樣品膜的制備各種雜交樣品膜的制備 1原位雜交樣品膜的制備原位雜交樣品膜的制備 i. 原位菌落雜交樣品膜原位菌落雜交樣品膜(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 (2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇

11、性抗生素但未放濾膜的瓊脂再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)展劃線接種主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)展劃線接種(或打點(diǎn)或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的一樣。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的一樣位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒如位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒如pBR322)的菌落。的菌落。 (3) 倒置平板倒置平板,于于37培育至劃線的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)到培育至劃線的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)到0.5-1.0mm的寬度。的寬度。 (4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在在

12、3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)志。在主平板大致一樣的位置上也作上標(biāo)志。標(biāo)志。在主平板大致一樣的位置上也作上標(biāo)志。 (5) 用用Parafilm膜封好主平板膜封好主平板,倒置貯放于倒置貯放于4,直至獲得雜交反響的結(jié)果。直至獲得雜交反響的結(jié)果。 (6) 裂解細(xì)菌裂解細(xì)菌,按下述方法按下述方法,使釋放的使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。 I II III IV55510% SDS0.5N NaOH1M Tris pH7.4 1.5M NaCl+0.5M Tris pH7.480真空干燥 i) 細(xì)胞培育高密度，幾百細(xì)胞培育高密度，幾百十萬個(gè)菌落或低密度，幾百十萬個(gè)

13、菌落或低密度，幾百個(gè)以下個(gè)以下 ii) 細(xì)菌細(xì)胞原位裂解與細(xì)菌細(xì)胞原位裂解與DNA變性變性 ii. 原位噬菌斑雜交樣品膜原位噬菌斑雜交樣品膜 i) 細(xì)胞感染和噬菌斑構(gòu)成細(xì)胞感染和噬菌斑構(gòu)成10,000-20,000/平板平板 ii) 噬菌體轉(zhuǎn)移噬菌體轉(zhuǎn)移用用NCF作影印作影印 iii) DNA變性與固定與上同變性與固定與上同三、三、 雜交樣品膜的制備雜交樣品膜的制備 2 斑點(diǎn)雜交樣品膜的制備斑點(diǎn)雜交樣品膜的制備 制備樣品制備樣品點(diǎn)樣點(diǎn)樣固定可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣固定可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣NCF濾紙點(diǎn)樣板支撐板至真空泵廢液儲(chǔ)槽96孔128三、三、 雜交樣品膜的制備雜交樣品膜的制備 3轉(zhuǎn)移雜交

14、樣品膜的制備轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 分散法分散法Difusion blotting method ) 3MM濾紙NCF凝膠NCF3MM濾紙用于轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，全部裝置浸在緩沖液中1.5-2天紙巾3MMNCF凝膠NCF3MM紙巾玻璃轉(zhuǎn)移核酸時(shí)不需 浸在緩沖液中重物 玻板簡(jiǎn)單但不能定量簡(jiǎn)單但不能定量轉(zhuǎn)移，與電轉(zhuǎn)比轉(zhuǎn)移，與電轉(zhuǎn)比較只能轉(zhuǎn)移較只能轉(zhuǎn)移25-50%的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 ii. 毛細(xì)管法毛細(xì)管法 (Capillary blotting method )毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)所產(chǎn)生的牽引力量毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)所產(chǎn)生的牽引力量將將DNA或或RNA自膠體轉(zhuǎn)移至

15、膜上。要轉(zhuǎn)印完全，起碼需求作用自膠體轉(zhuǎn)移至膜上。要轉(zhuǎn)印完全，起碼需求作用6 h以上。以上。 雖然所需破費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，以其不需求特別的儀雖然所需破費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，以其不需求特別的儀器設(shè)備，毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。器設(shè)備，毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。 紙巾3MMNCF凝膠重物 玻板濾紙緩沖液6SSC支撐物玻板Southern、Northern印跡印跡iii. 電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting ) ：半干法和濕法電轉(zhuǎn)。：半干法和濕法電轉(zhuǎn)。凝膠3MM濾紙-+緩沖液儲(chǔ)槽NCF濾紙凝膠多孔分離器骨架(支撐用)緩沖液收集槽iv. 真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllot

16、ting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的厚度成反比，在一樣轉(zhuǎn)移率轉(zhuǎn)移速度與凝膠的厚度成反比，在一樣轉(zhuǎn)移率50%時(shí)，時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快真空法比毛細(xì)管法快13倍，其損失僅倍，其損失僅6%，而毛細(xì)管法損失率，而毛細(xì)管法損失率20%。 v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 分散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需求特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低分散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需求特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,分分散法為散法為70%，毛細(xì)管法，毛細(xì)管法80%耗時(shí)多。耗時(shí)多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。 iii)

17、真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi. 轉(zhuǎn)移的最正確條件轉(zhuǎn)移的最正確條件 i) 固定基質(zhì)的選擇固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處置：轉(zhuǎn)移前預(yù)處置：DNA和和RNA分子變性，蛋白質(zhì)那么需除去凝膠中的分子變性，蛋白質(zhì)那么需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移大分子的轉(zhuǎn)移對(duì)于分子量較大的對(duì)于分子量較大的DNA片段，必需進(jìn)展原位斷裂后再進(jìn)展轉(zhuǎn)移，斷裂片段，必需進(jìn)展原位斷裂后再進(jìn)展轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子分子最正確長(zhǎng)度為最正確長(zhǎng)度為1-2kb。 其步驟是：其步驟是： 0.25M HCl處置凝膠兩次每次處置凝膠兩次每次15分鐘分鐘水洗水洗0

18、.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次兩次，每次15分鐘分鐘轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。 對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一：對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中參與解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中參與SDS。四四. . 標(biāo)志探針的制備標(biāo)志探針的制備P-O-P-O-P-OH脫氧核苷脫氧核苷(或核苷)P-O-P-OH32P腺苷NCH=CH-CH -NH-C (CH ) -224CH -O-P-O-P-O-P-OH2O 1. 標(biāo)志化合物的種類標(biāo)志化合物的種類 1放射性同位素標(biāo)放射性同位素標(biāo)志物志物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)志；用于蛋

19、白質(zhì)標(biāo)志；32P，3H，35S用于核酸標(biāo)志，其中用于核酸標(biāo)志，其中32P和和35S運(yùn)用頻率運(yùn)用頻率高。高。32P標(biāo)志核苷酸的標(biāo)志核苷酸的位或位或位，位，35S那么那么是標(biāo)志核苷酸的是標(biāo)志核苷酸的位位. 2) 非放射性標(biāo)志物非放射性標(biāo)志物 i. 生物素生物素 分別自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分別自蛋清中分別自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分別自蛋清中的一種堿性蛋白的一種堿性蛋白抗生物素蛋白結(jié)實(shí)地結(jié)合。每個(gè)抗生抗生物素蛋白結(jié)實(shí)地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合物素蛋白可結(jié)合4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更結(jié)實(shí)，可大大提高其靈敏度。與生物素結(jié)合更結(jié)實(shí)，

20、可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合構(gòu)成標(biāo)志生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合構(gòu)成標(biāo)志化合物?；衔铩?ii. 半抗原半抗原 包括汞，包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP脫氧脫氧尿三磷酸上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上尿三磷酸上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上述標(biāo)志物的方法是利用二抗述標(biāo)志物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反響和顯色反響。酶偶聯(lián)物反響和顯色反響。 iii. 蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)志物蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)志物 i) 酶偶聯(lián)二抗酶偶聯(lián)二

21、抗0.05ng ii) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A來自金黃色葡萄球菌。可作用于大多數(shù)哺乳動(dòng)來自金黃色葡萄球菌。可作用于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的物的IgG免疫球蛋白，靈敏度較低免疫球蛋白，靈敏度較低5ng iii) 免疫金免疫金immunogold 0.1-0.5ng3) 兩類標(biāo)志化合物的比較兩類標(biāo)志化合物的比較 i. 靈敏度靈敏度 i ) 檢測(cè)蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。檢測(cè)蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。 ii) 檢測(cè)核酸，放射法比酶法敏感。檢測(cè)核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 酶法探針可在酶法探針可在4保管一年，放射性標(biāo)志需每次制備。保管一年，放射性標(biāo)志需每次制備。 iii. 平安性平安性 非放射性標(biāo)志平安

22、。非放射性標(biāo)志平安。 iv. 效率效率 非放射性標(biāo)志所需時(shí)間短。非放射性標(biāo)志所需時(shí)間短。2. 標(biāo)志探針的制備方法標(biāo)志探針的制備方法 1鏈標(biāo)志法鏈標(biāo)志法 2) 末端標(biāo)志末端標(biāo)志 3) 標(biāo)志化合物的純化標(biāo)志化合物的純化 1鏈標(biāo)志法鏈標(biāo)志法 i. 切口移位法切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機(jī)隨機(jī)DNA引物延伸法引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段片段+dNTP(32P)* * * * * *變性5 33 5 iii. 反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA標(biāo)志標(biāo)志 iv. 轉(zhuǎn)錄法轉(zhuǎn)錄法

23、 含有待標(biāo)志含有待標(biāo)志DNA片段的重組質(zhì)粒片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)RNA標(biāo)志標(biāo)志 SP6聚合酶聚合酶 v. 引物延伸法引物延伸法 含待標(biāo)志含待標(biāo)志DNA的單鏈的單鏈DNA分子分子(M13mp系列系列)+引物引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待標(biāo)志待標(biāo)志DNA鏈鏈 vi. T4 DNA聚合酶法聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶聚合酶, 無無dNTP3-5外切酶活性外切酶活性參與參與dNTP和標(biāo)志和標(biāo)志核苷酸核苷酸新合成鏈新合成鏈32P2) 末端標(biāo)志末端標(biāo)志 i. 5-末端標(biāo)志末端標(biāo)志 ss-和和ds-DNA, RNA脫磷酸化反響脫磷酸化反響 (CIP) T4DNA銜接銜接

24、酶酶(-32P )ATP ii. 3-末端標(biāo)志末端標(biāo)志 i) TdT加尾反響，用于加尾反響，用于dsDNAii) 補(bǔ)齊反響補(bǔ)齊反響5 3 3 5 TdT-dCTP32P5 3CCCC * CCCC 3 5 * 5 3 3 5 Klenow片段-dNTP32P5 3 3 5 iii) T4 RNA銜接酶反響銜接酶反響 RNA-OH+*pNp3-5-二磷酸核苷二磷酸核苷+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 標(biāo)志化合物的純化標(biāo)志化合物的純化 i. 柱層析柱層析 利用利用Sephadex G-50，前峰，前峰-標(biāo)志物，后峰標(biāo)志物，后峰-核苷酸核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡(jiǎn)便快

25、速，簡(jiǎn)便, 可同時(shí)純化多個(gè)樣品?？赏瑫r(shí)純化多個(gè)樣品。下一節(jié)下一節(jié)雙鏈雙鏈DNADNA標(biāo)志法一標(biāo)志法一切口移位法切口移位法 Nick TranslationNick Translationo原理及過程：反響體系中原理及過程：反響體系中DNADNA酶酶I I隨機(jī)在探針隨機(jī)在探針DNADNA上翻開缺口，然后利用上翻開缺口，然后利用DNADNA聚合酶聚合酶I 5I 5 3 3外切酶活性，在缺口處按外切酶活性，在缺口處按5 5 3 3方向切除單核苷酸；方向切除單核苷酸；在切除的同時(shí)在切除的同時(shí)DNADNA聚合酶聚合酶I I有有5 5 3 3的聚合酶活性，在缺口處的聚合酶活性，在缺口處3 3端鏈接底端鏈接

26、底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反響的進(jìn)展，缺口平移，物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反響的進(jìn)展，缺口平移，并且底物中被標(biāo)志的單核苷酸被隨機(jī)摻入。并且底物中被標(biāo)志的單核苷酸被隨機(jī)摻入。DNADNA聚合酶聚合酶I I的兩種作用交替進(jìn)的兩種作用交替進(jìn)展，探針即被標(biāo)志。展，探針即被標(biāo)志。 Nick Translation前往前往雙鏈雙鏈DNADNA標(biāo)志法二標(biāo)志法二隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法6 6核苷酸引物標(biāo)志法核苷酸引物標(biāo)志法 o原理及過程：利用原理及過程：利用E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow亞單位，合成含有標(biāo)志亞單位，合成含有標(biāo)

27、志核苷酸的核苷酸的DNADNA鏈。鏈。KlenowKlenow具有具有5 5 3 3聚合酶活性。被標(biāo)志的聚合酶活性。被標(biāo)志的DNADNA探針探針變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物3 3端為起點(diǎn)，端為起點(diǎn)，沿模板沿模板3 3 5 5方向合成方向合成DNADNA新鏈。反響體系中含有標(biāo)志的新鏈。反響體系中含有標(biāo)志的dNTP,dNTP,隨機(jī)摻隨機(jī)摻入新合成的入新合成的DNADNA鏈中，探針即被標(biāo)志。鏈中，探針即被標(biāo)志。前往前往 1. 核酸雜交步驟與結(jié)果檢測(cè)核酸雜交步驟與結(jié)果檢測(cè) 1預(yù)雜交：預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常參與鮭魚精

28、預(yù)雜交液中常參與鮭魚精DNA，假設(shè)標(biāo)，假設(shè)標(biāo)志探針是志探針是cDNA或或RNA，預(yù)雜交液中還需參與多，預(yù)雜交液中還需參與多聚聚A以阻止特異性結(jié)合以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。或過夜。 2雜交：探針雜交：探針100變性，迅速冷卻，參與預(yù)雜交變性，迅速冷卻，參與預(yù)雜交液中，液中，42一天一天五五. . 分子雜交與結(jié)果檢測(cè)分子雜交與結(jié)果檢測(cè)3洗滌：洗滌：2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次洗滌兩次，每次15分鐘。假設(shè)運(yùn)用低聚分鐘。假設(shè)運(yùn)用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算：核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算： T=4GC+2AT *

29、 高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：假設(shè)具高度特異性同源序列，采用高強(qiáng)高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：假設(shè)具高度特異性同源序列，采用高強(qiáng)度雜交條件；假設(shè)使低同源性度雜交條件；假設(shè)使低同源性DNA之間雜交，那么采用低強(qiáng)度雜交條之間雜交，那么采用低強(qiáng)度雜交條件。這兩種條件之差別表如今雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和件。這兩種條件之差別表如今雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和洗滌時(shí)的溫度。洗滌時(shí)的溫度。4放射自顯影或顯色反響 運(yùn)用放射性同位素標(biāo)志物，采用放射自顯影。假設(shè)采用非放射性同位素標(biāo)志物，那么采用顯色反響。顯色反響將根據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?

30、-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。 ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反響中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑復(fù)原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是堆積在酶的作用位點(diǎn)。 iii. 兩種酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反響可繼續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其顯色結(jié)果可長(zhǎng)期保管，但辣根過氧化物酶的顯色反響僅能繼續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果2. 2. 蛋白質(zhì)的免疫分析蛋白質(zhì)的免疫分析 封鎖劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。封鎖劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。EtBr 雜交EtBr 雜交雜交結(jié)果表示

31、圖雜交結(jié)果表示圖六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化o 探針的選擇探針的選擇o 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNADNA或或cDNAcDNA雙鏈探針雙鏈探針o 在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNADNA單單鏈探針或鏈探針或RNARNA探針探針 o 長(zhǎng)的雙鏈長(zhǎng)的雙鏈DNADNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交雜交 o 探針的標(biāo)志方法探針的標(biāo)志方法o 選擇什么標(biāo)志方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利選擇什

32、么標(biāo)志方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定；用條件而定；o 但還應(yīng)思索實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方但還應(yīng)思索實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等法等o o 普通以為放射性探針比非放射性探針的靈敏普通以為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高度高o 在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保管時(shí)間長(zhǎng)的在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保管時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)統(tǒng) 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化o 探針的濃度探針的濃度o 總的來說，隨探針濃度添加，雜交率也添加總的來說，隨探針濃度添加，雜交率也添加o 在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度

33、添加，敏感性添加在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度添加，敏感性添加o 膜雜交中膜雜交中32P32P標(biāo)志探針與非放射性標(biāo)志探針的用量標(biāo)志探針與非放射性標(biāo)志探針的用量分別為分別為5 510ng/ml10ng/ml和和25251000ng/ml1000ng/ml，而原位雜交，而原位雜交中，無論運(yùn)用何種標(biāo)志探針，其用量均為中，無論運(yùn)用何種標(biāo)志探針，其用量均為0.50.55.0g/ml5.0g/mlo o 受不同類型標(biāo)志物的固相支持物的非特異結(jié)合特性受不同類型標(biāo)志物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響的影響 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化o 雜交率雜交率 o 現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜

34、交還是固相雜交均現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進(jìn)展在探針過剩的條件下進(jìn)展 o 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度復(fù)雜度和探針濃度。下面列出的公式長(zhǎng)度復(fù)雜度和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形適用于過剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形 o t1/2=ln2/kc t1/2=ln2/kco t1/2t1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間s so k =k =構(gòu)成雜交體的速率常數(shù)構(gòu)成雜交體的速率常數(shù)mol/(Lxntxs)mol/(Lxntxs)決議決議于探針長(zhǎng)度于

35、探針長(zhǎng)度L L、探針復(fù)雜度、探針復(fù)雜度N N、溫度、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和離子強(qiáng)度、粘度和pHpHo c =c =溶液中的探針濃度溶液中的探針濃度mol/Lmol/L六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)要素的優(yōu)化o 雜交最適溫度雜交最適溫度 雜交技術(shù)最重要的要素之一雜交技術(shù)最重要的要素之一o 反響溫度低于反響溫度低于Tm 10Tm 101515，堿基順序高，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減度同源的互補(bǔ)鏈可構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。假設(shè)反響溫度再低少。假設(shè)反響溫度再低Tm-30Tm-30，雖然互補(bǔ)，雖然互補(bǔ)鏈之間也可構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)鏈之間也可構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱 o 最適復(fù)性溫度最適復(fù)性溫度Optimunm renaturation Optimunm renaturation temperature, TORtemperature, TOR：Tor =Tm 25Tor =Tm 25o 苛刻復(fù)性溫度：苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm (10Ts = Tm (10或或15)15)o 非苛刻復(fù)性溫度：非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm (30Tns =Tm (30或或35)35)o 可以經(jīng)過運(yùn)用高濃度鹽溶液如可以經(jīng)過運(yùn)用高濃度鹽溶液如6.2m