分子生物學(xué)研究法基因功能研究技術(shù)

1、第六章 分子生物學(xué)研究法（下）基因功能研究技術(shù)隨著越來越多的基因組序列相繼被測定，人類對生物本質(zhì)的認(rèn)識已經(jīng)發(fā)生了重大變化。但是，海量序列信息也向我們提出了新的挑戰(zhàn)。如何開發(fā)利用這些序列信息，如何通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究基因的功能，從而進(jìn)一步了解生物體內(nèi)各種生理過程，了解生物體生長發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，了解疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，給出控制、減緩甚至完全消除人類遺傳疾病，是新時(shí)期生物學(xué)家所面臨的主要問題。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、原位雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)為研究單個(gè)或多個(gè)基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式提供了強(qiáng)有力的手段。用基因定點(diǎn)突變（site-directed mutagene

2、sis）技術(shù)、基因敲除技術(shù)、rnai技術(shù)可以全部或部分抑制基因的表達(dá)，通過觀察靶基因缺失后生物體的表型變化研究基因功能。酵母單雜交、雙雜交技術(shù)，四分體技術(shù)等都是研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-dna相互作用等的重要手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者可以在活細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，為認(rèn)識信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術(shù)支持。本章將主要介紹研究基因功能的各種分子生物學(xué)技術(shù)和方法。6. 1 基因表達(dá)研究技術(shù)6. 1. 1轉(zhuǎn)錄組測序6.1.1 轉(zhuǎn)錄組分析和rna-seq轉(zhuǎn)錄組（transcriptome），廣義上指在某一特定生理?xiàng)l件或環(huán)境下，一個(gè)細(xì)胞、組織或者生物體

3、中所有rna的總和，包括信使rna（mrna）、核糖體rna（rrna）、轉(zhuǎn)運(yùn)rna（trna）及非編碼rna（non-coding rna或srna）；狹義上特指細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有mrna的總和?；蚪M轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組（genometranscriptomeproteome）是中心法則在組學(xué)框架下的主要表現(xiàn)形式。通過特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的mrna豐度來描述基因表達(dá)水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度是目前基因表達(dá)研究的基本思路。轉(zhuǎn)錄組研究的基本方法包括基因芯片技術(shù)（gene chip）和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。我們將在6.4節(jié)詳細(xì)敘述基因芯片技術(shù)，這里主要討論轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的原理和應(yīng)用。基于傳統(tǒng)的san

4、ger測序法對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究的方法主要包括：表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，est）測序技術(shù)，基因表達(dá)系列分析技術(shù)（serial analysis of expression，sage）。est測序數(shù)據(jù)是目前數(shù)量最多，涉及物種最廣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但測序讀長較短（每個(gè)轉(zhuǎn)錄本測定400 bp500 bp），測序通量小，測序成本較高，而且無法通過測序同時(shí)得到基因表達(dá)豐度的信息。有人使用sage測序法，將不同轉(zhuǎn)錄本3端第一個(gè)catg位點(diǎn)下游14 bp長的短標(biāo)簽序列來標(biāo)識相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。由于標(biāo)簽序列較短，可以將多個(gè)標(biāo)簽串聯(lián)測序，使sage法相對于est測序在通量上大大提高。但過短

5、的序列標(biāo)簽使得序列唯一性降低，即使改進(jìn)過的longsage用21 bp標(biāo)簽測序，仍然有約一半的標(biāo)簽無法被準(zhǔn)確注釋到基因組上。高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing），又名二代測序（second-generation sequencing）或深度測序（deep sequencing），可以一次性測序幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命。主要有roche公司研發(fā)的454測序平臺(tái)和illumina公司的solexa測序平臺(tái)（表6-1）。表 6-1 454和illumina高通量測序平臺(tái)比較454illumina讀取長度（bp）約70050150單次測序數(shù)據(jù)量

6、700 mb600 gb測序周期23小時(shí)714天測序成本較高低雖然都是基于“邊合成邊測序（sequencing by synthesis，sbs）”，但是454和illumina的實(shí)現(xiàn)方法有很大的不同。454系統(tǒng)采用焦磷酸測序（pyrosequencing）原理，如圖6-1a所示，在dna 聚合酶的作用下，按照t、a、c、g順序加入的單個(gè)dntp與模板的下一個(gè)堿基配對，同時(shí)釋放一個(gè)分子的焦磷酸(ppi)，在atp硫酸化酶的作用下，ppi和腺苷酰硫酸（adenosine-5-phosphosulfate,aps）結(jié)合形成atp，在螢光素酶的催化下，atp和螢光素結(jié)合形成氧化螢光素，產(chǎn)生可見光，被

7、ccd捕捉。而illumina系統(tǒng)（圖6-1b）采用帶有螢光標(biāo)記的dntp，其3羥基末端帶有可被化學(xué)切割的部分，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)只允許摻入一個(gè)堿基，由激光掃描反應(yīng)板表面，讀出這一輪反應(yīng)新加的螢光信號，從而判定堿基種類。之后，經(jīng)過化學(xué)切割恢復(fù)3端粘性，進(jìn)行下一輪聚合反應(yīng)。從上述描述中不難看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，已有螢光信號會(huì)使新的熒光難以準(zhǔn)確分辨，因此該方法的測序讀長較短，測序錯(cuò)誤主要是堿基替換。而454則由于缺少終止反應(yīng)的元件，相同堿基的連續(xù)摻入常會(huì)帶來“插入缺失”類型的測序錯(cuò)誤。利用高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，對測序得到的大量原始讀長（reads）進(jìn)行過濾、組裝及生物信息學(xué)分析的過程被稱為

8、rna-seq。對于有參考基因組序列的物種，需要根據(jù)參考序列進(jìn)行組裝（reference assembly），對于沒有參考序列的，需要進(jìn)行從頭組裝（de novo assembly），利用大量讀長之間重疊覆蓋和成對讀長（pair-end reads）的相對位置關(guān)系，組裝得到盡可能完整的轉(zhuǎn)錄本，并以單位長度轉(zhuǎn)錄本上覆蓋的讀長數(shù)目（reads per kilo-base gene per million bases，rpkm）作為衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)（圖6-2）。在實(shí)際組裝過程中，圖中紅色標(biāo)示區(qū)域覆蓋度過低，且讀長缺乏相對位置信息的區(qū)域，其可信度較低，應(yīng)當(dāng)剔除，保留兩側(cè)序列?，F(xiàn)以棉花轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)

9、為例，簡單分析不同組織或纖維不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)情況（表6-2）。illumina平臺(tái)測序得到26.86gb數(shù)據(jù)，經(jīng)過從頭組裝總共獲得了42,773條非重復(fù)序列，平均長度1,054堿基。每個(gè)不同組織中分別有23,265至26,427個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不但能用來分析不同組織中獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，還被用于分析特定轉(zhuǎn)錄本在某個(gè)組織中的表達(dá)強(qiáng)度（表6-3）。rna-seq還可以用于轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄本snp檢測、非編碼區(qū)功能鑒定以及挖掘低豐度轉(zhuǎn)錄本等研究。表6-2 陸地棉6個(gè)組織的rna-seq數(shù)據(jù)分析 組織樣品讀長數(shù)堿基數(shù)q201(%)n50獨(dú)立基因總數(shù)獨(dú)立基因長度(nt)開花后0天胚珠479072

10、98359304735098.2282726427778開花后5天胚珠53022210397666575097.8684223520786花48049786360373395097.9982323265775葉54191238406434285097.5182025280776根79438254714944286091.6878623905753莖49713024447417216091.4678224088746總計(jì)3323218102686140492013064277310541q20，測序準(zhǔn)確率達(dá)到99。表6-3棉花組織特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)強(qiáng)度分析序列標(biāo)識基因rpkm序列標(biāo)識基因rpkm

11、根莖根莖unigene58528myb-l81.860.16unigene85367far10.40 65.51 unigene58563b356.020.00unigene29146hd-zip0.00 44.49 unigene58582b353.660.29unigene51008hb0.24 43.60 unigene58458dof45.540.00unigene18073mikc0.13 36.74 unigene55872dof41.560.00unigene64521myb0.15 31.71 unigene51911bhlh36.640.19unigene58698b30.0

12、9 24.01 unigene58446nac28.400.37unigene62109myb0.04 18.45 unigene57837bhlh20.270.00unigene52681bzip0.20 17.62 unigene58640s1fa-l20.250.68unigene64531g2-l0.34 16.92 unigene55579b315.710.13unigene64486bhlh0.00 14.49 轉(zhuǎn)錄組組裝過程中，同一個(gè)非重復(fù)序列上復(fù)蓋有來自根、莖等不同組織的讀長，不同讀長數(shù)目通過歸一化轉(zhuǎn)變?yōu)閞pkm值，進(jìn)而篩選得到組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。6. 1. 2 rna的選

13、擇性剪接技術(shù)rna的選擇性剪接是指用不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）從一個(gè)mrna前體產(chǎn)生不同的mrna剪接異構(gòu)體的過程。一般將選擇性剪切分為如下幾類：平衡剪切、5選擇性剪切、3選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切（圖6-3）。一般用rt-pcr的方法研究一個(gè)基因是否存在選擇性剪切。首先以cdna兩端特異引物或來自不同外顯子的引物序列在不同組織來源的rna樣品中進(jìn)行擴(kuò)增，觀察pcr產(chǎn)物大小是否存在差異。一旦發(fā)現(xiàn)差異，即可通過序列分析來判斷這種差異是否來自于選擇性剪切。圖6-4為擬南芥中發(fā)現(xiàn)的有選擇性剪切的5個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的物理圖譜。選擇性剪接使一個(gè)基因翻譯為多種蛋白質(zhì)序列，

14、是基因表達(dá)多樣性的重要表現(xiàn)形式。分析人類基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，有60%的基因在表達(dá)過程中可通過選擇性剪切產(chǎn)生各種形式的mrna。最新的研究表明，果蠅的dscam基因最多可能夠產(chǎn)生38，016種不同形式的剪切體（圖6-5）。由于選擇性剪切與細(xì)胞生理、發(fā)育調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系，闡明基因的選擇性剪切機(jī)制是了解動(dòng)植物個(gè)體發(fā)育和基因功能的重要環(huán)節(jié)。因此，發(fā)現(xiàn)新的可變剪切異構(gòu)體，確定每個(gè)異構(gòu)體的獨(dú)特功能和生物學(xué)意義并闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制，是功能基因組時(shí)代的一個(gè)重要特征。6. 1. 3 原位雜交技術(shù)原位雜交( in situ hybridization，ish) 是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射

15、檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段，通常分為rna原位雜交和染色體原位雜交兩大類。rna原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mrna分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈rna，就可通過檢測放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出定性定量分析（圖6-6）。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，fish）技術(shù)首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或dna上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克

16、隆抗體來確定該dna序列在染色體上的位置（圖6-7）。fish技術(shù)不需要放射性同位素，實(shí)驗(yàn)周期短，檢測靈敏度高，若用經(jīng)過不同修飾的核苷酸分子標(biāo)記不同的dna探針，還可能在同一張切片上觀察幾種dna探針的定位，得到相應(yīng)位置和排列順序的綜合信息。6. 1. 4 基因定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）技術(shù)定點(diǎn)突變是重組dna進(jìn)化的基礎(chǔ)，該方法通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個(gè)（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造dna調(diào)控元件特征序列，修飾表達(dá)載體，引入新的酶切位點(diǎn)等。由于迄今尚未建立能精確預(yù)測特定

17、氨基酸殘基變化對整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)及活性影響的模型，選擇氨基酸突變的位點(diǎn)存在一定的盲目性。因?yàn)榧词怪懒嗽摰鞍椎娜S結(jié)構(gòu)，人們?nèi)匀粺o法了解某個(gè)氨基酸殘基對其高級結(jié)構(gòu)的影響。少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的改變，有時(shí)根本不影響靶蛋白的功能，有時(shí)影響了靶蛋白的活性位點(diǎn)，有時(shí)還能從根本上改變整個(gè)蛋白的高級結(jié)構(gòu)。所以，基因的定點(diǎn)突變是我們進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要手段。最早在20世紀(jì)70年代初進(jìn)行小噬菌體x174單鏈基因組易突變位點(diǎn)圖譜分析工作時(shí)認(rèn)識到基因定點(diǎn)突變的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、獲得高品質(zhì)dna聚合酶和dna連接酶的基礎(chǔ)上，科學(xué)家建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的dna突變技術(shù)（圖6-8）。pcr

18、技術(shù)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了定點(diǎn)突變技術(shù)的發(fā)展，簡化了實(shí)驗(yàn)操作程序，提高了突變效率?？茖W(xué)家主要采用兩種pcr方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。圖6-9闡述了重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制。首先將模板dna分別與引物對1（正向誘變引物fm和反向引物r2）和2（正向引物f2和反向誘變引物rm）退火，通過pcr1和2反應(yīng)擴(kuò)增出兩種靶基因片段。fmr2和rmf2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用dna聚合酶補(bǔ)平缺口，形成全長雙鏈dna，進(jìn)行pcr3擴(kuò)增。最后，用引物f2和r2擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的全長dna片段（pcr4）。大引物誘變法首先用正向突變引物（m）和反向引物（r1），擴(kuò)增模板dna產(chǎn)生雙

19、鏈大引物（pcr1），與野生型dna分子混合后退火并使之復(fù)性，第二輪pcr中加入正向引物（f2），與pcr1中產(chǎn)生的一條互補(bǔ)鏈配對，擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈dna（圖6-10）。由于f2的退火溫度顯著高于第一輪pcr所使用的引物m和r1，因此，可以忽略引物m和r1在本輪反應(yīng)中所造成的干擾。獲得定點(diǎn)突變pcr產(chǎn)物以后，一般需進(jìn)行dna序列分析以驗(yàn)證突變位點(diǎn)。與經(jīng)典定點(diǎn)突變方法相比，pcr介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法具有明顯的優(yōu)勢：1、突變體回收率高，以至于有時(shí)不需要進(jìn)行突變體篩選；2、能用雙鏈dna作為模板，可以在任何位點(diǎn)引入突變；3、可在同一試管中完成所有反應(yīng)；4、快速簡便，無需在噬菌體m13載體上進(jìn)行分

20、子克隆。所以，pcr介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法已成為定點(diǎn)突變的主要技術(shù)。6. 2 基因敲除技術(shù)6. 2. 1 基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（forward genetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列。在后基因組時(shí)代，大規(guī)?；蚬δ艿难芯空蔀樯茖W(xué)研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)代遺傳學(xué)（reverse genetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸╣ene knock-out）又稱基因打靶，該技術(shù)通過外源dna與染色體dna之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體dna可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。1985

21、年，科學(xué)家利用同源重組將一段外源質(zhì)粒p117插入到人類染色體dna -珠蛋白位點(diǎn)，首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶并獲得成功。目前，在胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組已經(jīng)成為遺傳修飾基因組位點(diǎn)的常規(guī)技術(shù)。通過對這些基因敲除生物個(gè)體的表型分析，鑒定或推測該基因的生物學(xué)功能?；蚯贸譃橥耆蚯贸蜅l件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性，條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。噬菌體的cre/loxp系統(tǒng)、gin/gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的flp/frt系統(tǒng)和r/rs系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以cre

22、/loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。1完全基因敲除實(shí)驗(yàn)中一般采用取代型或插入型載體（圖6-11）在es細(xì)胞中根據(jù)正-負(fù)雙向選擇（positive-negative selection, pns）原理（圖6-12）進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)。正向選擇基因neo通常被插入載體靶dna功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo基因有雙重作用，一方面形成靶位點(diǎn)的插入突變，同時(shí)可作為正向篩選標(biāo)記。負(fù)向選擇基因hsv-tk（human semian virus-thymidine kinase）則被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細(xì)胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。如果細(xì)胞中發(fā)生了隨機(jī)重組，負(fù)向選擇基因

23、就可能被整合到基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率約為10-210-5，植物的概率為10-410-5，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞，必須用pcr及southern雜交等多種分子篩選技術(shù)驗(yàn)證確實(shí)獲得了目的基因被敲除的細(xì)胞系。2條件型基因敲除對于許多有重要生理功能的基因來說，完全基因敲除往往導(dǎo)致胚胎死亡，有關(guān)該基因功能的研究便無法開展。而條件型基因敲除，特別是應(yīng)用cre/loxp和flp/frt系統(tǒng)所開展的組織特異性敲除，由于其可調(diào)節(jié)性而受到科學(xué)家的重視。構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體時(shí)，常將正向選擇標(biāo)記ne

24、or置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入方向相同的loxp位點(diǎn)（圖6-13）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中需要消除靶基因活性時(shí)，與帶有cre重組酶基因的es細(xì)胞雜交，cre重組酶就能把兩個(gè)loxp位點(diǎn)中間的dna片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。標(biāo)記基因兩側(cè)也常常帶有l(wèi)oxp序列，因?yàn)樵S多時(shí)候即使標(biāo)記基因位于內(nèi)含子中也會(huì)阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶es細(xì)胞，通過loxp位點(diǎn)重組將neo抗性基因刪除。以cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，可以在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定基因進(jìn)行遺傳修飾。利用控制cre表達(dá)的啟動(dòng)子活性或所表達(dá)的cre酶活性具有可誘導(dǎo)性

25、的特征，人們常常通過設(shè)定誘導(dǎo)時(shí)間的方法對動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。6. 2. 2 高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)胚胎干細(xì)胞（es細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組dna導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源dna與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的dna序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)，主要實(shí)驗(yàn)流程及篩選步驟如圖6-14所示。利用neo基因替換目的基因外顯子iv至外顯子vi區(qū)段，得到腸堿性磷酸酶（intestinal alkalin

26、e phosphatase，iap）基因敲除的es細(xì)胞，用顯微注射或電穿孔法將iap基因敲除的es細(xì)胞注入早期胚胎的囊胚腔中，誘導(dǎo)胚胎分化，獲得嵌合體胚胎后與野生型純合體胚胎回交，獲得由es細(xì)胞分化產(chǎn)生的iap基因敲除小鼠，實(shí)驗(yàn)證明，純合小鼠體內(nèi)檢測不到iap蛋白，而該基因的敲除導(dǎo)致小鼠變胖（圖6-15）。在條件型基因敲除實(shí)驗(yàn)中，首先構(gòu)建帶有s6基因的loxp打靶載體的es細(xì)胞，經(jīng)過雜交篩選，獲得純合體小鼠；再與帶有肝組織特異性、受inf-誘導(dǎo)的mx-cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，刪除neo和外顯子3-5，得到肝組織特異性敲除s6基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，3h胸腺嘧啶不能摻入s6基因敲除小鼠肝組織，細(xì)胞不能進(jìn)入

27、s期，不能正常分裂增殖（圖6-16）。一般來說，動(dòng)物基因敲除時(shí)用顯微注射胚胎干細(xì)胞命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，但操作相對簡單易行。因?yàn)橥粗亟M常常發(fā)生在某一條染色體上,要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代以上的遺傳。除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機(jī)插入突變破壞靶基因表達(dá)（圖6-17）。基因捕獲載體包括一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因（通常為neor基因），當(dāng)該基因插入到es細(xì)胞染色體某個(gè)部位，利用所在位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件得到表達(dá)時(shí)，該es細(xì)胞就獲得在含g418的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力?？赏ㄟ^分析標(biāo)記基因側(cè)翼cdna或染色體dna序列來獲得靶基因的相

28、關(guān)信息。由于受整合位點(diǎn)附近染色質(zhì)區(qū)的影響，轉(zhuǎn)基因整合具有顯著的位置效應(yīng)，基因5端啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)，3端終止子區(qū)都會(huì)對轉(zhuǎn)基因的整合產(chǎn)生影響，這是某些打靶載體選擇組織特異性啟動(dòng)子的原因之一。外源轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)有時(shí)還取決于其是否有內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可影響mrna的剪切以及啟動(dòng)子與內(nèi)含子間的相互作用。另外，內(nèi)含子可能含有能開放染色體功能域的序列，還可能通過影響核質(zhì)成分、位置等來影響基因表達(dá)強(qiáng)度。除了研究基因功能之外，基因敲除技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為遺傳病的治療、為生物新品種的培育奠定新基礎(chǔ)。6. 2. 3 植物基因敲除技術(shù)由于動(dòng)

29、植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著不相同，植物細(xì)胞基因敲除常采用不同于動(dòng)物細(xì)胞的策略。t-dna插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。t-dna插入失活就是利用根瘤農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將一段帶有報(bào)告基因的dna序列標(biāo)簽整合到基因組dna上，如果這段dna插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。由于該基因內(nèi)部或附近插入了一段已知序列的dna，可據(jù)此設(shè)計(jì)引物，用pcr方法將被破壞的靶基因序列分離出來（圖6-18a）。若將靶基因（假定編碼區(qū)為900個(gè)堿基對）兩端的引物lp、rp及插入載體上的引物lb加入同一反應(yīng)體系中進(jìn)行pcr，理論上能得到三種類型的條帶（圖6-18

30、b）。野生型植株中，只有l(wèi)p和rp引物配對擴(kuò)增出來的靶基因條帶；如果實(shí)驗(yàn)材料來自純合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以與lb引物配對完成pcr擴(kuò)增；如果實(shí)驗(yàn)材料來自雜合型基因敲除植株，那么，pcr擴(kuò)增后會(huì)同時(shí)出現(xiàn)兩種條帶。t-dna無專一整合位點(diǎn)，在植物基因組中發(fā)生隨機(jī)整合，所以，只要突變株的數(shù)目足夠大，從理論上就可能獲得任何一個(gè)功能基因都發(fā)生突變的基因敲除植物庫。擬南芥基因組冗余序列少，基因密度高，幾乎每一個(gè)dna插入都會(huì)導(dǎo)致某個(gè)基因功能的喪失，結(jié)合已完成的擬南芥基因組信息，人們很容易篩選到新的功能基因。已經(jīng)用t-dna插入失活方法建立了擬南芥大規(guī)模基因敲除突變體庫，研究人員可以

31、方便地在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索到感興趣基因的突變體，再開展深入的表型分析和功能研究。6. 3 蛋白質(zhì)及rna相互作用技術(shù)6. 3. 1 酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)（yeast one-hybrid system）是上個(gè)世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定結(jié)合于dna上的蛋白質(zhì)，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中dna-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選dna文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。酵母單雜交的基本原理如圖6-19所示，首先將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子（minimal promoter，pmi

32、n）的上游，把報(bào)告基因連接到pmin下游。然后，將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cdna與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription activation domain, ad）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。目前，酵母單雜交體系主要被用于確定某個(gè)dna分子與某個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用，用于分離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他dna位點(diǎn)的功能蛋白編碼基因，驗(yàn)證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。由于該方法的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細(xì)胞中含量極低且用生化手段難以純化的那部

33、分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。常用的酵母單雜交體系基本選用his3或lacz作為報(bào)告基因，雖然有的體系將帶有報(bào)告基因的載體直接整合于酵母染色體上，在大部分的實(shí)驗(yàn)中報(bào)告基因都位于質(zhì)粒dna上。圖6-20是利用酵母單雜交體系和已知的順式作用元件dre從擬南芥cdna文庫中篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基本流程。實(shí)驗(yàn)中如果將不同的未知基因與酵母gal4的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合，通過檢測位于gal4順式作用元件下游的報(bào)告基因的表達(dá)狀況，還可以鑒定出該轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能。6. 3. 2 酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）該體系巧妙地利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征

34、，因?yàn)檫@些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，bd）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域ad是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨(dú)的bd能與特定基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的bd和ad所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。實(shí)驗(yàn)中，首先運(yùn)用基因重組技術(shù)把編碼已知蛋白的dna序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（常為gal1、gal4或gcn1）dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)（bd）的表達(dá)載體上。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中使之表達(dá)帶有dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，與報(bào)告基因上游的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為“誘餌”捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。此時(shí)，

35、若將已知的編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ad）的dna分別與待篩選的cdna文庫中不同插入片段相連接，獲得“獵物”載體，轉(zhuǎn)化含有“誘餌”的酵母細(xì)胞。一旦酵母細(xì)胞中表達(dá)的“誘餌”蛋白與“獵物”載體中表達(dá)的某個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的ad和bd結(jié)構(gòu)域就會(huì)被牽引靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。分離有報(bào)告基因活性的酵母細(xì)胞，得到所需要的“獵物”載體，就能得到與已知蛋白相互作用的新基因（圖6-21）。6. 3. 3 蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)1、等離子表面共振技術(shù)該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，將葡聚糖層固定于納米級厚度的金屬膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合

36、將使金屬膜表面的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用（圖6-22）。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)是需要專門的等離子表面共振檢測儀器。圖6-23應(yīng)用spr技術(shù)研究coi1蛋白與jaz1蛋白之間的相互作用。研究人員首先在葡聚糖芯片表面固定1000共振單位的茉莉酸（ja）信號通路負(fù)調(diào)控因子jaz1蛋白，當(dāng)體系中同時(shí)有茉莉酸異亮氨酸（ja-ile）及coi蛋白存在時(shí)，可以檢測到最高達(dá)380共振單位的spr反應(yīng)信號。加入一種在結(jié)構(gòu)和功能上與茉莉酸甲脂（meja）非常相似的名為冠毒素(cor)的細(xì)菌

37、毒素，也能使coi1和jaz1發(fā)生相互作用。2、免疫共沉淀技術(shù)(co-immuno precipitation，coip)該技術(shù)的核心是通過抗體來特異性識別候選蛋白。首先，將靶蛋白的抗體通過親和反應(yīng)連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。如果靶蛋白質(zhì)與待篩選蛋白發(fā)生了相互作用，那么，這個(gè)待篩選蛋白質(zhì)就通過靶蛋白與抗體和固體基質(zhì)相互作用而被分離出來（圖6-24）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中常用pgadt7和pgbkt7質(zhì)粒載體分別以融合蛋白形式表達(dá)靶蛋白，體外轉(zhuǎn)錄、翻譯后將產(chǎn)物混合

38、溫育，分別用myc或ha抗體沉淀混合物，過柱后再用sdspage電泳分離，檢測兩個(gè)靶蛋白之間是否存在相互作用（圖6-25）。實(shí)驗(yàn)表明，棉花乙烯合成酶基因acs2與鈣離子依賴性蛋白激酶cdpk1之間存在相互作用，而該蛋白與cdpk32及crk5沒有發(fā)生相互作用。aco1與這三個(gè)蛋白都沒有發(fā)生相互作用（圖6-26）。3、gst及gad融合蛋白沉降技術(shù)該技術(shù)利用gst對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白（圖6-27）。gst沉降試驗(yàn)通常有兩種應(yīng)用：確定探針蛋白與未知蛋白間的相互作用，確證探針蛋白與某個(gè)已知蛋白之間的相互作用。與此相類似，實(shí)驗(yàn)中把gad與pif3的

39、不同區(qū)段相連接成為釣餌，研究該重組蛋白在體外與光敏素b (phyb)、其缺失n-37位氨基酸的突變體或光敏素a (phya) 的相互作用情況。研究發(fā)現(xiàn)，光敏素b (phy b)能與pif3發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用（超過30的光敏素b能被pif3沉淀下來），但缺失n-37位氨基酸的phy b突變體以及光敏素a (phy a)只能與pif3發(fā)生較弱的相互作用，約5的光敏素a，或約10的n-37位氨基酸缺失突變光敏素b能被沉淀下來（圖6-28）。4、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fret）fret現(xiàn)象是21世紀(jì)初葉發(fā)現(xiàn)的。fret熒光能量給體與受體之間通過偶極偶極耦合作用以非輻射方式轉(zhuǎn)移能量

40、的過程又稱為長距離能量轉(zhuǎn)移，有三個(gè)基本條件：（1）給體與受體在合適的距離（110 nm）；（2）給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；（3）給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。fret需要有兩個(gè)探針，即熒光給體和熒光受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有部分重疊，而與受體的發(fā)射光譜盡量沒有重疊。常用的探針有三種：熒光蛋白，傳統(tǒng)有機(jī)染料和鑭系染料。熒光蛋白是一類能發(fā)射熒光的天然蛋白或突變體，常見的有綠色熒光蛋白（gfp）、藍(lán)色熒光蛋白（bfp）、青色熒光蛋白（cfp）和黃色熒光蛋白（yfp）等。不同蛋白的吸收和發(fā)射波長不同，可根據(jù)需

41、要組成不同的探針對。傳統(tǒng)有機(jī)染料是指一些具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機(jī)化合物組成的染料對。常見的有熒光素、羅丹明類化合物和青色染料cy3、cy5等，該類染料分子體積較小，種類較多且大部分為商品化的分子探針染料，因此被廣泛應(yīng)用。鑭系染料一般與有機(jī)染料聯(lián)合使用，分別作為fret的給體或受體，檢測的準(zhǔn)確性和信噪比較之傳統(tǒng)染料有提高。研究蛋白質(zhì)間相互作用時(shí)，fret一般與熒光成像技術(shù)聯(lián)用，將蛋白標(biāo)記上熒光探針，當(dāng)?shù)鞍组g不發(fā)生相互作用時(shí)，其相對距離較大，無fret現(xiàn)象，而蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，其相對距離縮小，有fret現(xiàn)象發(fā)生（圖6-29），可根據(jù)成像照片的色彩變化直觀地記錄該過程。6. 3. 4 染色質(zhì)免

42、疫共沉淀技術(shù)（chromatin immuno precipitation，chip）是一項(xiàng)新發(fā)展的研究活體細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)dna與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，其主要實(shí)驗(yàn)流程是：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)dna復(fù)合物，并通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長度的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識別反應(yīng),沉淀該復(fù)合體，從而富集與目的蛋白相結(jié)合的dna片段，通過對目的片段的純化及pcr檢測（圖6-30），獲得該蛋白質(zhì)與dna相互作用的信息，包括具體的dna序列特征，位置，結(jié)合時(shí)間、親和程度以及對基因表達(dá)的影響等（圖6-31）。chip技術(shù)不僅可以用來檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與dna的動(dòng)態(tài)作用，還可以研究組蛋白

43、的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系，定性或定量檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與dna的動(dòng)態(tài)作用。如果能將你所研究的目的蛋白定位到染色質(zhì)dna上某個(gè)或某些功能基因的啟動(dòng)子區(qū)或附近，對于確定你所感興趣的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能可能會(huì)是一次質(zhì)的飛躍。6. 3. 5 rnai（rna interference, rna干涉）技術(shù)及其應(yīng)用rnai技術(shù)利用雙鏈小rna高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mrna從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。研究發(fā)現(xiàn)，對線蟲注射外源雙鏈rna（double-stranded rna）可誘發(fā)與該rna高度同源的基因序列的特異性“沉默”。現(xiàn)在已經(jīng)知道，rnai是一個(gè)多步驟反應(yīng)過程，包括對觸發(fā)物

44、的加工、與目標(biāo)mrna的結(jié)合以及目標(biāo)mrna的降解。至今已在果蠅、錐蟲、渦蟲、線蟲等許多動(dòng)物及大部分植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了rnai效應(yīng)。雙鏈rna是rnai的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈rna（ssrna, single-stranded rna）的降解。經(jīng)過dicer（一種具有rnaase iii活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的外源雙鏈rna（30個(gè)核苷酸以上）首先被降解形成2125個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸（sirna，short interfering rna），并有效地定位目標(biāo)mrna。因此，sirna是導(dǎo)致基因沉默和序列特異性rna降解的重要中間媒介。較短的雙鏈rna不能被有效地加工為s

45、irna，因而不能介導(dǎo)rnai。sirna具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5端磷酸基團(tuán)和3端的羥基，其兩條鏈的3端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由sirna中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（risc）的核蛋白體，再由risc介導(dǎo)切割目的mrna分子中與sirna反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能（圖6-32）。sirna還可作為特殊引物，在依賴于rna的rna聚合酶的作用下，以目的mrna為模板合成dsrna，后者又可被降解為新的sirna，重新進(jìn)入上述循環(huán)。因此，即使外源sirna的注入量較低，該信號也可能迅速被放大，導(dǎo)致全面的基因沉默。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長的dsrna會(huì)導(dǎo)致

46、非特異性基因沉默，只有大約21-25個(gè)核苷酸的sirna才能有效地引發(fā)特異性基因沉默。非哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以利用較長的雙鏈rna直接誘導(dǎo)產(chǎn)生rnai而無須合成sirna，因此，設(shè)計(jì)非哺乳動(dòng)物細(xì)胞rnai實(shí)驗(yàn)的步驟比較簡便，只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄得到所需要的dsrna，再通過浸泡、注射或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)rnai。6. 4 基因芯片及數(shù)據(jù)分析應(yīng)用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法如rt-pcr或northern印跡雜交法研究基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，受電泳泳道數(shù)量的限制，每次一般只能研究很少量的靶基因。隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入，迫切需要能同時(shí)監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，以期迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或

47、細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律?；蛐酒╠na chip），又稱dna微陣列（dna microarray）技術(shù)就是在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生的。6. 4. 1 基因芯片技術(shù)原理基因芯片是一種小型分析裝置，能夠快速和精確地研究生物體、組織、器官或細(xì)胞內(nèi)基因組的遺傳信息。制作基因芯片時(shí)，可用機(jī)械臂將大量已知或未知序列的dna片段點(diǎn)在玻璃片（通常為2×2厘米2）、金屬片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用使之固定化。也可以直接在玻璃板或金屬表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cdna或其它樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到成千上萬個(gè)基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)

48、期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)情況（圖6-33）。熒光標(biāo)記的cdna與芯片上相匹配的dna序列發(fā)生雜交反應(yīng)，使得芯片上的點(diǎn)呈現(xiàn)出熒光信號，熒光信號的強(qiáng)度和基因表達(dá)的豐度成正相關(guān)?；蛐酒@種微型化裝置具有巨大的容量，使科學(xué)家能在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析整個(gè)基因組的變化。用基因芯片進(jìn)行研究一般包括五個(gè)步驟：生物學(xué)問題的提出、樣品制備、生化反應(yīng)、檢測、數(shù)據(jù)模型分析。6. 4. 2 基因芯片的點(diǎn)制過程1、簡易基因芯片制作簡易基因芯片時(shí)，使用機(jī)械臂把dna片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用（85）烘烤或化學(xué)處理使dna分別固定在載體上。將芯片與待研究的cdna或其它樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以

49、觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控情況（圖6-34）。簡易芯片上的基因數(shù)量少（一般不超過2，000），主要用于研究小部分特定的基因表達(dá)狀態(tài)。簡易芯片一般可以用手工制作或者機(jī)械手點(diǎn)樣。2、大規(guī)模基因芯片大規(guī)?；蛐酒ǔＩ婕盎蚪M規(guī)模與數(shù)量（一般大于10,000個(gè)基因），可采用接觸式點(diǎn)樣、非接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。其主要工作流程如下：（1）經(jīng)大規(guī)模pcr擴(kuò)增獲得獨(dú)立cdna片段；（2）用機(jī)械手將pcr產(chǎn)物點(diǎn)在合適的介質(zhì)上，變性、固定；（3）分別從不同器官、組織或細(xì)胞中分離mrna，反轉(zhuǎn)錄生成cdna；（4）用不同的熒光染料標(biāo)記不同的cdna樣

50、本；（5）將標(biāo)記后的cdna與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交；（6）激光掃描芯片雜交結(jié)果，計(jì)算機(jī)處理；（7）分析雜交數(shù)據(jù)。6. 4. 3 基因芯片數(shù)據(jù)分析基因芯片數(shù)據(jù)分析包括兩部分，數(shù)據(jù)可靠性分析和生物學(xué)意義分析。數(shù)據(jù)可靠性分析。因?yàn)橛没蛐酒M(jìn)行雜交分析，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有些變化，因?yàn)榘ò衐na濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度以及溫度等許多因素影響了雜合雙鏈的形成和穩(wěn)定性。因此，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。主要的方法是通過兩次平行雜交反應(yīng)，將每個(gè)基因在兩個(gè)反應(yīng)中的表達(dá)水平做成對應(yīng)散點(diǎn)圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45度斜線附近，就說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的（圖6-35）。為了保證基因芯片

51、數(shù)據(jù)的可靠性，芯片中還需要加上多個(gè)持家基因（housekeeping genes）作為內(nèi)對照。持家基因，如呼吸作用的酶類和細(xì)胞骨架蛋白基因等，是維持細(xì)胞正常生長發(fā)育的必須基因，其表達(dá)水平在細(xì)胞內(nèi)基本不變。數(shù)據(jù)處理時(shí)，認(rèn)為持家基因的反應(yīng)信號在兩種組織中不變，依此確定其它基因表達(dá)信號的相對變化。生物學(xué)意義分析。主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。通常，在芯片中某一器官或發(fā)育時(shí)期可能有成百上千個(gè)差異表達(dá)基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有400多個(gè)特異表達(dá)的基因，如果要將這些基因的來龍去脈都搞清楚，可能要追溯超過4000篇以上的文獻(xiàn)（假設(shè)1個(gè)基因需要查閱10篇文獻(xiàn)）。這種不撿

52、重點(diǎn)的方法耗時(shí)耗力，所獲得的結(jié)果也往往不一定有意義。因此，首先將差異表達(dá)基因定位于不同的生化代謝途徑，統(tǒng)計(jì)每條生化代謝途徑中固有的基因數(shù)量和被基因芯片定位的差異表達(dá)的基因數(shù)量，可以計(jì)算出特定器官或特定發(fā)育階段表達(dá)有顯著差異的代謝途徑。圖6-36是11,832個(gè)棉花cdna的玻璃芯片雜交圖譜的差異表達(dá)基因聚類分析，發(fā)現(xiàn)有超過700個(gè)基因在棉花纖維伸長期特異性高表達(dá)。將這些基因定位到不同代謝途徑中并經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，乙烯合成、細(xì)胞骨架和脂肪酸合成及延伸是三個(gè)在纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)的代謝途徑（表6-4）。在后續(xù)生物學(xué)研究中，以這些最具代表性的代謝途徑為突破口，闡述了這些途徑在纖維細(xì)胞發(fā)育中的重要性。

53、表6-4 用途徑分析法研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生物學(xué)意義的代謝途徑生物體代謝途徑芯片中被定位的基因數(shù)定位的差異表達(dá)基因數(shù)p值q值總數(shù)2914162乙烯合成530.00160.0295細(xì)胞骨架75100.00770.0376脂肪酸合成及延伸6490.00800.0376糖胺降解1640.00990.0376抗壞血酸代謝6380.02170.0522油菜素內(nèi)脂合成620.03970.06296. 5 利用酵母鑒定靶基因功能釀酒酵母作為單細(xì)胞真核生物，具有和動(dòng)植物細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)特征，包括細(xì)胞核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，線粒體，過氧化物酶體，細(xì)胞骨架等，而且其細(xì)胞生長發(fā)育過程和動(dòng)植物細(xì)胞也有很高的相似性，

54、很多基因在酵母和動(dòng)植物細(xì)胞中是高度保守的。而且，酵母細(xì)胞很容易進(jìn)行生物化學(xué)和分子生物學(xué)操作，因此，酵母是基因功能研究中常用的模式生物。6. 5. 1 酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，是最早完成基因組dna全序列測定的真核生物。鑒于其快速生長能力、無性繁殖能力以及簡便的平板影印能力，它是生命科學(xué)領(lǐng)域里廣泛應(yīng)用的模式生物之一。理論上，與任何一種遺傳學(xué)特征相對應(yīng)的不同物種的結(jié)構(gòu)基因都可以通過質(zhì)粒文庫的互補(bǔ)作用而在酵母缺失突變體中得到鑒定。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中的dna既能以自主復(fù)制的形式存在，也可能以被整合到基因組的方式存在

55、。酵母中轉(zhuǎn)化dna的整合重組主要通過同源重組方式進(jìn)行，整合效率較高。酵母細(xì)胞的直徑大約有5 µm,在光學(xué)顯微鏡下可以觀察它的許多重要特征。釀酒酵母細(xì)胞是以出芽方式生長的。出芽的細(xì)胞被稱為母細(xì)胞，產(chǎn)生的芽就成為子細(xì)胞（圖6-37）。新生的芽從酵母細(xì)胞分裂周期一開始就出現(xiàn)，直到細(xì)胞周期結(jié)束才從母細(xì)胞上分離下來。由于酵母細(xì)胞的全部生長都集中在芽上，而且這種生長貫穿整個(gè)細(xì)胞周期，所以通過觀察芽的大小就可以粗略估計(jì)哪個(gè)細(xì)胞處于某種生長發(fā)育階段。當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素耗盡時(shí)，酵母細(xì)胞會(huì)停止生長而滯留在特定生長發(fā)育階段，因此，可以通過觀察顯微鏡下酵母細(xì)胞的出芽頻率確定酵母的營養(yǎng)狀態(tài)。酵母單倍體和二倍體

56、細(xì)胞在形態(tài)上有相似性，但也存在重要的差異。首先，二倍體細(xì)胞的直徑大約是單倍體的1.3倍。其次，二倍體細(xì)胞呈長形或卵圓形而單倍體細(xì)胞通常接近圓形。第三，二倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞的出芽方式不同。每個(gè)酵母細(xì)胞衰老前一般出芽20次，在母細(xì)胞表面以一定的方式連續(xù)出芽。單倍體細(xì)胞按照沿軸線的方向出芽，新芽與前一個(gè)芽緊密相連。二倍體細(xì)胞按極性方向出芽，新芽可以出現(xiàn)在長形細(xì)胞的任何一端。酵母細(xì)胞有三種交配型mata，mat以及由這兩種細(xì)胞相互交配形成的第三種交配型mata/。mata/不能與mata和mat中任何一種細(xì)胞交配。一般而言，mata和mat為單倍體，mata/為二倍體，但有例外。帶有不同突變的單倍體

57、細(xì)胞之間發(fā)生交配可以將不同的突變基因組合在同一個(gè)細(xì)胞中，為研究基因之間的相互關(guān)系提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。野生型酵母屬于原養(yǎng)型，只要培養(yǎng)基中有足夠可利用的碳源和氮源，酵母細(xì)胞就能合成自身需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)。酵母首選碳源是葡萄糖，但也能利用其它很多種糖類。如果碳源適宜，酵母細(xì)胞首選通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生能量。酵母細(xì)胞是條件性厭氧菌，在有氧和無氧狀態(tài)下都能生存。二倍體酵母細(xì)胞在低氮、無發(fā)酵性碳源的條件下（營養(yǎng)缺乏，“饑餓”條件）能通過減數(shù)分裂形成單倍體孢子。此時(shí)，每個(gè)單倍體細(xì)胞在遺傳背景上完全相同，從單個(gè)孢子來源的所有細(xì)胞都帶有一套相同的染色體dna。這些單倍體細(xì)胞中的某些重要基因發(fā)生突變后，因?yàn)椴淮嬖诘任换?，很容易?dǎo)致酵母細(xì)胞生長發(fā)育異常而發(fā)生表型變化。圖6-38以酵母亮氨酸合成基因?yàn)槔榻B了二倍體細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞的過程。6. 5. 2 酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補(bǔ)利用yip（整合型質(zhì)粒）可以對酵母基因組中的任意基因進(jìn)行精確的敲除（置換），并通過孢子繁殖中的四分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測和研究。帶有致死突變位點(diǎn)和可能的外源功能互補(bǔ)基因的酵母二倍體細(xì)胞在饑餓條件下形成四分體孢子，將這四個(gè)孢子用酵母四分體分離系統(tǒng)分開，如果所引入的外源基