菌株的應(yīng)用課件

1、Company LOGO標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用及保藏技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用及保藏技術(shù)上海漢尼生物技術(shù)有限公司上海漢尼生物技術(shù)有限公司繆文俊繆文俊 市場(chǎng)部市場(chǎng)部Company Logo內(nèi)容提要內(nèi)容提要v前言前言v菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種保藏機(jī)構(gòu)v標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用v實(shí)驗(yàn)室適用菌種保藏技術(shù)實(shí)驗(yàn)室適用菌種保藏技術(shù)v其它保藏技術(shù)其它保藏技術(shù)Company Logo前言前言v藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。v菌種保藏是微生物學(xué)檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，菌種的科學(xué)保藏和管理直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的正確性。v藥品微生物檢驗(yàn)主要考慮其標(biāo)準(zhǔn)

2、性。Company Logo各國(guó)菌種保藏機(jī)構(gòu)各國(guó)菌種保藏機(jī)構(gòu)v中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（CMCC）v美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）v美國(guó)北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室（NRRL）v荷蘭霉菌中心保藏所（CBS）v英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC）v日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）v法國(guó)里昂巴斯德研究所（IPL）v國(guó)際微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（IAMS）v世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFGC）Company Logo標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用v培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查v方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證v陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)v抑菌效力檢查抑菌效力檢查v能力驗(yàn)證能力驗(yàn)證促生長(zhǎng)能力檢查促生長(zhǎng)能力檢查抑制能力檢查抑制能力檢查指示特性檢

3、查指示特性檢查Company Logo培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 意義意義：證實(shí)在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基能支持微生物的生長(zhǎng)，那么檢品中可能存在的微生物就能在該培養(yǎng)基內(nèi)或者培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，或出現(xiàn)混濁或形成菌落，從而防止出現(xiàn)假陰性保證檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。 菌種：不得超過(guò)5代Company Logo1 .促生長(zhǎng)能力檢查 加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株菌懸液（菌的數(shù)量要求在50-100cfu）至被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，按規(guī)定溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征一致。2 .抑制能力檢查 接種不少于100cfu的菌懸液于被檢培養(yǎng)基，按規(guī)定溫度及不短于規(guī)定的

4、最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。Company Logo3 .培養(yǎng)基指示特性檢查 加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株菌懸液（含菌數(shù)不大于100cfu）至被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，按規(guī)定溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。Company Logo微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證v 包括計(jì)數(shù)方法與控制菌檢查法驗(yàn)證v 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：有平板法和薄膜過(guò)濾法兩種方法，驗(yàn)證要求對(duì)照菌回收率不得低于70%。v 控制菌檢查法驗(yàn)證：要求陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)檢出控制菌，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。v 試驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株有：大腸埃希菌，金黃色葡萄球

5、菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉。v 菌種傳代不得超過(guò)5代,菌液濃度為不大于100cfu/mlCompany Logo陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)v 為便于研究觀察成藥制劑中，某些含有防腐劑和抑制菌成分的干擾作用，以及測(cè)試常規(guī)檢驗(yàn)方法和培養(yǎng)基、試劑等的靈敏度時(shí)，可將定量的已知陽(yáng)性對(duì)照菌加在供試品稀釋液中，按檢驗(yàn)供試品的操作方法進(jìn)行陽(yáng)性菌的對(duì)照試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照菌應(yīng)生長(zhǎng)。 Company Logo抑菌效力檢查抑菌效力檢查定義：在化妝品和藥品中為了增加產(chǎn)品的保質(zhì)期一般都會(huì)加入防腐劑，因此需要進(jìn)行一定的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證防腐劑的防腐效力，通常采用挑戰(zhàn)性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。 調(diào)制一定濃度的陽(yáng)性菌株加入待測(cè)產(chǎn)品中，在一段時(shí)

6、間內(nèi)間隔性的取樣（第7、14、28天），檢測(cè)在產(chǎn)品中的殘余的菌落數(shù)，據(jù)此可以判斷防腐劑的效力。Company Logo能力驗(yàn)證能力驗(yàn)證 能力驗(yàn)證是為確保實(shí)驗(yàn)室維持較高的核準(zhǔn)和檢測(cè)水平而對(duì)其能力進(jìn)行的考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗(yàn)證活動(dòng)。 個(gè)人操作技能及某些操作流程的正確性驗(yàn)證。 盲樣：按規(guī)定操作程序進(jìn)行檢測(cè)，但是并不在樣品上標(biāo)明菌的名字而是以代號(hào)來(lái)代替。Company Logo菌種保藏的原則： 降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本上處于休眠 態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但不至于死亡，以減低菌種的變異率。 菌種保藏的原理： 菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異。 首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的

7、休眠體（如分生孢子、芽孢等）； 其次，還要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)適合其長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。 菌種保藏菌種保藏Company Logov 美國(guó)藥典（USP）中規(guī)定：“將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至一培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，即認(rèn)為已傳代一次，”并規(guī)定“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代”。v 我國(guó)的GMP認(rèn)證中也如此要求，并且中國(guó)藥典2010年版藥典也已做出“菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代” 這個(gè)明確的規(guī)定。 Company Logo實(shí)驗(yàn)室適用的微生物保藏技術(shù)實(shí)驗(yàn)室適用的微生物保藏技術(shù)v瓊脂斜面

8、低溫保藏法v液體石蠟覆蓋保存法v低溫冷凍保藏法v甘油冷凍保藏法v磁珠保存法v凍干保藏法Company Logo1.1.瓊脂斜面低溫保藏法瓊脂斜面低溫保藏法v 適用細(xì)菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏v 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、大多數(shù)微生物適用v 缺點(diǎn)：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)生菌體自溶及基因突變。v 生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基Company Logov 細(xì)菌置46保藏，芽孢桿菌每36個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。 v 放線菌于46保藏，每3個(gè)月移植一次。 v 酵母菌于46保藏，每46個(gè)月移植一次。 v 絲狀真菌于46保藏，每4個(gè)月移植一次。 v 擔(dān)子菌

9、于46保藏，每3個(gè)月移植一次。v 保藏的濕度通常在5070為宜。Company Logo2.2.液體石蠟覆蓋保存法液體石蠟覆蓋保存法v 在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，主要適用于霉菌,酵母菌,放線菌,需氧性細(xì)菌等的保存 。v 優(yōu)點(diǎn)：防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡， 阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。v 其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。Company Logo3.3.低溫冷凍保藏法低溫冷凍保藏法

10、v 可分低溫冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70）和液氮（-196）等保藏法。v (1)低溫冰箱保存法:多數(shù)微生物在-20度保存效果良好v (2)干冰保存法:-70度保存v (3)液氮保存法:保存溫度克達(dá)到-196度,本法可說(shuō)是使用范圍最廣的微生物保存法. Company Logo4.4.甘油冷凍保藏法甘油冷凍保藏法v 將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間，用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分?jǐn)U散到無(wú)菌水中，調(diào)證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20無(wú)菌甘油，輕輕振試管管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小管。甘油冷凍管

11、最好在-30 貯存。Company Logo5.5.磁珠保存法磁珠保存法v 將菌液浸入素?zé)胖椋ɑ蚨嗫撞Ａе椋┖笤龠M(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無(wú)水caso4），上鋪玻璃棉，再放上1020粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對(duì)酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。Company Logov 成品化菌株保藏管，內(nèi)含特制20-25顆玻璃珠，只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細(xì)胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70可保存5年，置-20可保存1-3年。v該方法適用于細(xì)菌，霉菌和酵母等，特別適合

12、保存苛養(yǎng)和該方法適用于細(xì)菌，霉菌和酵母等，特別適合保存苛養(yǎng)和嬌弱的菌株。嬌弱的菌株。Company Logo6.6.凍干保藏法凍干保藏法v 真空冷凍干燥 （vacuum freeze-drying）：將微生物冷凍，在真空減壓下利用升華作用除去水分，使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止，從而長(zhǎng)期維持存活狀態(tài)。v 冷凍干燥法適用范圍：適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。v 是一種長(zhǎng)期保藏菌種，一般情況下購(gòu)買的凍干菌種即為此種方法，使用時(shí)需要溶解、復(fù)壯和冷藏。Company Logo其他菌種保藏技術(shù)其他菌種保藏技術(shù)v載體保存法載體保存法

13、 土壤保存法土壤保存法 砂土保存法砂土保存法 硅膠保存法硅膠保存法 麩皮保存法麩皮保存法 濾紙片保存法濾紙片保存法v懸液保存法懸液保存法v寄主保存法寄主保存法v牛乳保存法牛乳保存法Company Logo保存菌種的保存期限保存菌種的保存期限菌種菌種培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)時(shí)間（間（h）培養(yǎng)基培養(yǎng)基保存溫保存溫度（度（）保存時(shí)間保存時(shí)間流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌1824脫纖維羊血或脫脂牛奶脫纖維羊血或脫脂牛奶-206個(gè)月個(gè)月葡萄球菌、葡萄球菌、鏈球菌鏈球菌1824血瓊脂斜面（高層加液體石蠟）血瓊脂斜面（高層加液體石蠟）4813個(gè)月個(gè)月腸桿菌科腸桿菌科1824Soxbean酪蛋白瓊脂高（加液體石酪蛋白瓊脂高（加液體石蠟）蠟）481年年腸桿菌科、腸桿菌科、非發(fā)酵菌、非發(fā)酵菌、