基于核酸適配體熒光法檢測(cè)赭曲霉素A

1、wyiT論女第表&?；诤怂徇m配體熒光法檢測(cè)赭曲霉素 A【摘要】：第一章：簡(jiǎn)單介紹了核酸適配體的定義和特點(diǎn)，赭曲霉素A(OTA)檢測(cè)的重要性和常用的檢測(cè)方法；綜述了基于核酸適配體檢 測(cè)赭曲霉素A的不同方法；闡述了本論文的立題背景、研究?jī)?nèi)容及 創(chuàng)新點(diǎn)。第二章：利用核酸適配體熒光探針，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理建立了一種檢測(cè)赭曲霉素 A的熒光分析方法。赭曲霉素 A在 375nm波長(zhǎng)下激發(fā)，在430nm處可以發(fā)熒光，赭曲霉素A與標(biāo)記有熒光 素的核酸適配體結(jié)合后，兩者之間可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光素在 518nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。根據(jù) 518nm處熒光強(qiáng)度的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì) 赭曲霉素A的檢測(cè)。這種

2、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)，檢出限達(dá) 到了 1nmol/L。第三章：利用熒光素標(biāo)記的核酸適配體(FDNA)和熒光 猝滅基團(tuán)(BHQ)標(biāo)記的互補(bǔ)寡聚核苷酸鏈(QDNA)建立了一種檢測(cè)赭 曲霉素A的熒光分析法。未加入赭曲霉素 A時(shí),標(biāo)記有熒光素的核酸 適配體與標(biāo)記有猝滅基團(tuán)的互補(bǔ)寡聚核苷酸鏈結(jié)合，熒光基團(tuán)與猝滅 基團(tuán)靠近，導(dǎo)致熒光猝滅；當(dāng)加入赭曲霉素 A后,FDNA與赭曲霉素A 高親和力高特異性結(jié)合，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離,FDNA的熒光信號(hào) 得到恢復(fù)。根據(jù)FDNA與目標(biāo)物結(jié)合前后熒光強(qiáng)度的變化，可以實(shí)現(xiàn) 對(duì)赭曲霉素A的定量檢測(cè)。第四章：利用赭曲霉素 A本身的熒光特 性，發(fā)展了一種通過(guò)熒光各向異

3、性分析快速考察赭曲霉素A(OTA)與核酸適配體之間的相互作用的方法。赭曲霉素A與核酸適配體的特異性結(jié)合使分子體積增大，赭曲霉素A旋轉(zhuǎn)變慢，引起熒光各向異性值增大。通過(guò)熒光各向異性分析考察了緩沖液成分中金屬離子對(duì)適配體 親和力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)Na+與Ca2+同時(shí)存在時(shí)赭曲霉素A與核酸 適配體之間的親和力明顯增強(qiáng)，這與溶液中只有Ca2+時(shí)相比親和力增 大了 18倍，當(dāng)Ca2+不存在時(shí)適配體親和力完全消失。另外，利用熒光 各向異性方法研究了核酸適配體突變對(duì)親和力的影響，對(duì)適配體親和力起重要作用的堿基可以被鑒別出。建立了一種基于適配體檢測(cè) OTA 的熒光各向異性分析法，在緩沖液中固定適配體和OTA標(biāo)

4、準(zhǔn)物的濃度, 加入不同濃度的OTA待測(cè)物,OTA熒光各向異性值會(huì)隨著待測(cè)物濃度 的增加而降低，根據(jù)熒光各向異性值的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì) OTA的檢測(cè)。 第五章：建立了一種采用單熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體檢測(cè)赭曲霉素 A的方法。當(dāng)標(biāo)記有熒光基團(tuán)的適配體與 OTA結(jié)合時(shí),熒光基團(tuán)周?chē)?的環(huán)境發(fā)生變化，從而引起熒光強(qiáng)度的變化，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn) 對(duì)OTA的檢測(cè)?？疾炝诉m配體不同位點(diǎn)上標(biāo)記熒光素（包括T堿基,3' 端,5'端）對(duì)適配體親和力的影響，還考察了熒光素標(biāo)記的適配體對(duì) OTA的響應(yīng)性能。一些熒光素標(biāo)記的核酸適配體在檢測(cè)OTA時(shí)表現(xiàn)出信號(hào)增加或是降低的響應(yīng)。采用熒光開(kāi)關(guān)適配體，實(shí)現(xiàn)了

5、對(duì)OTA的 快速、有選擇性的檢測(cè)，在稀釋后的紅葡萄酒中也可以檢測(cè) OTA,表明 本方法可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中 OTA的檢測(cè)。【關(guān)鍵詞】：核酸適配體赭 曲霉素A熒光分析熒光各向異性【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：碩士【學(xué)位授予年份】：2013【分類(lèi)號(hào)】：0657.3【目錄】:中文摘要10-12ABSTRACT12-14第一章緒論14-341.1引言14- 151.2赭曲霉素A檢測(cè)方法研究進(jìn)展15-251.2.1核酸適配體介紹15- 161.2.2基于核酸適配體的赭曲霉素 A的檢測(cè)16-251.2.2.1基于核酸適配體光學(xué)方法檢測(cè)赭曲霉素A16-191.2.2.2基于核酸適配體電化學(xué)方法檢測(cè)赭

6、曲霉素 A19-241.2.2.3基于核酸適配體檢測(cè)赭曲霉素A的其他方法24-251.3立題背景及主要研究?jī)?nèi)容25-261.4創(chuàng)新點(diǎn)26-27 參考文獻(xiàn)27-34第二章基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的核酸適配體探針檢測(cè)赭曲霉素A34-462.1引言34-352.2實(shí)驗(yàn)部分35-362.2.1儀器與試劑 352.2.2熒光分析352.2.3實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化35-362.2.4赭曲霉素A的檢 測(cè)362.2.5特異性實(shí)驗(yàn)362.2.6回收率實(shí)驗(yàn)362.3結(jié)果與討論36-422.3.1 實(shí)驗(yàn)原理36-372.3.2赭曲霉素A與FAM標(biāo)記的適配體之間的FRET 考察372.3.3離子濃度的影響37-392.3.4方

7、法選擇性的考察39-402.3.5 赭曲霉素A的檢測(cè)40-412.3.6紅葡萄酒樣品中赭曲霉素 A的檢測(cè) 41-422.4結(jié)論42參考文獻(xiàn)42-46第三章基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換適配體熒光法 檢測(cè)赭曲霉素A46-583.1引言46-473.2實(shí)驗(yàn)部分47-483.2.1儀器和試 劑473.2.2熒光分析473.2.3實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化47-483.2.4赭曲霉素A的 檢測(cè)483.2.5特異性實(shí)驗(yàn) 483.2.6回收率實(shí)驗(yàn) 483.3結(jié)果與討論48- 553.3.1實(shí)驗(yàn)原理48-493.3.2離子濃度、pH值、Tween20的影響49- 513.3.3試劑加入順序及溫育溫度的影響51-523.3.4選擇性的考察

8、yiT論女為表站家52-53335赭曲霉素A的檢測(cè)53-543 36復(fù)雜基質(zhì)中赭曲霉素 A的檢 測(cè)54-553.4結(jié)論55參考文獻(xiàn)55-58第四章利用熒光各向異性分析研 究赭曲霉素 A與適配體之間的相互作用及對(duì)赭曲霉素A的檢測(cè)58-804.1引言58-594.2實(shí)驗(yàn)部分59-60421儀器和試劑594.2.2實(shí)驗(yàn) 方法59-604.2.3解離常數(shù)的測(cè)定604.3結(jié)果與討論60-754.3.1赭曲霉 素A與適配體之間相互作用的熒光各向異性分析60-624.3.2陽(yáng)離子對(duì)適配體親和力的影響 62-644.3.3緩沖液pH對(duì)適配體親和力的影響 64-654.3.4解離常數(shù)的測(cè)定65-694.3.4.1親和力的測(cè)定654.3.4.2解離 常數(shù)的測(cè)定65-664.3.4.3不同緩沖液中解離常數(shù)的考察 66-694.3.5適 配體堿基突變對(duì)親和力的影響69-724.3.6采用熒光各向異性法檢測(cè)赭 曲霉素A72-754.3.6.1熒光各向異性法檢測(cè)赭曲霉素 A72-734.3.6.2復(fù) 雜基質(zhì)中赭曲霉素A的檢測(cè)73-754.4結(jié)論75-76參考文獻(xiàn)76-80第五 章利用單熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體檢測(cè)赭曲霉素A80-945.1引言805.2實(shí)驗(yàn)部分80-825.2.1儀器和試劑80-815.2.2熒光分析81-825.3 結(jié)果與討論82-895.3.1實(shí)驗(yàn)原理 825.3.2適配體標(biāo)記位點(diǎn)的篩選