歐洲藥典EP50

1、2.6.14 細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)是使用來(lái)自鱟（美洲鱟或東方鱟）的阿米巴細(xì)胞溶解物用于檢測(cè)或定量革蘭氏陰性細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)有三種檢測(cè)技術(shù)：基于凝膠形成的凝膠法技術(shù)；基于內(nèi)源性基質(zhì)斷裂后濁度的變化的濁度法技術(shù)；基于帶有生色團(tuán)的合成肽斷裂后的顏色的變化的顯色法技術(shù)。本章介紹了下列6種方法：方法A凝膠法：限量實(shí)驗(yàn)方法B凝膠法：半定量實(shí)驗(yàn)方法C動(dòng)態(tài)濁度法方法D動(dòng)態(tài)顯色法方法E終點(diǎn)顯色法方法F終點(diǎn)濁度法可使用6種方法中的任何一種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果出現(xiàn)懷疑或爭(zhēng)議，除非文中另有規(guī)定，否則以方法A的結(jié)果為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在可避免污染的方式下進(jìn)行。器 具將所有的玻璃器皿和其它遇熱穩(wěn)定的器具置于熱空氣烘箱中用經(jīng)驗(yàn)證的

2、的方法除熱原，常用的最少時(shí)間和溫度是250 30分鐘，如果使用塑料器具，如用于自動(dòng)移液器的微量滴定板和移液吸頭，應(yīng)使用經(jīng)證實(shí)無(wú)可測(cè)內(nèi)毒素及對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾的器具。注：在本章中，“試管”這個(gè)詞泛指所有容器，例如微量滴定板孔內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品原液的制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶原液是用經(jīng)過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品制備的，例如內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品BRP。內(nèi)毒素以國(guó)際單位（IU）表示，世界衛(wèi)生組織規(guī)定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品等于1 IU。注：1 IU=1 EU按照產(chǎn)品說(shuō)明書和標(biāo)簽上的說(shuō)明制備和儲(chǔ)存內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品原液強(qiáng)力混合后，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（檢查用水）稀釋本復(fù)溶液制備合適的內(nèi)毒素稀釋液系

3、列。稀釋液應(yīng)盡快使用以避免因吸附導(dǎo)致的活性損失。供試品溶液的制備用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解或稀釋活性物質(zhì)或藥品制備供試品溶液，某些物質(zhì)或產(chǎn)品可能更適合用其它水性溶液進(jìn)行溶解或稀釋。如果有必要，調(diào)整供試品溶液的PH值以使試劑和供試品溶液的混合物的PH在試劑生產(chǎn)商所指定的范圍內(nèi)。這通常適用于PH值范圍在6.0-8.0之間的產(chǎn)品，PH值可按試劑生產(chǎn)商的推薦用酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)。酸堿可用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在無(wú)熱原的容器中用原液或固體制備。緩沖液必須經(jīng)驗(yàn)證無(wú)可測(cè)內(nèi)毒素和干擾因子。最大有效稀釋倍數(shù)的確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是允許的樣品的最大稀釋倍數(shù)，在此稀釋倍數(shù)下可確定內(nèi)毒素限值。內(nèi)毒素限值：非經(jīng)腸道

4、給藥的活性物質(zhì)的內(nèi)毒素限值，用劑量定義，等于：K/MK=每小時(shí)每公斤體重的內(nèi)毒素閾熱原劑量M=每小時(shí)每公斤體重產(chǎn)品的最大推薦劑量非經(jīng)腸道給藥的活性物質(zhì)的內(nèi)毒素限值用IU/ml、IU/Unit等生物活性單位表示。供試品溶液的濃度表示方法：如果內(nèi)毒素限值是以重量單位表示（IU/mg）則為mg/ml。如果內(nèi)毒素限值以生物活性單位表示（IU/Unit）則為Units/ml如果內(nèi)毒素限值以生物活性單位表示（IU/Unit）則為Units/ml=凝膠法技術(shù)中的標(biāo)示靈敏度或濁度法或顯色法技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)凝膠法技術(shù)（方法A和B）凝膠法技術(shù)可以檢測(cè)或定量?jī)?nèi)毒素，它是基于試劑在出現(xiàn)內(nèi)毒素時(shí)形成凝膠的原理。在

5、標(biāo)準(zhǔn)條件下導(dǎo)致試劑形成凝膠所需要的內(nèi)毒素濃度為試劑的標(biāo)示靈敏度，為確保實(shí)驗(yàn)的精確和有效性，應(yīng)按1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)。1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)(i) 標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)在使用鱟試劑做實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)復(fù)核其標(biāo)示靈敏度，以IU/ml表示，將試劑溶液重復(fù)4管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用新批號(hào)的試劑或任何可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)應(yīng)進(jìn)行試劑靈敏度復(fù)核。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品原液制備相當(dāng)于2、0.5、0.25的至少4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在一支試管中將等量的試劑溶液和其中一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（如0.1ml）混合，如果是使用裝有凍干試劑的單次實(shí)驗(yàn)小瓶或安瓿，可直接將溶液加入瓶中或安瓿

6、中。根據(jù)試劑生產(chǎn)商的建議將反應(yīng)混合物恒溫孵育一段時(shí)間（通常是37±1 60±2分鐘），避免震動(dòng)。檢驗(yàn)?zāi)z的完整性：如果是試管，從恒溫器中依次拿出每支試管，平穩(wěn)地倒轉(zhuǎn)大約180°一次，如果形成堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)時(shí)不滑脫，結(jié)果記為陽(yáng)性，如果未形成完整的凝膠，則結(jié)果記為陰性。如標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最低濃度的所有重復(fù)管的結(jié)果均為陰性，則實(shí)驗(yàn)有效。終點(diǎn)是內(nèi)毒素系列遞減濃度中最后一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，使用以下表達(dá)式計(jì)算終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)平均值，然后求平均值的反對(duì)數(shù)：åe = 所用的稀釋系列的終點(diǎn)濃度對(duì)數(shù)值的和f = 重復(fù)管數(shù)終點(diǎn)濃度幾何平均值是試劑溶液（IU/ml）的測(cè)定靈敏度，如果

7、0.5ll2l，則標(biāo)示靈敏度符合規(guī)定，用該批試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)使用該靈敏度。(ii) 干擾實(shí)驗(yàn)按表2.6.14-1制備溶液A、B、C和D，供試品溶液稀釋倍數(shù)不得大于MVD，不含有任何可測(cè)內(nèi)毒素，按1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表 2.6.14-1溶液內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)初始內(nèi)毒素濃度重復(fù)管A無(wú)/供試品溶液-4B2l/供試品溶液供試品溶液12482l1l0.5l0.25l4444C2l/檢查用水檢查用水12482l1l0.5l0.25l2222D無(wú)/檢查用水-2溶液A=無(wú)可測(cè)內(nèi)毒素的供試品溶液溶液B=干擾對(duì)照溶液C=標(biāo)示靈敏度對(duì)照溶液D=陰性對(duì)照（檢查用水）

8、使用1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)中給出的表達(dá)式確定溶液B和C的終點(diǎn)濃度的幾何平均值。當(dāng)有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)，重復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)。所有溶液A和D的重復(fù)管均為陰性，溶液C符合標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的規(guī)定，則實(shí)驗(yàn)有效。如果用溶液B確定的試劑靈敏度0.5ll2l，則供試品溶液在此實(shí)驗(yàn)條件下不含有干擾因素。否則溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾。如果稀釋倍數(shù)小于MVD的供試品溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，可使用更大的稀釋倍數(shù)重復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)，但不得大于MVD。使用高靈敏度的試劑允許用更大的稀釋倍數(shù)制備供試品溶液，這有助于消除干擾。干擾可通過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砜朔热邕^(guò)中和、透析或熱處理，為了確定所選擇的處理方法能有效消除干擾而

9、又不會(huì)損失內(nèi)毒素，可使用已加入內(nèi)毒素并用所選擇的處理方法處理過(guò)的供試品溶液重復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)。2. 限量實(shí)驗(yàn)方法（方法A）（i） 實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照表2.6.14-2制備溶液A、B、C和D，并按照1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)敘述的過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表2.6.14-2溶液內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液重復(fù)管數(shù)ABCD無(wú)/稀釋的供試品溶液2l/稀釋的供試品溶液2l/檢查用水無(wú)/檢查用水2222用不大于MVD的稀釋倍數(shù)制備溶液A和B（陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照），并用1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（ii）干擾實(shí)驗(yàn)中所述的處理方法處理。溶液B和C含有2l濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，溶液D（陰性對(duì)照）為檢查用水。（ii） 結(jié)果判斷陽(yáng)性對(duì)照溶液B

10、和C的兩支重復(fù)管結(jié)果均為陽(yáng)性，陰性對(duì)照溶液D所有重復(fù)管均為陰性，則實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)溶液A的兩支重復(fù)管結(jié)果均為陰性時(shí)，供試品檢測(cè)合格。當(dāng)溶液A的兩支重復(fù)管中有一支為陽(yáng)性時(shí)：如果供試品已稀釋到MVD，產(chǎn)品不合格；如果供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD，用更大的稀釋倍數(shù)稀釋供試品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但不得大于MVD。3. 半定量實(shí)驗(yàn)（方法B）（i） 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)確定終點(diǎn)濃度來(lái)定量供試品溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素。按照表2.6.14-3制備溶液A、B、C和D，根據(jù)1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些溶液。（ii） 計(jì)算和結(jié)果判斷除非符合以下三個(gè)條件，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效：（a） 溶液D（陰性對(duì)照）的兩支重復(fù)管結(jié)果均為陰性

11、；（b） 溶液B（陽(yáng)性對(duì)照）的兩支重復(fù)管的結(jié)果均為陽(yáng)性；（c） 溶液C的終點(diǎn)濃度幾何平均值在0.5和2范圍之間要確定溶液A的內(nèi)毒素濃度，可將每一終點(diǎn)對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)乘以l計(jì)算出每個(gè)稀釋系列的每支重復(fù)管的終點(diǎn)濃度。供試品溶液的內(nèi)毒素濃度是重復(fù)管的終點(diǎn)濃度的幾何平均值（見(jiàn)1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)示靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)中給出的表達(dá)式）。如果是用稀釋的供試品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用測(cè)得的濃度乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算原始溶液的內(nèi)毒素濃度。在一個(gè)有效實(shí)驗(yàn)中，如果供試品溶液的稀釋液的檢測(cè)結(jié)果都不是陽(yáng)性，內(nèi)毒素濃度記為小于（或如果是檢測(cè)稀釋的樣品，記為小于´樣品的最小稀釋倍數(shù)）。如果所有的稀釋液結(jié)果均為陽(yáng)性，內(nèi)毒素濃度記為

12、大于等于最大稀釋倍數(shù)乘以（例如表2.6.14-3中，初始稀釋倍數(shù)´8´）。如果內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的值，則供試品符合實(shí)驗(yàn)要求。光度法技術(shù)（方法C、D、E和F）1. 濁度法技術(shù)（方法C和F）該技術(shù)是測(cè)定濁度變化的一種光度法實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所使用實(shí)驗(yàn)原理，該技術(shù)分為終點(diǎn)濁度法實(shí)驗(yàn)或動(dòng)態(tài)濁度法實(shí)驗(yàn)。終點(diǎn)濁度法實(shí)驗(yàn)是基于內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)混合物的濁度（吸光度或透光度）之間的定量關(guān)系。動(dòng)態(tài)濁度法實(shí)驗(yàn)（方法C）是一種測(cè)定反應(yīng)混合物達(dá)到預(yù)定吸光度所需的時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間）或濁度變化率的方法。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)在試劑生產(chǎn)商推薦的恒溫溫度下進(jìn)行（通常是37±1）。2. 顯色法技術(shù)（方法D和E）該

13、技術(shù)是用來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)中的顯色肽釋放出來(lái)的顯色團(tuán)。依據(jù)所使用的實(shí)原理驗(yàn)，本技術(shù)分為終點(diǎn)顯色法實(shí)驗(yàn)或動(dòng)態(tài)顯色法實(shí)驗(yàn)。終點(diǎn)顯色法（方法E）是基于反應(yīng)結(jié)束時(shí)內(nèi)毒素濃度與釋放出來(lái)的顯色團(tuán)數(shù)量之間的定量關(guān)系。動(dòng)態(tài)顯色法（方法D）測(cè)定反應(yīng)混合物達(dá)到預(yù)定吸光度所需的時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間）或顏色變化率。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)在試劑生產(chǎn)商推薦的恒溫溫度下進(jìn)行（通常是37±1）。3. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)為了確保濁度法和顯色法實(shí)驗(yàn)的精確性或有效性，需進(jìn)行預(yù)備性實(shí)驗(yàn)以確保標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定以及供試品溶液不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的任何實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生改變，要求對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。（i） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品

14、溶液制備至少3個(gè)內(nèi)毒素濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液至少重復(fù)3管并按照試劑生產(chǎn)商的建議（容液比例，恒溫時(shí)間、溫度、pH等等）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用動(dòng)態(tài)方法時(shí)，如果要求的范圍大于兩個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)，則應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)添加額外標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)支持每個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)的遞增。在試劑生產(chǎn)商指定的內(nèi)毒素濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值|必須大于等于0.980。（ii） 干擾實(shí)驗(yàn)選擇一個(gè)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按照表2.6.14-4制備溶液A、B、C和D，按照試劑生產(chǎn)商的建議（供試品溶液和試劑溶液的量，供試品溶液和試劑溶液的量的比例、恒溫時(shí)間等等）至少重復(fù)2管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表2.6.14-3溶液內(nèi)毒素濃

15、度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)初始內(nèi)毒素濃度重復(fù)管A無(wú)/供試品溶液-1248-2222B2l/供試品溶液供試品溶液12l2C2l/檢查用水檢查用水12482l1l0.5l0.25l2222D無(wú)/檢查用水-2溶液A=稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD的供試品溶液，已做過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)，供試品溶液的進(jìn)一步的稀釋亦不能超過(guò)MVD，根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用檢查用水制備兩個(gè)稀釋系列1，1/2，1/4和1/8，也可使用其它合適的稀釋系列。溶液B=含有2l內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液A（陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照）溶液C=含有2l、l、0.5l、0.25l濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的兩個(gè)檢查用水系列。溶液D=檢查用水（陰性對(duì)照）表2.6.14-4溶液內(nèi)毒素

16、濃度加入內(nèi)毒素的溶液重復(fù)管數(shù)A無(wú)供試品溶液不少于2管B標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)濃度供試品溶液不少于2管C至少3個(gè)濃度（l為最低濃度）檢查用水每個(gè)濃度不少于2管D無(wú)檢查用水不少于2管溶液A=供試品溶液，可用不大于MVD的稀釋倍數(shù)稀釋。溶液B=含中點(diǎn)濃度的供試品溶液，與溶液A稀釋倍數(shù)相同溶液C=內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度同3. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn)（陽(yáng)性對(duì)照）的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的濃度。溶液D=檢查用水（陰性對(duì)照）用含有添加內(nèi)毒素的供試品溶液的平均濃度減去未添加內(nèi)毒素的供試品溶液的平均濃度來(lái)計(jì)算添加的內(nèi)毒素的平均回收率。如果在實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)得加入供試品溶液中的內(nèi)毒素的濃度在已知添加的內(nèi)毒素濃度的50%-20

17、0%范圍內(nèi)，則供試品溶液無(wú)干擾。當(dāng)內(nèi)毒素回收率超過(guò)指定范圍，應(yīng)按照凝膠法技術(shù)中1. 預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（ii）干擾實(shí)驗(yàn)所述的方法去除干擾因子。4. 實(shí)驗(yàn)(i) 過(guò)程按3. 預(yù)備性（ii）干擾實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。(ii) 計(jì)算使用陽(yáng)性對(duì)照系列溶液C創(chuàng)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液A的每支重復(fù)管的內(nèi)毒素濃度。實(shí)驗(yàn)只有符合以下三個(gè)要求才有效：（a）溶液D（陰性對(duì)照）的結(jié)果不超過(guò)所使用的試劑要求的空白值的限值；（b）陽(yáng)性對(duì)照系列溶液C的結(jié)果符合3.預(yù)備性實(shí)驗(yàn)（i）標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn)中所定義的驗(yàn)證的要求（c）用溶液B的內(nèi)毒素濃度減去溶液A的內(nèi)毒素濃度計(jì)算出來(lái)的內(nèi)毒素回收率在50%-200%范圍內(nèi)。(iii) 判斷如果溶液A的重復(fù)管的內(nèi)毒素濃度平均值小于產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值，則所檢產(chǎn)品合格。5. 試劑（i）