氮雜胞苷對小麥生長發(fā)育及DNA甲基化的影響

1、5-azaC處理水稻幼苗對基因組DNA 甲基化及水稻生長發(fā)育的影響表觀遺傳學(xué)：不需要基因序列改變而產(chǎn)生的可遺傳的基因表達(dá)改變；主要包括DNA的甲基化修飾和組蛋白氨基酸的末端修飾。表觀遺傳變異包括: X染色體失活、轉(zhuǎn)基因沉默、核仁顯性和基因組印記等方面。表觀遺傳變異的原因：是由于表觀遺傳密碼的改變，如DNA 甲基化、組蛋白的公家修飾改變等。DNA 甲基化：在DNA 復(fù)制后，經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）催化，將S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM) 上的甲基基團(tuán)連接到DNA 分子腺嘌呤堿基或胞嘧啶堿基上，進(jìn)行DNA修飾的過程。DNA 甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM (DNA 腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移

2、酶)識(shí)別回文序列GATC, 在此位置兩條鏈的腺嘌呤N-6位置上同時(shí)甲基化，同時(shí)SAM 轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位點(diǎn)胞嘧啶C5被甲基化DNA 甲基化作用DNA甲基化的生物學(xué)意義影響基因表達(dá)狀態(tài) ： 通過該表基因調(diào)控區(qū)DNA 甲基化程度調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄參與基因組防御 ：通過高度甲基化而使外源DNA（如轉(zhuǎn)座子）處于沉默狀態(tài)提高環(huán)境適應(yīng)能力 ：在不改變基因型的情況下產(chǎn)生可遺傳的新表型DNA 胞嘧啶甲基化的種類和形成從化頭甲基化 (de novo methylation)DNMT3a ，DNMT3b在 完全沒有 甲基化的DNA 上 加

3、 上 甲基 。維持化 甲基化 (maintenance methylation)Met1 ，DNMT1較特異地識(shí)別半甲基化狀態(tài)的DNA ，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分裂過程中依據(jù)DNA 母鏈的甲基化狀態(tài)給新合成的DNA 鏈上加上甲基。DNA 胞嘧啶甲基化檢測方法使用對胞嘧啶5- 甲基化 狀態(tài) 敏感 的 限 制 性 內(nèi) 切酶 進(jìn)行酶切處理， 然后檢測多態(tài)性：甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性 (MSAP, Methylation SensitiveAmplification Polymorphism)胞嘧啶轉(zhuǎn)化為其它堿基，然后對比測序 ：重亞硫酸鹽測序 (Bisulfite sequencing)GCmTACT重亞硫酸鈉GC

4、mTATT測序此外，還有單核苷酸法，甲基化接受力的檢測法，CpG 島分離法和基因活性測量法，基因芯片法等表1 甲基化 敏感 酶對不 同 甲基化 狀態(tài)DNA 的切 割 結(jié)果CCm GG不切 割CCmGG不切 割 CC GG Msp I不切 割 CC GG Hpa IICmCGG CCGG 原 始 序列內(nèi) 切酶? MSAP 流 程 ：提取基因組DNA（ 注意 發(fā)育 時(shí) 期和成 長 狀態(tài) 相 同 ）ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGG CCTGMsp I 酶切+ 接頭 Hap II 酶切+ 接頭ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTT

5、GCCmGGACTAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTGPCR PCRPAGE 電泳 PAGE 電泳Msp I5 CC(m)G G 33 GG C(m)C 5Hpa II5 CCGG 33 GGCC 3? 重亞 硫酸 鹽 測 序?qū)嶒?yàn)?zāi)康氖褂貌煌瑵舛鹊?-azaC 溶液，處理生長早期的水稻幼苗，使其基因組DNA 胞嘧啶甲基化水平發(fā)生顯著的可遺傳改變，使用MSAP 方法檢測DNA 胞嘧啶甲基化水平的改變；水稻幼苗因DNA 甲基化水平改變而影響基因表達(dá)水平，產(chǎn)生明顯的表觀遺傳表型 。實(shí)驗(yàn)材料1、水稻：日本晴 (Oryza sativa var japon

6、ica, nipponbare)2、所需儀器離心機(jī)、PCR儀、氣浴搖床、水浴搖床、植物生長箱電泳儀 、電泳槽、微量移液器 、紫外分析儀、分析天平3、試劑（1）植物基因組DNA 改良CTAB 提取液：buffer A: 0.35mol/L Sorbitol ，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.5mmol/L EDTA;buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.05mol/L EDTA ，2mol/L NaCl ，2%CTAB;buffer C: 5%N-lauroylsarcosine（2）PCR試劑：Takara rTaq ，10X PCR

7、buffer ，ddH2O ，預(yù)擴(kuò)增引物：H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)PCR 引物 EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)選擇性擴(kuò)增引物：H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。（3）酶切-連接試劑：EcoRI (NEB) ，Hap II (NEB) ，Msp I (NEB) ，T4 DNA ligase ，T4 10

8、 xreaction buffer（4） 接頭：EcoRI adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspI adapter: 5-GATCATGAGTCCTGCT-3 AGTACTCAGGACGAGC（5）PAGE 試劑： 聚丙烯酰胺，尿素 ，AgNO 3 ，Na 2 CO 3 ，溴酚藍(lán) （6）銀染固定/終止液 (10% 冰乙酸) ， 染色液 (2升雙蒸水預(yù)冷，用時(shí)加2克硝酸銀 ，3ml 37% 甲醛) ，顯影液 (2升雙蒸水中溶解60克碳酸鈉 ，冷卻至10-12ºC，用時(shí) ， 加入3ml 37% 甲醛 ，400

9、ul 硫代硫酸鈉（10mg/ml）) 。（7）其它試劑：5-azaC(100mg/mL) ，蒸餾水，PVP (20%) ， 氯仿: 異戊醇(24:1)，異丙醇 ，70% 乙醇 ，RNA 酶A (DNase-free) ，TE ，TAE ，瓊脂糖 ，EB ， 未酶切的 DNA ，1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ，3x loading buffer(300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。實(shí)驗(yàn)方法1、水稻的培養(yǎng)（26 ， 暗培養(yǎng)）取水稻水稻種子20

10、粒X 7組，將水稻種子用 75% 的酒精消毒后用無菌水浸泡數(shù)小時(shí)，當(dāng)水稻種子露嘴時(shí)，分別置于90mm 培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙上，加15mL蒸餾水浸種24h（第一天）。2、5-azaC處理水稻幼苗：（1）6組種子分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，實(shí)驗(yàn)組分別用20mg/mL，40mg/mL, 60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL5-azaC溶液處理，對照組用蒸餾水培養(yǎng)，共處理10天，每2天換處理液1次（第二 十一天）。（2）10 天后每個(gè)處理隨機(jī)取10 株幼苗嫩葉混合提取DNA，其余麥苗移載大田并觀察田間生長情況。2、植物基因組DNA 的提取與純化改良CTAB法(Kidwell

11、 and Osborn, 1992)8（1）取不同處理的葉1g，將其在液氮中研磨成粉后轉(zhuǎn)入50ml離心管。（2）向離心管中加入等體積DNA 提取緩沖液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)。（3）置于65恒溫水浴下?lián)u床，40-50rpm振搖90分鐘。（4）加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1) ，輕輕上下顛倒10-15分鐘后，4 3000rpm離心10-15分鐘。（5）取上層水相加入2/3 體積的預(yù)冷異丙醇，上下顛倒5分鐘并置4冰箱內(nèi)10min。（6）待DNA 沉淀后于4 3000rpm離心收集DNA于管底。（7）DNA于70%乙醇中過夜。（8）取DNA沉淀并風(fēng)干（第十二天）。（

12、9）在2ml離心管中加1ml TE溶解沉淀。（10）待DNA 完全溶解后，加入5ul不含DNA酶的RNA酶，37保溫30分鐘以除去DNA中的RNA。（11）加入等量氯仿: 異戊醇(24:1) 純化DNA ，輕輕上下顛倒10-15分鐘后，43000rpm離心10-15分鐘。（12）取DNA沉淀，用70%乙醇過夜洗滌DNA，并將其溶于DNA 于200-500ul TE中。（13）取基因組DNA溶液，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA的質(zhì)量并據(jù)已知的DNA Marker（未酶切的DNA）估計(jì)其濃度；調(diào)整DNA 濃度，置于-20備用。3、水稻基因組DNA 酶切（1）甲基化分析采用兩種甲基化敏感酶Ha

13、p和Msp（NEB）。在限制性酶切和連接前，先把兩個(gè)單鏈的接頭復(fù)性為雙鏈結(jié)構(gòu)( 序列見試劑部分) ，即100 變性5分鐘，緩慢冷卻至 室溫，-20冷凍保存?zhèn)溆?。?）水稻MSAP限制性酶切和連接體系如下 ：表2 水稻MSAP限制性酶切、連接體系T4 10 x buffer2.5ulBSA (10mg/L)0.1ulEcoR I adaptor (5pM)0.5ulH/M adaptor (50pM)0.5ulEcoR I (20U/ul)0.5ulH/MMspI (10U/ul) 0.5ulHpaII (20U/ul) 0.25ulT4 ligase0.1ulGenomic DNA300ng2

14、0ul AFLP-Water補(bǔ)足總反應(yīng)體積（3）混勻體系，37，6小時(shí)，8，4小時(shí)，4保存。（4）共四個(gè)處理組，即水稻25mg/mL 處理組，水稻50mg/mL處理組，水稻100mg/mL 處理組，水稻對照組；每組分別用HapII/MspI雙酶切，共需切8管（第十五天）。4、預(yù)擴(kuò)增（1）預(yù)擴(kuò)增：水稻AFLP 預(yù)擴(kuò)增體系如右表(預(yù)擴(kuò)增引物PCR引物部分)：混勻體系，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng) ：表3 AFLP 預(yù)擴(kuò)PCR體系10 x PCR reaction buffer2.5uldNTPs (2.5mM)2ulEcoR I primer (5 uM)1ulH/M primer (5 uM)

15、1ulTaq DNA polymerase (5U/ uL)0.2ulPCR water16.3ulDNA 模 板 （ 預(yù)擴(kuò)增 稀釋 產(chǎn) 物 ）2ulTotal volume25ul（2）PCR 程序 ：94預(yù)變性2min, 94變性30秒，56復(fù)性30秒，72延伸60 秒, 共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72延伸10分鐘（第十七天）。（3）根據(jù)檢測結(jié)果，用0.1x TE buffer稀釋預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1/101/40，作為PCR 選擇性擴(kuò)增的DNA模板。按以下參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng) ：表4水稻AFLP 選擇性擴(kuò)增體系10 x PCR reaction buffer1.5uldNTPs (2.5mM)

16、0.6ulEcoR I primer (5 uM)0.6ulH/M primer (5 uM)0.6ulTaq DNA polymerase (5U/ uL)0.12ulPCR water9.58ulDNA 模 板 （ 預(yù)擴(kuò)增 稀釋 產(chǎn) 物 ）2 2ulTotal volume15ul94 預(yù)變性2 分鐘, 94 變性30 秒，65復(fù)性30 秒，72延伸80 秒，以后每輪循環(huán)溫度遞減1，擴(kuò)增10 輪。接著94 變性30 秒，55復(fù)性30 秒，72 延伸80 秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72延伸10分鐘（第十七天）。5、PAGE 電泳（1） 自來水清洗電泳槽，95 酒精擦兩遍。（2）硅化：均勻擦涂

17、親和硅化試劑于大板的一 面，剝離硅化試劑于小板的一面5 分鐘后，95 酒精再擦兩遍。（3）裝板（4）灌膠【尿素-PAGE 膠配制】灌膠前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30ul ，10% 過硫酸銨（APS ）160ul，混勻，立即灌膠。灌膠時(shí)玻璃板傾斜15度。膠聚合1小時(shí)以上才可以電泳。表5 PAGE膠配方尿素(分析純）16.8g10xTBE4ml40% 丙烯酰胺膠貯液(Acrylamide/Bis 19: 1)16ml超純水加到總體積40ml（5）電泳：電泳裝置電泳緩沖液為1xTBE，85W 預(yù)電泳1小時(shí)，膠板的溫度達(dá)到55C。點(diǎn)樣前，DNA樣品95C變性5分鐘，立即冰浴，加3xloadin

18、g buffer, 混勻，瞬時(shí)離心，點(diǎn)樣量16ul，恒功率55W電泳到指定位置，即可卸板染色。6、銀染操作（1）電泳結(jié)束后，輕輕分離兩塊玻璃板，將附著膠的大板置于固定/ 終止液中，輕搖20分鐘，直至指示染料消失。（2）凝膠洗滌，回收固定/ 終止液，用雙蒸水洗滌凝膠3次，每次至少2分鐘，凝膠板從水中取出后，豎起空水15 秒。（3）染色，將膠板移至染色液中，輕搖30分鐘 。（4）凝膠顯影，將染色后的膠板放入雙蒸水中5-10 秒，迅速取出并豎起控水，隨后把膠板放入預(yù)冷的一半顯影液中，充分搖動(dòng)，當(dāng)出現(xiàn)第一批條帶后，倒入另一半顯影液，輕搖至條帶全部出現(xiàn)。（注意：從放入水中到放 入顯影液中，時(shí)間不應(yīng)超過1

19、0秒。）（5）終止顯影，在顯影液中直接添加等體積的固定/ 終止液 （第一步中用過的），停止顯影并固定影像。（6）固定完全后，即醋酸和碳酸鈉反應(yīng)完全( 溶液不再有二氧化碳產(chǎn)生) ，用雙蒸水洗滌凝膠2 次，每次至少2分鐘，凝膠板從水中取出后，豎起控水晾干備用（第十九天）。7、數(shù)據(jù)分析【注意事項(xiàng)】（1）五氮胞苷（5-azacytidine ；MW:244.21）：粉末于-20保存 ，見光或遇熱分解，使用時(shí)配母液于4保存，保存時(shí)間不宜超過半個(gè)月；（2）丙烯酰胺為劇毒試，配制、使用時(shí)必須按有關(guān)規(guī)程做好個(gè)人防護(hù)。結(jié)果與分析（一）結(jié)果1、5-azaC 對水稻幼苗生長的影響（1）5-azaC 對水稻種子發(fā)育勢

20、和發(fā)芽率的影響發(fā)芽勢和發(fā)芽率是檢測水稻種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，發(fā)芽勢是指種子發(fā)芽初期它在規(guī)定時(shí)間內(nèi)能正常發(fā)芽的種子粒數(shù)占供檢種子粒數(shù)的百分率，發(fā)芽勢主要說明測試種子的發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度。發(fā)芽率指測試種子的發(fā)芽數(shù)占測試種子總數(shù)的百分比，發(fā)芽率主要是測試種子發(fā)芽能力。預(yù)期結(jié)果：不同濃度 5-aza C 處理的種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率與對照相比，可能表現(xiàn)為低濃度時(shí)處理組高于對照組，而高濃度時(shí)處理組低于對照組。（2）5-azaC 對水稻根發(fā)育的影響不同濃度的5 -azaC 對萌發(fā)的水稻幼苗處理10天后觀察。預(yù)期結(jié)果：小濃度處理時(shí)可能對水稻幼苗的根系生長沒有特別大的區(qū)別，即小濃度 5-aza C 處理的根的生

21、長情況比對照短，表現(xiàn)出根系不發(fā)達(dá)，但是沒有達(dá)到顯著水平。而高濃度處理的幼苗的根系隨著濃度的增大根長變短并且不發(fā)達(dá)，即高濃度的 5-aza C 對水稻根系生長有一定的抑制作用。（3）5-azaC 對水稻葉長度發(fā)育的影響在水稻生長周期中定期對葉長進(jìn)行測量，我們選取 30d、70d 和 110d 的葉長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并進(jìn)比較分析。預(yù)期結(jié)果：沒有進(jìn)行去甲基化的對照株在各個(gè)時(shí)期的葉長平均值會(huì)比處理后的水稻高，且濃度越高對葉長生長的抑制作用越明顯。（4）5-azaC 對水稻株高發(fā)育的影響我們定期對株高進(jìn)行測量，我們選取 10d、30d 、70d和 110d 進(jìn)行比較分析。預(yù)期結(jié)果：沒有進(jìn)行去甲基化的對照株比處理后的水稻高，幼時(shí)變化可能不大，隨著時(shí)間的增加，水稻成熟時(shí)株高變化較幼時(shí)會(huì)更明顯。2、5-azaC 對水稻主要生長和產(chǎn)量性狀的影響（1）5-azaC 對水稻抽穗和花期的影響預(yù)期結(jié)果：經(jīng)過 5-aza C 處理的水稻在光照下比對照早開花，而且對照中在一定時(shí)期沒有開花的植株相對較多，且開花時(shí)間的早晚與 5-aza C 的濃度密切相關(guān)，隨著濃度的提高植株提早開花。 即5-aza C