細(xì)胞培養(yǎng)綜合知識

1、實(shí)驗(yàn)二 傳代細(xì)胞培養(yǎng)與病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獾怪蔑@微鏡的構(gòu)造與使用，了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的病變特征，掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細(xì)胞的種類BHK-21：倉鼠腎傳代細(xì)胞PK-15：豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2：豬腎傳代細(xì)胞Hela：人的子宮瘤細(xì)胞Vero：非洲綠猴腎細(xì)胞Marc-145：來源于Vero細(xì)胞TK-143：人的胸苷激酶陰性細(xì)胞Sf9：昆蟲細(xì)胞 三、材料1、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭2、BHK-21（baby hamster kidney）細(xì)胞3、0.25%胰酶4、生長液：含10%犢牛血清、200U/m

2、l青、鏈霉素的DMEM 維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液（PRV）四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1）細(xì)胞密度：2-3×105個/ml2）pH范圍 最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培養(yǎng)溫度 哺乳動物細(xì)胞一般為37 昆蟲細(xì)胞28-30五、常用細(xì)胞分散劑與作用原理1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個細(xì)胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細(xì)胞分散。3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽

3、酶的混合物。六、營養(yǎng)液1、人工綜合營養(yǎng)液氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。2、血清1）血清的種類 胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56滅活30min。3）血清的作用A、能提供細(xì)胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì)成分。D、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。F、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶

4、的損害。4）應(yīng)用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)：補(bǔ)體、免疫球蛋白、生長抑制因子。B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析。C、不同動物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點(diǎn)：1) 可以無限的傳代。2) 不少細(xì)胞系對病毒很敏感。3) 某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。2、 缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。3、 培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml 胰酶消化液，于37培養(yǎng)箱放置幾分鐘，至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后，倒去消化液

5、。3）加入生長液,反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞，然后分裝于3個小瓶中。再在每個小瓶中補(bǔ)充生長液至10ml，然后置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2天即可長成單層。八、病毒（PRV）在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)1、選長滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補(bǔ)足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至80%以上的細(xì)胞病變。5、收毒：將病變的細(xì)胞置于-20冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。實(shí)驗(yàn)四 病毒感染力的滴定（TCID50的測定）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

6、的 了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的操作步驟、計(jì)算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用細(xì)胞來檢測蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細(xì)胞來檢測三、材料 1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）四、T

7、CID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。 2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100µl。3、在每孔加入細(xì)胞懸液100µl，使細(xì)胞量達(dá)到23×105個/ml。 4、設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。（100µl生長液+100µl細(xì)胞懸液）5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TCID50的計(jì)算方法1、Reed-Muench兩氏法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累

8、 計(jì)出現(xiàn)CPE孔所占的%CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6 （11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathic effect距離比例（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）  （91.6-50）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù) =0.8×(-1)+(-3) =-

9、3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.8接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-60 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.875接種100µ

10、;l可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。Marc 145細(xì)胞培養(yǎng)和維持綜述 發(fā)布: 2010-02-10 來自: 易生物實(shí)驗(yàn) 閱讀數(shù)：5241次 一、 細(xì)胞及培養(yǎng)1、Marc145細(xì)胞上皮樣細(xì)胞，來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞（MA 104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)培養(yǎng)。2、生長培養(yǎng)基DMEM（高糖型，含4500mg/L D葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）510新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)液。3、凍存液生長培養(yǎng)基10% DMSO4、細(xì)胞健康生長的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）細(xì)胞沒有支原體等外源因子的感染。（2）培養(yǎng)液的pH值可在7.07.3，以7.2為佳。（3）一般按1：3

11、傳代，細(xì)胞接種密度為11.5×105cells/ml，48hr后長成單層。（4）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定；建議采用特級小牛血清。（5）細(xì)胞及時傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長成細(xì)胞單層時進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。（6）細(xì)胞傳代時消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過程應(yīng)盡量縮短在12分鐘內(nèi)完成。二、 病毒感染、維持和收獲轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長成單層后，棄瓶內(nèi)細(xì)胞生長液，接種PRRS病毒。37吸附1hr，加入維持液，置37恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)35天。維持液：DMEM+45新生牛血清。pH應(yīng)為7.47.8；后期維持pH會慢慢降下來。細(xì)胞病變時間出現(xiàn)在接毒后48小時，7296小時細(xì)胞

12、病變達(dá)80左右，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變（CPE）時，即可開始收毒；反復(fù)傳過幾代后病變時間可縮短。第3、4天注意觀察，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到80時收獲病毒，20凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測定TCID50。收液時需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融23次以破碎細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。三、 細(xì)胞病變（CPE）細(xì)胞在接種病毒后，2448hr開始出現(xiàn)病變，7296hr約達(dá)到80病變。病變現(xiàn)象：細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，最后整個細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律（ Virology Journal, 2006, 3

13、: 90）PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過程可大致分為兩個感染階段，第一階段：病毒感染細(xì)胞后的2022hr左右，僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染，而且Marc 145細(xì)胞對PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無關(guān)，因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的23天（也稱為病毒的對數(shù)感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染，細(xì)胞對自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過程如圖5所

14、示。對我們的一點(diǎn)啟示：可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時，大部分細(xì)胞在維持期的第一天尚需繼續(xù)生長，而且病毒在24天才是感染、增殖的高峰，較長的病毒維持期均需要供給豐富的營養(yǎng)物資，可以相信：維持液的營養(yǎng)成分對病毒增殖效率有非常重要的影響細(xì)胞的復(fù)蘇一、細(xì)胞復(fù)蘇的原則在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。二、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。(2)迅速放入38水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細(xì)胞。(3)在1000r/min速度下離心510分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密