食品生物技術(shù)導(dǎo)論

1、食品生物技術(shù)：是現(xiàn)代生物技術(shù)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，是指現(xiàn)代生命科學(xué)的研究成果為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代工程技術(shù)手段和其他學(xué)科的研究成果，用全新的方法和手段設(shè)計新型的食品和食品原料 基因工程：又稱基因拼接技術(shù)和dna重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種 dna分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品 基因工程的理論基礎(chǔ)：1、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)2、基因是可切割和轉(zhuǎn)移的3、多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系4、基因的遺傳信息是可以遺傳的 基因工程的主要內(nèi)容：1、在供體細胞中用限制性內(nèi)切酶切割基因

2、，以分離出含有特定的基因片段或人工合成目的 基因并制備運載體（質(zhì)粒、病毒或噬菌體）2、把獲得的目的基因與制備好的運載體用dna連接酶連接組成重組體3、把重組體引入宿主細胞4、篩選、鑒定出含有外源目的基因或個體工具酶：限制性內(nèi)切酶、核酸酶、連接酶、聚合酶i型限制性內(nèi)切酶：不能專門切割 dna的某個特殊位點（未大量使用）n型限制性內(nèi)切酶：可在特殊位點切割 dna,產(chǎn)生具有黏性末端或其他形式的dna分子片段（廣泛應(yīng)用）? 同裂酶：來源不同，具有相同的識別序列? 同尾酶：識別序列不同，切割后，具有相同的dna黏性末端出型限制性內(nèi)切酶：具有獨特的識別方式和切割方法，如 mbo n 基因載體：質(zhì)粒（能自主

3、復(fù)制的雙鏈 dna分子，在細菌中獨立于染色體之外存在：具有復(fù)制起點相對分子質(zhì)量盡可能小有單一的限制性內(nèi)切酶識別位點有一個或多個選擇標記基因）、植物病毒、噬菌體 理想的基因工程載體具備的特征：1、能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的dna自我復(fù)制，在外源dna插入其dna復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，仍能保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性2、易于從宿主細胞中分離，并進行純化3、有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶單一酶切位點4、具有能夠直接觀察的表型特征質(zhì)粒載體pbr322:大小為4363bp,含有兩個抗生素抗性基因 （抗氨茉青霉素和抗四環(huán)素）， 還有單一的bam hi、hindm和sali的識別位點，這三個位點都在四環(huán)素抗性基因內(nèi)；

4、另 一個單一的psti識別位點在氨茉青霉素抗性基因內(nèi)質(zhì)粒載體puc19: pbr322帶的單一克隆位點較少， 篩選程序較費時，puc19是在其發(fā)展的， 有一個氨茉青霉素抗性基因和一個大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖甘酶基因（lac z'）的調(diào)節(jié)片段，一個調(diào)節(jié)lac z基因表達的阻遏蛋白的基因 lac i ,還有多個單克隆位點 酵母質(zhì)粒載體：既可以在大腸桿菌中復(fù)制，又可在酵母系統(tǒng)中復(fù)制，又稱穿梭載體噬菌體載體：細菌病毒聚合酶鏈式反應(yīng)法（pcr）: pcr模才d dna聚合酶在生物體內(nèi)的催化作用，在體外進行特異 dna序列的快速聚合及擴增。能快速、簡便地在體外擴增特定的dna片段，具有高度的 專一

5、性和靈敏度。過程：變形一退火一延伸，如此反復(fù)進行約30個循環(huán)。條件：要有與被分離目的基因的 dna雙鏈兩端序列相互補的 dna引物（約20個堿基）有熱穩(wěn)定性的酶 dntp作為模板的目的 dna序列 反應(yīng)緩沖液 克?。簩⒅亟Mdna導(dǎo)入受體細胞進行擴增和篩選，達到大量的重組分子，即外源基因的無 性繁殖重組dna導(dǎo)入受體細胞的方法： 率 轉(zhuǎn)化：將重組dna分子轉(zhuǎn)入受體細胞并在受體細胞中復(fù)制保存，這個過程為轉(zhuǎn)化 會 轉(zhuǎn)染：將攜帶外源基因的病毒感染受體細胞的方法（又分為磷酸鈣沉淀法 與體外包裝法）率微注射技術(shù)：將外源基因直接注射到真核細胞內(nèi)的方法 率 電轉(zhuǎn)化法：用到電轉(zhuǎn)移 率 微彈技術(shù)：也叫高速粒子轟擊

6、法或基因槍技術(shù) 率脂質(zhì)體介導(dǎo)法： 奉 其他方法：加速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法受體細胞：能攝取外源dna并使其穩(wěn)定保持的應(yīng)用價值或理論研究價值的細胞 選擇受體細胞應(yīng)考慮：安全性便于重組dna分子的導(dǎo)入便于篩選克隆分子 重 組dna分子在受體細胞內(nèi)并能穩(wěn)定維持適于外源基因的自主表達、分泌或積累重組體的鑒定： 報告基因的檢測法：指在構(gòu)建目的基因時將一種報告基因（如gus nptn、cat nos、ocs lus gfp）構(gòu)建在一起，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)化受體細胞時，報告基因一同被轉(zhuǎn)入（這種報 告基因是受體細胞本身不存在的，而且具有易于檢驗的表型 轉(zhuǎn)基因生物的 pcr鑒定：以被檢測的dna為模板，在外源基因的

7、兩側(cè)設(shè)計合理的引物，通 過pcr反應(yīng)進行擴增，然后通過凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物 目的基因分子雜交檢測方法 ：利用表達穩(wěn)定、易于檢測的報告基因的表達來間接地證明目的 基因的存在與表達，若需進一步證明目的基因的存在、轉(zhuǎn)錄及表達程度，需用分子雜交方法來檢測rna沉默：指在真核生物（植物、動物、真菌）中保守的由雙鏈rna誘導(dǎo)的鑒定和破壞其細胞質(zhì)中異常變異或過表達的rna的一種機制。是廣泛存在于植物、動物、線蟲和真菌等真核生中的一種高度保守的、序列特異的rna降解機制.rna沉默對于調(diào)控發(fā)育、維持基因組的穩(wěn)定性以響應(yīng)生物和非生物脅迫等具有重要作用 細胞工程：是以細胞為基本單位， 在離體條件進行培養(yǎng)或人為的精

8、細操作，使細胞在體外大規(guī)模地繁殖，使細胞的一些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達到體外生產(chǎn)生物產(chǎn)品的目的 細胞周期：指正常連續(xù)分裂的細胞從前一次分裂結(jié)束到下一次分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動態(tài)過 程（分為間期【g1期、s期、g2期】和分裂期【m期】） .滯后期：當(dāng)細胞接種或傳代至合適培養(yǎng)基中，細胞并不馬上立即進入快速對數(shù)生長期，而是群體細胞的生長存在一個緩慢生長階段，稱為滯后期 對數(shù)生長期：經(jīng)過滯后期準備，細胞適應(yīng)了新的環(huán)境，只要細胞生長所需要的各種營養(yǎng)條件 具備，細胞數(shù)目就呈幾何級數(shù)增加，而進入對數(shù)生長期（傳代接種或凍存細胞的理想時期） 穩(wěn)定期：新生的細胞數(shù)與死亡的細胞數(shù)大致相當(dāng)，細胞數(shù)保持一個

9、恒定數(shù)值，即進入了生長的穩(wěn)定期 衰亡期：處于穩(wěn)定期的細胞如果不傳代或不加入新鮮培養(yǎng)基，則會進入衰退死亡期 （培養(yǎng)基加細胞總數(shù)不變，活細胞數(shù)顯著下降） 細胞的全能性：一個與合子具有相同遺傳內(nèi)容的體細胞具有產(chǎn)生完整生物個體的潛在能力（意味著每個培養(yǎng)細胞仍然保持著完整的遺傳信息） 細胞融合：兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程（過程：制備原生質(zhì)體一誘導(dǎo)細胞融合一篩選雜合細胞）* 微生物細胞的培養(yǎng)基組成：碳源、氮源、無機鹽（ 功能：構(gòu)成菌體的組成 作為酶活性,基團的組成部分 調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的 ph 主要元素：磷、硫、鎂、鉀、鈣【以鹽和化合物形式添加

10、微量元素：鉆、銅、鐵、鎰、鋁、鋅【以雜質(zhì)存在，不必添加】）、維生素培養(yǎng)基分類：成分不同（天然、合成），物理狀態(tài)（固體、半固態(tài)、液體），用途（基礎(chǔ)、加 富、鑒別、選擇）培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)（用于菌種的分離、純化、保藏和種子的制備），液體培養(yǎng)（分為：»續(xù)箝養(yǎng)【恒濁培養(yǎng)：根據(jù)體系內(nèi)微生物的生長密度，通過自控儀表調(diào)節(jié)料液的流量，以取得菌體濃度和生長速度恒定的微生物細胞的培養(yǎng)方式恒化培養(yǎng)：保持培養(yǎng)液的流速不變，使培養(yǎng)罐內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)濃度基本恒定，并使微生物始終在低于其最走標培葬面隹的主要同同是；®一個生產(chǎn)所有的嫌都要停止運作，必須滅國后培養(yǎng)過程，如提高培養(yǎng)溫度、改變高生長速度的條件下進行

11、繁殖】、中間卦料培養(yǎng)、同步諳養(yǎng)、合第養(yǎng)） 連續(xù)培養(yǎng)遇到的問題：能動，在許多情配下有可能設(shè)計出一種染菌h或原料等,可使雜國不易生長:連續(xù)培養(yǎng)的收率和產(chǎn)物液度相對分批培養(yǎng)要低這將不否三養(yǎng)更易受菌種退化的的影洞，因為退化畫在在比生產(chǎn)肉更具生亡優(yōu)勢，少數(shù)退化i司的培養(yǎng)，合逐漸占據(jù)優(yōu)勢，從而造成減產(chǎn)植物細胞培養(yǎng)：廣義上 指在無菌條件下，將離體的單個游離細胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng), 以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù) 食品上指細胞懸浮培養(yǎng)，即使游離的植物細胞或一些小的細胞團在液體培養(yǎng) 基中增值并分離提取細胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物組織培養(yǎng)：愈傷組織一胚一完整個體糾胞培養(yǎng)：單個細胞一大量細

12、胞一分泌的產(chǎn)物* 治物細胞培養(yǎng)基組成：碳源、植物生長激素、有機氮源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑動物細胞培養(yǎng)：將動物細胞或組織從機體取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，在體外繼續(xù)生長和增殖的過程（過程：取材 一分散成單個細胞一制成懸液一傳代）【動物胚胎或幼齡動物】【胰蛋白酶】【貼壁&懸浮】 【營養(yǎng)不足&空間障礙】（方法：懸浮培養(yǎng) 【轉(zhuǎn)瓶、滾瓶、發(fā)酵罐式】，貼壁培養(yǎng)【貼壁因子吸附一接觸一貼壁一擴展】固定化培養(yǎng)基【細胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強】大規(guī)模培養(yǎng)法 【空心纖維法、微載體法、微囊法】 ）動物細胞培養(yǎng)基組成：氨基酸（12種

13、）、維生素、鹽、糖類（葡萄糖）、有機添加劑、激素和生長因素、其他成分（血清）【沒有細胞壁，易受污染 】細胞融合技術(shù)：指在一定條件下，將不同來源的原生質(zhì)體（除去細胞壁的細胞）相融合并使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)，又稱為體細胞雜交（過程：兩個親本細胞并列，細胞膜相接觸一膜組織局部破壞一形成包圍融合細胞的連續(xù)胞膜）（方法：生物學(xué)法【病毒】，化學(xué)融合劑法，電處理融合法）植物細胞工程在食品工業(yè)的應(yīng)用 ：生產(chǎn)香料生產(chǎn)食品添加劑（色素、甜味劑、鮮味劑、 防腐劑、增稠劑）生產(chǎn)天然食品生產(chǎn)植物藥生產(chǎn)抗氧化劑動物細胞工程的應(yīng)用：疫苗生產(chǎn) 干擾素生產(chǎn) 單克隆抗體生產(chǎn) 干細胞體外誘導(dǎo)分 化其他基因重組產(chǎn)品生

14、產(chǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)（氨基酸排列順序），二級結(jié)構(gòu)（借助氫鍵沿一維方向具有周期性 結(jié)構(gòu)的構(gòu)象），三級結(jié)構(gòu)（借助次級鍵【非共價鍵】盤繞成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu) 象），四級結(jié)構(gòu)（寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式）蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)：指食品體系在加工、 貯藏、制備和消費過程中蛋白質(zhì)對食品生產(chǎn)需要特 征的那些物理、化學(xué)性質(zhì)（兩大類：流體動力學(xué)性質(zhì)【 水吸收和保持、溶脹性、黏附性、黏度、沉淀、膠凝、蛋 白質(zhì)面團和纖維這種結(jié)構(gòu)起作用的性質(zhì)】表面性質(zhì)【濕潤性、分散性、溶解性、表面張力、乳化作用、蛋白質(zhì)的起泡特 性、脂肪和風(fēng)味的結(jié)合】）蛋白質(zhì)工程：指通過生物技術(shù)對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對

15、編碼蛋白質(zhì)的基因進彳叵以 便獲得更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)（研究內(nèi)容：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的基因修飾和基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計、構(gòu)建，并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)前提：了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能核心手段：改造基因步驟：分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶并做分析，得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息對目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域通過對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、 空間結(jié)構(gòu)和功能之間相互關(guān)系的分析，找出關(guān)鍵的基因和結(jié)構(gòu)圍繞這些關(guān)鍵的基因和結(jié)構(gòu)提出對蛋白質(zhì)進行改造的方案，并用基因工程的方法去實施對經(jīng)過改

16、造的蛋白質(zhì)進行功能性測定，看看改造效果如何 然后，重復(fù)和這兩個步驟，直到獲得比較理想的結(jié)果改造方法：個別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入【 初級改造】 蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接【 高級結(jié)構(gòu)】 從頭設(shè)計合成新型蛋白質(zhì)主要采用的基因突變方法 ：基因定向誘變，盒式突變）盒式突變：又稱片段取代法，是利用目標基因序列中適當(dāng)限制酶切位點，插入各種合適的突變dna片段，用以取代目標基因中特定 dna片段。（是一種常用的定點突變技術(shù)。適用于 需要突變位點的兩端有成對的酶切位點的情況）基因的定向誘變：在dna水平上產(chǎn)生多肽編碼順序的特異性改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 ：蛋白質(zhì)是功能性大分子

17、.每一種蛋白質(zhì)都有特定的一級結(jié)構(gòu)和空 間結(jié)構(gòu)，這些特定的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行使蛋白質(zhì)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的各種功能又是其結(jié)構(gòu)的表現(xiàn).蛋白質(zhì)的任何功能都是通過其肽鏈上各種氨基酸殘基的不同功能基團來實現(xiàn)的，所以,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)一旦確定 ，蛋白質(zhì)的可能功能也就確定了 ，而且從某種程度上來說 ，蛋白質(zhì) 的三級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系更大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對維系生物體生命活動的重要性：（1）蛋白質(zhì)是細胞和生物體結(jié)構(gòu)和生命活動的重要物質(zhì)，如紅細胞中與運輸氧氣有關(guān)的血紅 蛋白；細胞膜上與物質(zhì)跨膜運輸有關(guān)的載體蛋白及與細胞識別、傳導(dǎo)有關(guān)的糖蛋白。rna(2)具有催化作用的酶大多是蛋白質(zhì)，如唾液淀粉酶可把淀粉分解為麥芽

18、糖；纖維素酶和果 膠酶在植物細胞工程中用于除去細胞壁；胰蛋白酶在動物細胞工程中用于分離細胞；聚合酶在基因表達過程中用于dna轉(zhuǎn)錄為mrnao(3)有些蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用， 如垂體分泌的生長激素對動物生長有促進作用， 若幼年缺乏， 可導(dǎo)致侏儒癥；胰島b細胞分泌的胰島素有降低血糖濃度的作用， 若人體缺乏，則患糖尿?。?胰高血糖素由胰島 a細胞分泌，有升高血糖濃度的作用，與胰島素作用相拮抗。(4)特異性免疫中的免疫物質(zhì)，既包括體液免疫中由漿細胞分泌的免疫球蛋白一一抗體，也 包括細胞免疫中由效應(yīng) t細胞產(chǎn)生的干擾素等淋巴因子。蛋白質(zhì)的主要功能：催化功能：酶調(diào)節(jié)功能：激素結(jié)構(gòu)功能：皮、毛、骨、牙、細胞骨

19、架運輸功能：血紅蛋白 免疫功能：免疫球蛋白運動功能：鞭毛、肌肉蛋白 儲藏功能：酪蛋白 生物膜功能：及神經(jīng)傳導(dǎo)等如何理解蛋白質(zhì)工程是第二代基因工程：蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域?；蚬こ淌峭ㄟ^基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進行表達，它的產(chǎn)品是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程自誕生之日起， 就與基因工程密不可分。 蛋白質(zhì)工程根據(jù)對分子 預(yù)先設(shè)計

20、的方案，通過對天然蛋白質(zhì)的基因進行改造，來實現(xiàn)對它所編碼的蛋白質(zhì)進行改造。因此，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的、具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)中心、法貝h如何理解蛋白質(zhì)工程的非理性設(shè)計非理性蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)是在不了解有關(guān)酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等信息的情況下通過對酶 基因的隨機突變和基因片段的重組來創(chuàng)造突變庫，然后通過高通量的篩選手段鑒定性能改善的突變體，挑出的有益突變基因可以作為下一輪突變的模板，進行多輪突變和篩選，以進一步提高酶的性能。這些失敗可能是因為對要改造的酶性質(zhì)的內(nèi)在機制缺乏理解，有很多失敗例子都是將氨基酸序列同源作為氨基酸替換的唯一標準，忽視了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，這樣做的

21、結(jié)果是導(dǎo)致替換的氨基酸不但對要改變的酶特性無影響，而且常常因氨基酸改變導(dǎo)致酶構(gòu)像的改變而使酶鈍化。 蛋白質(zhì)工程理性設(shè)計：在理性設(shè)計中，首先要根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 功能和機制等詳細資料對 氨基酸序列中要突變的位點進行精確設(shè)計，然后通過取代、插入或缺失等手段改變蛋白質(zhì)分子中特定的氨基酸。從而鑒定出與酶特性相關(guān)的關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)元件。理性設(shè)計的方法 有寡核甘酸介導(dǎo)的重組 pcr限制性內(nèi)切酶酶切片段取代法，盒式突變法和化學(xué)合成法。與使用化學(xué)因素、自然因素導(dǎo)致突變的方法相比，定點突變具有突變率高、簡單易行、重復(fù)性好的特點。蛋白質(zhì)工程的改造策略1、疏水氨基酸常常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活動中心區(qū)域；“螺旋和3折疊區(qū)通常

22、不會是酶的活性 中心以及底物結(jié)合的中心，而是作為結(jié)構(gòu)的支架；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)域和帶電荷區(qū)域通常位于蛋白質(zhì)的表面。2、進行定點突變時，應(yīng)注意保守氨基酸殘基。如果要改變酶活性、底物結(jié)合活性等高度特 異性的性質(zhì)，則應(yīng)盡量保留保守殘基。3、應(yīng)注意保留潛在的 n糖基化位點（asn-x-ser/thr-x-pro）中的asn（天門冬酰胺/set（絲氨酸） 或thr（蘇氨酸）。4、對于含有內(nèi)含子的序列，可以刪除某一外顯子或外顯子組合，因為單個外顯子通常編碼 獨立折疊的結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會影響蛋白其余部分的正確折疊。5、構(gòu)建兩個同源蛋白的嵌合體時，應(yīng)盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸 序列中

23、；而當(dāng)兩個非同源蛋白組成嵌合體時，則應(yīng)使接合部分盡量位于所預(yù)測結(jié)構(gòu)的邊緣。6、如果對目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)一無所知，那么可以在目的序列中隨機插入六聚體接頭以鑒 定功能性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個氨基酸，比插入更多的氨基酸對蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。7、進行缺失突變時，應(yīng)避免直接利用天然存在的限制性酶切位點進行刪除。 蛋白質(zhì)工程在食品中的應(yīng)用：* 提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個方面：延長酶的半衰期；提高酶的熱穩(wěn)定性； 延長藥用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。一、消除酶的被抑制特性1985年，美國的埃斯特爾借助寡核甘酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，用19種其他氨基酸分

24、別替代枯草芽抱桿菌蛋白酶分子第 222位殘基上易氧化的 met ,獲得了一系列活性差異很大的突變 酶。發(fā)現(xiàn)除了用 cys代替met的突變體以外，其他突變體的酶活性都降低了。 二、引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶分子：由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成二個相對獨立的結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸。由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價化學(xué)鍵，能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對或數(shù)對二硫鍵。 三、轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 在高溫下asn和gln容易脫

25、氨形成 asp和glu,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失 去活性。對釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進行誘變改造。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有2個asn,由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。通 過寡核甘酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上的2個asn分別轉(zhuǎn)變成thr（蘇氨酸）和ile（異亮氨酸）殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。四、改變酶的最適ph值條件葡萄糖異構(gòu)酶最適 ph為堿性，在80 c穩(wěn)定，而在堿性條件下，80 c時使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60c進行。采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸（glu或asp）集中的區(qū)域置換為

26、堿性氨基酸 （arg或lys）,可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適ph值變?yōu)樗嵝?，即可在高溫下進行反應(yīng)。五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基團決定，如對酪氨酸-trna合成酶進行定點突變。在天然狀態(tài)下，酪氨酸-trna合成酶分子內(nèi)第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺喋吟核甘酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個氫鍵的存在影響酶分子與另一底物 atp的親和力。因此, 利用定向誘變技術(shù)將酶分子第 51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?酶(pro-51)與atp的親和 力被增加了近100倍，而且最大反應(yīng)速度亦大幅度提高。六、修飾酶的催化特異性利用定點突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的 gl

27、u、asp被gln、asn取代時，突變體酶分解a -1, 4糖昔鍵和a -1, 4糖昔鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。七、修飾nisin的生物防腐效應(yīng)nisin是乳酸球菌分泌的有較強抗菌作用的小分子肽，可用于罐頭食品、乳制品、肉制品的保藏。nisin由34個氨基酸殘基構(gòu)成。nisin分子結(jié)構(gòu)中包含 5種稀有氨基酸，即aba、dha、dhb、ala-sala和ala-&aba,它們通過硫醛鍵形成五個內(nèi)環(huán)。改變 nisin氨基酸的序列，可增強其穩(wěn)定性、溶解度和擴大抑菌譜等，擴大 nisin的應(yīng)用范圍。酶工程：又稱酶技術(shù)，就是利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品的

28、過程，是酶學(xué)理論與化工技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新技術(shù)1是指重組dma技術(shù)的產(chǎn)汕化設(shè)計與應(yīng)用.包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分口上游技術(shù)指的 是基因重絹、克隆和表達的設(shè)i十與構(gòu)建(即重組dza技 術(shù))：而下游技忙貝上步愛到荃因工程菌或名田胞白勺大規(guī)模 土畜養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程.在 聿i用 jk因工布142t 術(shù)了 姆締 當(dāng) 安， 洲t g 妁壅曲上,4卜備質(zhì) 嶼龕l爰改序更1, 結(jié)抬開.勿能比行：旺而通也號壬e麻的船曲.嘉基ml序次i妁 吐電4期年后的仔姆普尋奴，農(nóng)史& 至由析的不。頁有歡妁爰，質(zhì)q； 利用密注量妁約膏總. dza, 妄石質(zhì)紜無備質(zhì)片隊等代族4 住 jc 已 鳧檜

29、 我才員*t妁維1 "禾 春,畬發(fā)畤工衽鳥于生物枝術(shù)的下環(huán)戰(zhàn)術(shù) » 應(yīng)工業(yè)化大觀棋珞養(yǎng)癡的.生產(chǎn)生 他嗣品的一種戰(zhàn)術(shù).化學(xué)酶工程：亦稱初級酶工程，指自然酶、 化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng) 用天然酶：材料提取，工業(yè)應(yīng)用*化學(xué)修飾酶：化學(xué)修飾，酶學(xué)研究和疾病治療率固定化酶：束縛于支持物上，反復(fù)使用率人工合成酶：化學(xué)合成生物酶工程：亦稱高級酶工程， 是酶學(xué)和以dna重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合 的產(chǎn)物。率用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）率修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）率設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。獲取酶制劑的方法：組織提?。耗竟系鞍酌?/p>

30、、凝乳蛋白酶微生物發(fā)酵：最大量的來源化學(xué)及生物合成：生物重組利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點： 酶種豐富：微生物種類多、菌株易誘變，菌種多樣 酶產(chǎn)量高：微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶 生產(chǎn)成本低：微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價格便宜 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化，經(jīng)濟效益高可改造性強：可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種酶生產(chǎn)菌的要求：安全可靠，非致病菌不易退化，不易感染噬菌體 產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶，以利于酶產(chǎn)品的分離純化能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)酶的發(fā)酵方法：固體發(fā)酵法：優(yōu)點是設(shè)備簡單，操作方便。缺點是缺點是勞動強度較大，原料利用率較低， 生產(chǎn)周期較長液體發(fā)酵法：液體深層發(fā)酵是目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式固定化細胞發(fā)酵： 歷史不長，技術(shù)要求較高，需特殊的固定化細胞反應(yīng)器，只適用于胞外酶的生產(chǎn)提高酶產(chǎn)量的方法：（1）通過條件控制提高酶產(chǎn)量?添加誘導(dǎo)物?降低阻