講座PPT 全國分子細胞生物學實驗技術(shù)培訓班

1、臨床科研設計和sci論文策略-rna干擾技術(shù)的應用 湖南省生物醫(yī)學信息專業(yè)委員會 長沙贏潤生物技術(shù)有限公司講座提綱一. 科研選題及設計：以sci為目標二. 臨床樣本在基因功能研究中的作用三. rna干擾技術(shù)在基因功能研究中的應用四. rna干擾技術(shù)在發(fā)表sci論文中的應用一. 科研選題及設計：以sci為目標vsci沒有捷徑，但是有小技巧和經(jīng)驗。v閱讀文獻是基礎，必不可少。v他山之石，可以攻玉。 參考前人的經(jīng)驗，獲得自己的idea。如何選題v部位前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某基因在肝癌組織中表達增高，并有很多機制。我們的借鑒：拜讀大作后，茅塞頓開。查文獻后，確定在乳腺癌中尚無人涉及，于是，sci處女作出爐：

2、某基因在乳腺癌組織中表達增高。注：全身器官那么多，你只要看文獻比較及時，比較多，不太晚，總能找到合適的方向。 v藥物 前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)辛伐他汀有某種作用，能夠治療某種臨床疾病，且對其原理進行了研究，找到了相關(guān)基因。 我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到了阿托伐他汀，于是sci處女作出爐：阿托伐他汀對某疾病的治療效果及其作用機制。 注：同一類的藥物有那么多種，您完全可以換一種藥物拿來做一下試試。 v機制 前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某基因具有抗氧化應激的作用。 我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到氧化應激在好多疾病的病理機制中都發(fā)揮作用，比如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等等，于是sci處女作出爐：某基因在糖尿病腎病中的作

3、用。 注：注意串聯(lián)聯(lián)想：基因 機制 臨床疾病 基因 v上下游基因 前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)a基因具有某種作用。 我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到a基因的上游或下游基因是b基因，是否也有這種作用？于是sci處女作出爐：b基因具有某種作用。 注：需要一定的知識基礎，但相對于機制來說簡單一點。 v家族基因或者相同作用的基因 前人的經(jīng)驗：發(fā)現(xiàn)某種藥物能夠?qū)nf-產(chǎn)生影響。 我們的借鑒：拜讀大作后，聯(lián)想到il-6以及crp都是炎癥因子，有可能這種藥物對il-6以及crp也有影響，于是sci處女作出爐：某種藥物對il-6以及crp的影響。注：有相同作用的基因有很多，注意聯(lián)想。 如何設計自己的課題v不要把實驗設計得

4、過廣。 只要在一點上面做得稍微有深度就行了。v不要用一個實驗來證明n個結(jié)論，而是要用n個實驗來證明一個結(jié)論-即使這幾個實驗都比較簡單。v做出深度，做出層次來。 二. 臨床樣本在基因功能研究中的作用v確定目的基因和臨床疾病之間的關(guān)系v確定目的microrna和臨床疾病之間的關(guān)系v通常是整個課題的起始收集臨床樣本rnadnaproteinmicrorna芯片基因芯片組織芯片rt-pcr或real-time pcrwestern-blot免疫組化基因表達差異確定目的基因參考文獻microrna研究二. 臨床樣本在基因功能研究中的作用v確定預研究的目的基因后，如何設計課題？基因功能研究的兩方面：a.

5、基因的過表達-基因表達上調(diào)；b. 基因的rna干擾-基因表達下調(diào)。兩者相輔相成，互為佐證。緊貼臨床疾病的基因治療這一目的。 三. rna干擾技術(shù)在基因功能研究中的應用3.1 靶位點的選擇 & shrna序列設計3.2 shrna表達載體構(gòu)建3.3 篩靶：確定最有效的shrna3.4 轉(zhuǎn)染或感染目的細胞，表達shrna3.5 檢測或驗證rna干擾效果3.6 rna干擾回復實驗3.7 動物模型實驗rna干擾實驗流程圖尋找靶位點，設計干擾序列確定靶基因參考文獻收集標本，比較基因表達差異參考文獻或文庫設計全新序列將shrna片段裝載至表達載體轉(zhuǎn)染或感染細胞，表達shrna普通質(zhì)粒載體病毒載體檢

6、測或驗證rna干擾效果外源篩靶 mrna水平 蛋白質(zhì)水平細胞表型水平動物模型預實驗：確定目的細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率包裝病毒體外法體內(nèi)法rna干擾回復實驗3.1 靶位點的選擇 & shrna序列設計非常重要的一步！事半功倍 or 事倍功半？現(xiàn)有免費軟件設計：成功率較低（30%左右）商業(yè)化軟件或shrna庫：成功率高（75%以上）yrbio shrna庫庫讓您的讓您的rnai實驗有一個良好的起點！實驗有一個良好的起點！真正做到事半功倍！真正做到事半功倍！包含trc、ambion等多個組織或機構(gòu)開發(fā)的shrna庫；針對人及小鼠數(shù)萬個基因，每個基因提供35條shrna；庫中shrna有效率高達75%

7、！大部分shrna干擾效率超過80%！推薦3.2 shrna表達載體構(gòu)建vtrc原裝進口shrna表達系統(tǒng)優(yōu)點：（1）原裝進口產(chǎn)品，本公司未做任何改動。（2）既可當作普通shrna真核表達載體使用，同時也是慢病毒包裝系統(tǒng)中的穿梭載體，可以用來包裝慢病毒。缺點：（1）載體上沒有熒光標記。（2）慢病毒的生物安全性，對實驗室條件要求較高。（3）載體拷貝數(shù)較低，測序比較困難。v贏潤shrna表達系統(tǒng)（1）shrna序列數(shù)據(jù)依然來自trc、ambion shrna數(shù)據(jù)庫，質(zhì)量有保證，靶位點成功率高。（2）您可以選擇構(gòu)建一條或者多條shrna，靈活度高。（3）多種啟動子，有熒光或無熒光，綠色熒光或紅色熒光

8、等可自由選擇，能夠更好地配合后續(xù)實驗。（4）載體既可作為普通shrna表達載體使用，亦可作為腺病毒或慢病毒包裝系統(tǒng)的穿梭載體使用，以進行腺病毒或慢病毒包裝。3.2 shrna表達載體構(gòu)建mirshrna表達載體3.3 篩靶：確定最有效的shrnav內(nèi)源篩靶、外源篩靶v什么情況下采用外源篩靶？（1）目的細胞暫時不易得到；（2）目的細胞轉(zhuǎn)染效率較低（小于60%）；（3）目的細胞需誘導才能表達靶基因；（4）目前尚無靶基因的抗體。3.3 篩靶：確定最有效的shrnav由于上述原因，研究者可以在非常容易轉(zhuǎn)染的的細胞株（即所謂工具細胞）中進行“rnai 有效靶點篩選”工作。v常用的工具細胞有hek293、

9、cho 、nih3t3等。v如果您的目的細胞很容易轉(zhuǎn)染，那么可以直接在你的目的細胞中進行sirna篩靶工作。3.4 轉(zhuǎn)染或感染目的細胞，表達shrnav通過預實驗確定目的細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率方法：實驗室現(xiàn)有轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染一熒光載體（例如pegfp-n1）至目的細胞中，通過觀察熒光，判斷目的細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。原理：影響細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的主要因素為：（1）細胞類型；（2）轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染條件；質(zhì)粒的影響因素很小。3.4 轉(zhuǎn)染或感染目的細胞，表達shrna如果目的細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低（小于60%）：腺病毒載體：高轉(zhuǎn)染效率、高表達效率、使用方便。約85%的基因治療臨床項目采用的均是病毒載體（其中將近一半

10、使用的是腺病毒載體）。腺病毒包裝體系adeasy系統(tǒng)：利用細菌重組；重組率較高，病毒滴度低。admax系統(tǒng)：cre/loxp，293細胞內(nèi)重組，同源重組率較低。 adeno-x系統(tǒng)：pi-sce、i-ceu酶切連接。 block-it adenoviral rnai expression system：invitrogen，gateway lr體外重組技術(shù)。重組效率高，快速簡單，篩選方便；對感受態(tài)要求較高；載體較貴。推薦慢病毒包裝體系v三質(zhì)粒系統(tǒng)v四質(zhì)粒系統(tǒng)慢病毒表達載體、gag/pol、rev、vsv-g慢病毒表達載體4.5 檢測或驗證rna干擾效果vmrna水平：rt-pcr、real-t

11、ime pcrv蛋白質(zhì)水平：western-blot、免疫熒光v細胞表型水平： hoechst 33258染色（細胞凋亡）； dapi（細胞凋亡）； tunel（細胞凋亡）； mtt（細胞增殖）； 流式細胞檢測（細胞周期與凋亡）； 細胞小室實驗（細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力）4.6 rna干擾回復實驗vrna干擾中的off-target既脫靶效應由于序列同源性（1115個核苷酸）而引起的非特異性干擾。解決方案：設計、篩選23個有效的shrna進行實驗。或者做rna干擾回復實驗。按照nature的標準，一個嚴格的rnai實驗要有6個對照：（1）轉(zhuǎn)染試劑對照（監(jiān)控轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件對結(jié)果的影響）；（2）nonse

12、nse sirna對照（監(jiān)控外源核酸本身對結(jié)果的影響）；（3）positive sirna對照（監(jiān)控假陰性）；（4）技術(shù)重復對照（也叫off-target對照，也就是利用至少2個靶點的sirna同時實驗，2個sirna互為off-target control，當兩者的表型相同時，才有可能是特異性的rnai效應）；（5）rescue對照（rnai之后做過表達，看是否有性狀的逆轉(zhuǎn)，這也是為了說明rnai的特異性）；（6）全表達組掃描對照（轉(zhuǎn)錄/表達芯片掃描，以最終確定表型不是由于off-target造成）。如何進行rna干擾回復實驗v細胞：目的細胞v質(zhì)?；虿《荆?shrna表達質(zhì)?；虿《?； 目的基

13、因過表達質(zhì)?；虿《緑方法：a. 先干擾靶基因，再過表達目的基因（wt）；b. 共轉(zhuǎn)染：shrna表達質(zhì)?；虿《灸康幕颍╩t）表達質(zhì)?；虿《就扑]3.7 動物模型實驗v體外法：先將質(zhì)粒或病毒導入目的細胞，再將目的細胞導入動物體內(nèi)。優(yōu)點：易操作缺點：不能完全模擬天然環(huán)境v體內(nèi)法：直接將質(zhì)粒或病毒導入動物體內(nèi)。優(yōu)點：環(huán)境更真實缺點：不易操作推薦四. rna干擾技術(shù)在發(fā)表sci論文中的應用v研究實例一：if 0.8v研究實例二：if 3v研究實例三：if 7.5v研究實例四：if 4.7 研究實例一研究實例一影響因子：影響因子：0.8分分methodsshrna細胞系mtt測細胞存活率western-

14、blot細胞小室實驗檢測侵襲轉(zhuǎn)移能力動物模型免疫組化統(tǒng)計學分析resultswestern-blot：細胞存活率：細胞小室實驗：動物模型：he染色：pcna：研究實例二研究實例二影響因子：影響因子：3分分methods細胞系動物干擾載體細胞處理動物模型動物處理rt-pcrwestern-blot免疫組化tunel測凋亡統(tǒng)計學分析results研究實例三研究實例三影響因子：影響因子：7.5分分methodsresults文章思路 eif2b中一個亞基（epsilon），在tmef細胞中特異性高表達，rnai之后能夠影響eif2b的活性，影響蛋白合成，并降低細胞增殖能力（細胞生長曲線和克隆形成），

15、裸鼠成瘤實驗獲得一致結(jié)果。 隨后，在mcf-7中用sirna抑制eif2b，可以抑制腫瘤細胞增殖。 最后，在293細胞中將其過表達，發(fā)現(xiàn)細胞蛋白合成能力和增殖能力增強。 這篇文章優(yōu)勢在于首先在模型細胞上發(fā)現(xiàn)基因功能，然后在腫瘤細胞上進行應用，并且進行了rna干擾回復實驗，表達抑制一正一反，互相佐證，以充分說明問題。研究實例四研究實例四影響因子：影響因子：4.7分分文章思路1. 在h1299細胞中驗證livin shrna的干擾效率： mrna水平、蛋白質(zhì)水平、細胞表型水平2. 在目的細胞hela細胞中進一步驗證livin shrna的干擾效率： mrna水平、蛋白質(zhì)水平、細胞表型水平3. 研究

16、發(fā)現(xiàn)，抑制livin-可以誘導hela細胞凋亡，還可以增強其對其它腫瘤治療方式的敏感性。4. 對3中的相關(guān)機制進行了探討：caspase-3、parp。5. rna干擾回復實驗。6. 為什么干擾livin-和干擾livin-對hela細胞影響大不相同？對其機制進行了研究（酵母雙雜交實驗：smac）。methods細胞系干擾質(zhì)?；蜻^表達質(zhì)粒methodsrt-pcrwestern-blottunel雙雜交results總結(jié)及展望總結(jié)及展望1. 基因過表達和rna干擾是研究基因功能的兩個方面，相輔相成，互為佐證。2. 各種新技術(shù)的運用，各種資源的共享，將會使基因研究越來越簡單，相關(guān)實驗進行的越來越順利。3. 技術(shù)手段相差不大，關(guān)鍵是文章思路。4. 充分利用臨床搜集的標本，能夠為文章加分。5. microrna成為rna干擾、疾病診斷方面的熱門研究領(lǐng)域。 贏