10腫瘤分子生物標(biāo)志物的流式定量分析

1、n近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤生物分子標(biāo)志物，已將標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤診斷、判定療效、預(yù)測預(yù)后和轉(zhuǎn)移等方面，且有較大的腫瘤臨床和研究的實(shí)用價值，并在研究癌變的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中引起人們的極大關(guān)注，特別在癌前期病變腫瘤標(biāo)志物研究中，成為腫瘤防治研究的熱點(diǎn)之一，已經(jīng)顯示出在癌變研究中具有重要意義。n流式細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤分子生物標(biāo)志的檢測已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，如dna異倍體、激素受體、癌基因和抗癌基因蛋白產(chǎn)物等，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞的分化、分級、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有一定相關(guān)性，現(xiàn)分述如下： 一、一、dna異倍體異倍體 n研究證明，大部分惡性腫瘤有dna含量的異常改變(dna含量的增多或減少)，bado

2、gie等報(bào)道，實(shí)體瘤的異倍體檢出率在60-100%。由于腫瘤細(xì)胞在增殖分裂過程中出現(xiàn)dna合成的丟失或不分離，而產(chǎn)生了dna異常的細(xì)胞群，即出現(xiàn)dna異常的干系(克隆)，這種dna異常干系，即稱為dna異倍體。流式細(xì)胞術(shù)定量分析dna異倍體，應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評價方面。 癌前病變出現(xiàn)癌前病變出現(xiàn)dna異倍體及在癌變異倍體及在癌變早期診斷的意義。早期診斷的意義。 n癌前期病變是腫瘤防治研究中的一個重要課題，從癌前病變中發(fā)現(xiàn)早期癌變的患者，并找出作為早期癌變的特征性標(biāo)志物，是人們一直努力探尋的方法，使腫瘤得到早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有重要意義。n研究發(fā)現(xiàn)，在眾多的癌前病例中，并非所有的癌前病變

3、都將發(fā)生、發(fā)展成為癌癥。哪些癌前病變將發(fā)生癌變，哪此將不發(fā)生癌變，是人們正在努力尋找作為癌變的恃征性標(biāo)志物。n目前，從病理形態(tài)學(xué)方法對于可能癌變的病例作出一個確切的診斷標(biāo)準(zhǔn)還十分困難。 n研究證明，dna異倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生癌變的一個重要標(biāo)志物，已有作者對食管、宮頸、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病變進(jìn)行了流式dna倍體分析研究。ntedori等應(yīng)用 fcm 分析了20例胃粘膜萎縮性胃炎伴不典型增生細(xì)胞的dna倍體，發(fā)現(xiàn)dna異倍體9例，其中5 例在隨診半年后被病理學(xué)確診為癌變，發(fā)現(xiàn)異倍體與癌前病變細(xì)胞不典型增生程度有關(guān)。n作者對208例石蠟包埋組織、和1000 多例食管脫落細(xì)胞的癌前病變細(xì)

4、胞流式 dna 倍體分析(見表15)，并指出如下診斷標(biāo)準(zhǔn)，供參考。 1.出現(xiàn)dna異倍體峰位診斷陽性。 2.s期細(xì)胞大于15%，g2m期大于10%(突出的四倍體峰位)診斷為陽性。 3.s期細(xì)胞大于 10-15%， 并有突出四倍體峰位，診斷為可疑癌。 4.go/1期細(xì)胞峰的cv值大于9%，作為參考指標(biāo)。 n我們的研究結(jié)果(見表16)，表明dna異倍體可能是重要的癌變標(biāo)志物。 n從癌前病變中發(fā)現(xiàn)早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個早期預(yù)警性診斷，已成為人們十分關(guān)注的研究焦點(diǎn)，通過對癌前病變細(xì)胞dna異倍體的fcm檢測，可能有助于對癌前病變作出病理學(xué)診斷的超早期癌診斷。n研究發(fā)現(xiàn)癌前病變細(xì)胞dna

5、含量與病變不典型增生程度密切相關(guān)(見表17)。dna指數(shù)隨不典型增生增高逐漸漸升高，從dna含量進(jìn)一步說明癌變并非由正常細(xì)胞突發(fā)為癌細(xì)胞，而是經(jīng)過一個量變到質(zhì)變的過程，癌前病變即處于量變過程。 n出現(xiàn)dna異倍體細(xì)胞群則證明從量變到質(zhì)變的過程，tedori 等認(rèn)為，當(dāng)癌前病變出現(xiàn) dna異倍體時， 說明已發(fā)生癌變或已具有潛在癌變的可能性， 盡管還不具備病理形態(tài)學(xué)的癌變診斷標(biāo)準(zhǔn)， 大多數(shù)研究者還發(fā)現(xiàn)，癌前病變不典型增生程度越重，dna非整倍體出現(xiàn)率越高，不典型增生程度越重，癌變的發(fā)生率越高。n由此可見，癌前病變出現(xiàn)dna非整倍體對預(yù)測和診斷癌變是一個重要而有價值的標(biāo)志物， 對于形態(tài)學(xué)上診斷為癌前

6、病變的病例， 有必要進(jìn)行 dna 倍體的檢測， 對出現(xiàn)dna異倍體病人，應(yīng) 進(jìn)行密 切的隨訪， 及時發(fā)現(xiàn)早期癌 變征象，做到早診斷、早治療。 二、抑癌基因二、抑癌基因p53蛋白蛋白 n從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性疾病，是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突變或丟失)及其功能的調(diào)控失常而促發(fā)腫瘤，當(dāng)各種致癌因子參與下誘導(dǎo)癌基因和抑癌基因的異常改變，其效應(yīng)分子的基因蛋白產(chǎn)物的過量表達(dá)，它們相互之間在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上起著重要作用。n因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關(guān)系研究成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，已隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用，大量具有高度特異性識別腫瘤細(xì)胞內(nèi)外抗原的單克

7、降抗體出現(xiàn)，為腫瘤研究尋找到了很多新的標(biāo)志物。n癌基因和抑癌基因在人體組織的調(diào)整作用，是通過其效應(yīng)分子蛋白質(zhì)產(chǎn)物。近年來，由于生產(chǎn)出多種高度特異的癌基因蛋白產(chǎn)物的單克隆抗體，為探索癌基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤的生物學(xué)特性關(guān)系的研究辟出了新徑。 np53基因是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的17號染色體(17、13、1)其早在1979年就發(fā)現(xiàn)了p53基因。n當(dāng)時是在被惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是一個原癌基因(oncogene)，因此沒有引起研究者的重視，直到1989年，一些科學(xué)家的研究有了新發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為p53基因存在兩種類型：即野生型(wild type)和突變型(mutant

8、 type)，這兩種類型的p53基因在人體內(nèi)具有兩種不同的作用。n野生型p53可以阻止細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并可阻止受損傷細(xì)胞 dna無法修復(fù)的細(xì)胞dna復(fù)制過程，引起細(xì)胞凋亡 (apoptosis)或程序性細(xì)胞死亡(program cell death. pcd)。這一發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到野生型p53的一個重要功能是作用細(xì)胞增殖周期的一個調(diào)控點(diǎn)(check-point)。n野生型 p53 基因的丟失和突變，使 p53基因正常功能喪失，而成為突變型p53基因，科學(xué)家研究認(rèn)為， 突變型 p53 可導(dǎo)致細(xì)胞增殖功能的增強(qiáng)。突變后的p53不但失去了正常調(diào)控細(xì)胞增殖分化的功能，而且可變?yōu)橐粋€直接的腫瘤基因，

9、對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用。 n近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在人類大多數(shù)惡性腫瘤中均存在p53突變基因，而且不同的致癌物可引起不同的特異性突變譜。因此p53基因的突變已引起腫瘤研究者極大關(guān)注。n研究認(rèn)為，癌基因致癌作用是通過其效應(yīng)分子的癌基因蛋白來發(fā)揮其對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用的。因此，檢測癌基因蛋白 的表達(dá)量是一種極有效的研究方法。n研究證明，野生型p53基因蛋白具有極不穩(wěn)定的構(gòu)型，半衰期很短(約30分鐘)，因此，在正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)含量甚微，一般方法很難測量到。然而，突變后的p53基因，其蛋白發(fā)生了構(gòu)型上的改變，半衰期明顯延長，穩(wěn)定性增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)形成堆積，含量增高。n近年來許多學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)并結(jié)

10、合鼠抗人p53基因蛋白單克隆抗體，對多種人類腫瘤進(jìn)行了p53基因蛋白的定量檢測，均檢出異常p53蛋白的過量表達(dá)。morkve等應(yīng)用fcm首先對石蠟包埋支氣管肺癌細(xì)胞的p53蛋白進(jìn)行了定量檢測，并提出用熒光指數(shù)(fluoresence ind -ex fi)來表示p53蛋白表達(dá)量。n他們的研究發(fā)現(xiàn)， p53的表達(dá)量與肺癌細(xì)胞的分化程度相關(guān)，未分化型的小細(xì)胞肺癌p53的表達(dá)量和陽性表達(dá)均明顯高于分化型的肺癌的p53表達(dá)量，還發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞s期細(xì)胞百分比明顯高于p53表達(dá)陰性者。 n由此認(rèn)為，突變后的p53蛋白可能調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度加快，dna合成加速起重要作用。n齊鳳英等應(yīng)用f

11、cm分析了乳癌和乳腺良性病變細(xì)胞p53蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)良性病變伴有導(dǎo)管上皮異型增生細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)量增高。說明p53蛋白的過量表達(dá)在乳腺正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化一一癌變過程中起直接參與作用，揭示p53突變蛋白的表達(dá)將有可能作為癌變早期診斷的一個標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)p53蛋白的表達(dá)量與乳癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)， p53蛋白的高表達(dá)多在浸潤性乳癌，高度浸潤性生長分化差的乳癌p53表達(dá)強(qiáng)陽性。 n他們還研究了乳癌p53表達(dá)量與dna倍體和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)dna異倍體乳癌p53表達(dá)量明顯高于二倍體乳癌，p53表達(dá)量高的乳癌細(xì)胞增殖活性高于p53表達(dá)量低的乳癌。n研究結(jié)果表明，p53蛋白的表達(dá)量與乳癌的預(yù)后密切相

12、關(guān)，p53陽性表達(dá)的乳癌生存期短，p53陰性表達(dá)的乳癌生存期長，認(rèn)為檢測p53蛋白的表達(dá)量可作為乳癌一個實(shí)用的新的預(yù)后標(biāo)志物。n還有作者研究fcm檢測乳癌p53蛋白表達(dá)的單因素與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p53陽性表達(dá)的乳癌生存期短，且常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌p53表達(dá)陽性，既使淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，但p53表達(dá)陽性乳癌生存期亦短，證實(shí)p53突變，表達(dá)量增高可能是一個有別于其他預(yù)后因素而成為一個獨(dú)立的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。n還有一些作者研究了膀胱癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞的p53表達(dá)，也證實(shí)了p53與腫瘤病理分級相關(guān)，隨病理分級的增高而p53表達(dá)增強(qiáng)。p53的表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)、生存率亦有關(guān)，過量表達(dá)的腫瘤患者生存期短，易復(fù)發(fā)，預(yù)

13、后差。n應(yīng)用fcm檢測腫瘤p53基因蛋白的異常表達(dá)提供了客觀的量化參量，為判斷腫瘤的惡性度、預(yù)后以及指導(dǎo)臨床治療，提供新的腫瘤標(biāo)志物。np53基因失活性突變參與了一系列人類實(shí)體癌的早期發(fā)展，業(yè)已證明p53基因突變直接影響（3 階段)直腸腺瘤(包括結(jié)腸腺瘤)向直腸腺癌(包括結(jié)腸腺癌)的轉(zhuǎn)化。從臨床腫瘤學(xué)的觀點(diǎn)p53基因突變是處在癌變前的階段。但從癌癥發(fā)生的全過程來看，p53基因突變是處于癌癥發(fā)生與發(fā)展的中后階段(如圖 26)。 圖圖26 結(jié)直腸癌的多階段發(fā)生過程結(jié)直腸癌的多階段發(fā)生過程n至今癌癥的確診主要依靠細(xì)胞病理學(xué)，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)現(xiàn)p53 特征性突變將有可能使癌癥的研究從細(xì)胞水平

14、進(jìn)入分子水平，從能確診癌的細(xì)胞病理學(xué)進(jìn)入能分析基因特征結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)，流式細(xì)胞技術(shù)是能保持細(xì)胞和亞細(xì)胞成分的完整生活狀態(tài)下，進(jìn)行定量分子分析方法。并可為其他分析技術(shù)，提供富集制樣基礎(chǔ)，無疑地，它將為上述轉(zhuǎn)變提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。 三、癌基因蛋白產(chǎn)物三、癌基因蛋白產(chǎn)物 ras p21蛋白蛋白 n自八十年代發(fā)現(xiàn)ras原癌基因以來，腫瘤研究人員對其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤中存在ras癌基因的激活，認(rèn)為ras基因在腫瘤發(fā)生的生物機(jī)制中起著十分重要的作用，并發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的早期發(fā)生和預(yù)后有關(guān)，所以ras癌基因的激活和其蛋白p21的表達(dá)研究已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。n在眾

15、多的癌基因中，人們最關(guān)注、研究最深入的是ras原癌基因。在人類惡性腫瘤中，最常見的癌基因之一，ras基因的激活能啟動和加速細(xì)胞的生長、增殖以致引發(fā)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，ras原癌基因族(k-ras、n-ras、ha-ras)p21蛋白產(chǎn)物是一種共同表達(dá)的蛋白。 n研究證明，ras癌基因的激活與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，當(dāng)癌變發(fā)生時，ras癌基因首先激活，p21蛋白常出現(xiàn)過量表達(dá)，ras p21蛋白已被證明在各種人類腫瘤(乳腺癌、肺癌、胃癌)有過量表達(dá)。n有作者應(yīng)用fcm定量分析了膀胱早期癌p21蛋白的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)早期癌病變中的p21蛋白表達(dá)增高，認(rèn)為p21蛋白是腫瘤早期階段的標(biāo)志物，推測ras癌基因在腫瘤

16、早期就已激活，并隨著腫瘤的發(fā)展，進(jìn)一步參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。n還有作者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量研究胃癌前病變，口腔癌前病變的ras p21蛋臼的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ras p21蛋白的表達(dá)量與癌前病變不典型增生程度密切相關(guān)，說明ras癌基因的激活，在癌變過程中起重要作用，而隨不典型增生程度的加重，其表達(dá)量逐漸增高。認(rèn)為ras p21蛋白的表達(dá)量有希望成為癌變早期診斷的一個標(biāo)志物。n同時還發(fā)現(xiàn)p21蛋白的表達(dá)量與胃癌惡性程度無關(guān)，與口腔癌惡性分級有關(guān)，但大多數(shù)研究證明，ras p21表達(dá)是與腫瘤的dna倍體相關(guān)，dna異倍體的腫瘤p21表達(dá)量明顯高于dna二倍體的腫瘤，說明ras p21的表達(dá)量多少，明顯地

17、調(diào)控及影響著惡性細(xì)胞dna合成及其dna含量的異常改變。np21的表達(dá)與腫瘤的增殖分裂具有極好的相關(guān)的表達(dá)與腫瘤的增殖分裂具有極好的相關(guān)性性，表達(dá)陽性的腫瘤其表達(dá)陽性的腫瘤其s期百分率明顯高于表期百分率明顯高于表達(dá)陰性的腫瘤。說明達(dá)陰性的腫瘤。說明ras p21蛋白在腫瘤生長增蛋白在腫瘤生長增殖過程中起著重要調(diào)控作用殖過程中起著重要調(diào)控作用。 n大多定量研究ras p21表達(dá)量的報(bào)道證實(shí)p21蛋白的表達(dá)與腫瘤病人的預(yù)后密切相關(guān)，有作者在對膀胱癌的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p21蛋白表達(dá)量高(或表達(dá)陽性)復(fù)發(fā)率及死亡率明顯高于陰性表達(dá)者，且存活期短，說明p21的過量表達(dá)，預(yù)示腫瘤具有更惡性生物學(xué)行為，揭示腫

18、瘤易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。n有些作者認(rèn)為，p21表達(dá)量檢測，可以作為腫瘤復(fù)發(fā)的一個早期信號，如果結(jié)合病理分級、臨床分期和p21的定量分析，綜合性的判斷惡性腫瘤病人的預(yù)后，對評價預(yù)后無疑具有十分重要的意義。 癌基因癌基因c-erbb-2蛋白產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物n癌基因c-erbb-2位于17號染色體q21區(qū)帶上，編碼分子為185190k 。有作者研究認(rèn)為，c-erbb-2癌基因活化，其蛋白產(chǎn)物過量表達(dá)在癌癥的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。n近來有人發(fā)現(xiàn)c-erbb-2基因蛋白過量表達(dá)和乳腺癌的轉(zhuǎn)化機(jī)制有特殊關(guān)系，他們用nih/3t3細(xì)胞做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)c-erbb-2基因具有促發(fā)腫瘤的作用，c-erbb-2蛋白的過量

19、表達(dá)，使細(xì)胞增殖失去調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。 n目前研究最多是c-erbb-2癌基因蛋白與乳腺癌的關(guān)系，很多文獻(xiàn)報(bào)道了c-erbb-2在乳癌細(xì)胞中的過量表達(dá)與乳癌的組織分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及激素受體、細(xì)胞增殖周期和dna倍體以及和臨床預(yù)后關(guān)系。n有人應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的免疫熒光技術(shù)定量研究了乳腺癌、乳腺囊性增生和囊性增生癌變細(xì)胞的c-erbb-2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)囊性增生和囊增癌變細(xì)胞的c-erbb-2蛋白表達(dá)量逐漸增高，提示在囊性增生并癌變的過程中，c-erbb-2蛋白的過量表達(dá)是早期癌變的一個標(biāo)志物，可作為乳癌早期診斷的一個參考指標(biāo)。 n他們的研究還發(fā)現(xiàn)，c-erbb-2蛋白過量表達(dá)的乳癌，dna含量

20、常為異倍體，且增殖指數(shù)也增高。n說明c-erbb-2蛋白過量表達(dá)對加速細(xì)胞dna合成和細(xì)胞增殖有重要作用，大部分研究報(bào)道認(rèn)為，乳腺癌細(xì)胞中c-erbb-2蛋白的表達(dá)與如下參量有關(guān)： 與組織學(xué)分級有關(guān)，隨分級的增高，c-erbb-2呈現(xiàn)高表達(dá)。與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移有關(guān)。與dna倍體有關(guān)，二倍體腫瘤表達(dá)量低，異倍體腫瘤表達(dá)高。與雌激素受體有關(guān)，c-erbb-2蛋白過量表達(dá)的乳癌，受體常為陰性。而表達(dá)量低的乳癌，受體常為陽性。與臨床預(yù)后有關(guān)，c-erbb-2表達(dá)過量的乳癌，無病生存期和總存活期明顯縮短，常出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，而c-erbb-2蛋白表達(dá)量低，預(yù)后較好，認(rèn)為是一個重要的預(yù)后參數(shù)。 四、腫瘤轉(zhuǎn)移

21、基因四、腫瘤轉(zhuǎn)移基因cd44ncd44基因位于人類11號染色體的短臂上，可分為兩種類型，按其外顯子表達(dá)方式，可稱為組成型cd44s和變異型cd44v。n研究表明，正常情況下，cd44s基因蛋白是廣泛存在細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白，在大多數(shù)上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等均可以檢測到該糖蛋白的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，cd44基因蛋白的作用，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性連接，有如下功用: 介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管的小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。參與淋巴細(xì)胞的活化。能與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層連蛋白分子結(jié)合。參與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，使細(xì)胞偽足形成，參與細(xì)胞遷移運(yùn)動。n變異型cd44v基因與腫

22、瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，是近期人們最新的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，目前已成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的一個新的熱點(diǎn)課題。 n研究發(fā)現(xiàn)，正常組織中和沒有轉(zhuǎn)移能力的惡性細(xì)胞主要有 cd44s基因蛋白表達(dá)，而具有轉(zhuǎn)移能力的惡性細(xì)胞主要是變異型cd44v基因蛋白的高表達(dá)，但在正常上皮細(xì)胞中變異型cd44v僅有很弱的表達(dá)，確切證實(shí)變異型cd44v基因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，是在1991年德國學(xué)者gunth-er等首先報(bào)道了他們突破性研究結(jié)果。n他們從大鼠胰腺癌細(xì)胞中分離到了具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株和沒有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株，然后用具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞膜蛋白作為抗原，制備出了單抗腫瘤細(xì)胞與抗體結(jié)合，而不與沒有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞結(jié)合，經(jīng)過對這一單抗的序列分析后證

23、實(shí)為變異型cd44v基因蛋白。 n將變異型cd44v基因首先用于臨床腫瘤標(biāo)本的研究是英國學(xué)者matsumura和他的同事們，他們檢測了乳腺癌和結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移癌都有高水平的cd44v表達(dá)而從非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞僅能檢出很弱的表達(dá)。n最近有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和抗人cd44單克隆抗體，對種植于小鼠體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了研究分析，認(rèn)為cd44在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機(jī)制中具有重要作用。n我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了膀胱癌，乳腺癌細(xì)胞的變異型cd44v基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌均有強(qiáng)的表達(dá)量，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌僅有較弱的表達(dá)量。變異型cd44基因蛋白的表達(dá)和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究尚處于初步研究階段。 n有

24、許多未知有待更深入的探討，相信隨著cd44基因的研究進(jìn)一步深入將會為腫瘤的轉(zhuǎn)移和診斷提供新的標(biāo)志物。 五、血型糖蛋五、血型糖蛋白白a (glycopt1orin a. gpa) n人類體細(xì)胞突變的發(fā)生，及其在癌發(fā)生的生物分子機(jī)制中的作用研究，越來越引起腫瘤學(xué)者的極大關(guān)注。當(dāng)人體遭受到致癌因子的損害后，存在于骨髓中的紅系造血干細(xì)胞的血型糖蛋白a基因位點(diǎn)發(fā)生突變，并產(chǎn)生變異的子代紅細(xì)胞，這種改變可成為一種標(biāo)記而長期保留下來，而形成紅細(xì)胞變異株。變異株紅細(xì)胞表面所攜帶有g(shù)pa抗原(即 m/n血型決定簇)，這種變異的gpa抗原物質(zhì)是一種特異性的標(biāo)志物，它的一對等位基因位于染色體4q28-31 。 n目

25、前，已經(jīng)分離克隆出抗變異型紅細(xì)胞gpa的單克隆抗體，用熒光探針標(biāo)記這些抗體就可用流式細(xì)胞術(shù)檢測這些血液中紅細(xì)胞的gpa變異株的頻率，為研究人類活體細(xì)胞突變找到一個簡便的新方法。n有作者使用流式細(xì)胞術(shù)并結(jié)合抗gpa變異型單克隆抗體，對食管癌前病變患者紅細(xì)胞膜gpa的表達(dá)和變異株頻率進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)癌前病變患者的m/n血型的變異株gpa表達(dá)明顯高于正常人，說明gpa變異株的檢測頻率，對有癌變傾向的個體，可作為一個有重要意義的監(jiān)測標(biāo)志物。 n也有學(xué)者將fcm-gpa表達(dá)的檢測應(yīng)用于放射線損害和腫瘤化療藥物引起人類體細(xì)胞突變的檢測，發(fā)現(xiàn)在日本廣島原子彈爆炸后的幸存者中，其gpa變異紅細(xì)胞頻率與其爆炸時

26、(1945年)的受輻射劑量相關(guān)，至今已40多年后的幸存者，其骨髓紅系造血干細(xì)胞gpa位點(diǎn)上仍有突變點(diǎn)并仍可檢出變異的子代細(xì)胞。n這種這種fcm檢測紅細(xì)胞膜上檢測紅細(xì)胞膜上gpa變異株的方法變異株的方法，比其他比其他檢測體細(xì)胞突變的方法檢測體細(xì)胞突變的方法(dna修復(fù)試驗(yàn)修復(fù)試驗(yàn)，微核檢測微核檢測，染染色體畸變率檢測等色體畸變率檢測等，這些方法都需要在體外進(jìn)行細(xì)胞這些方法都需要在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)，需要幾天或幾周時間才可得出結(jié)果需要幾天或幾周時間才可得出結(jié)果)有很大優(yōu)點(diǎn)。有很大優(yōu)點(diǎn)。可直接從活體取少量全血可直接從活體取少量全血，在在1-2小時之內(nèi)就可檢出結(jié)小時之內(nèi)就可檢出結(jié)果，果，可應(yīng)用于大量

27、人群體細(xì)胞突變的研究可應(yīng)用于大量人群體細(xì)胞突變的研究，為腫瘤的為腫瘤的早期診斷和防治工作提供新的線索和依據(jù)。早期診斷和防治工作提供新的線索和依據(jù)。 六、腫瘤多藥抗藥性基因蛋白六、腫瘤多藥抗藥性基因蛋白的流式分析的流式分析 n多抗藥性(multidrug resistant，mdr)基因蛋白p糖白是近年來的腫瘤抗藥性的分子學(xué)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的抗藥性具有極復(fù)雜的分子生物機(jī)制，是影響腫瘤化療療效的主要障礙，腫瘤細(xì)胞一旦對一種化療藥物產(chǎn)生抗性，對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物也會產(chǎn)生抗藥現(xiàn)象(即為多抗藥性)。因此腫瘤多抗藥性的研究尤其引人重視。 n80年代中期已經(jīng)有人從mdr細(xì)胞株中分離出人類mdr基因，

28、其基因產(chǎn)物的編碼為p-糖蛋白，并將人類多抗藥基因轉(zhuǎn)染小鼠nih3t3細(xì)胞，得到了多抗藥性的細(xì)胞株，用抗p-糖蛋白的特異性單克隆抗體檢出了該細(xì)胞株有人類mdr基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了p-糖蛋白是產(chǎn)生多抗藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)。np-糖蛋白介導(dǎo)多抗藥基因，在人類分兩型，即mdr1型、mdr2型，均位于人的7號染色體上， mdr1型和mdr2型基因產(chǎn)物具有80%的同源性，但經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí)mdr2基因產(chǎn)物與多抗藥性無關(guān)，但mdr2的作用和生理功能有待進(jìn)一步探討。 nmdr1型是與腫瘤多抗藥性有關(guān)的重要基因之一，p-170kd糖蛋白是mdr1型基因表型的分子基礎(chǔ)，它具有atp依賴性主動轉(zhuǎn)運(yùn)泵的功能，可將藥物從細(xì)胞中泵出，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，p-糖蛋白是一種跨膜蛋白分子，主要分布在胞漿膜內(nèi)一側(cè)，僅有很少一部分分子在細(xì)胞膜表面。n近年來，已經(jīng)對p-糖蛋白與臨床腫瘤多抗藥性的關(guān)系進(jìn)行了大量的探索，并已克隆產(chǎn)生了抗p-糖蛋白的單克隆抗體，現(xiàn)在已有售出商品的單抗，由malvern等生產(chǎn)的抗p-170糖蛋白c219單抗、scheper等生產(chǎn)的jsb-1單抗、victor ling等生產(chǎn)的ab-1多克隆抗體，這些抗體的問世，大大推動了腫瘤多抗藥性的研究工作。 n最近幾年，又將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到測定腫瘤細(xì)胞多抗藥性