免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、1、定義、定義 用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱(chēng)為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（技術(shù)）。 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（hrp）或堿性磷酸酶（akp）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的

2、分布和含量。 1）免疫熒光方法 利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。2）免疫酶標(biāo)方法 是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。 本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：

3、 定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。 免疫酶標(biāo)方法目前在病理診斷中廣為使用的有abc法、sp三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等. 組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。1）western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來(lái)檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然western blotting也可定性和定位（通過(guò)提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測(cè)其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位），但

4、敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。2）elisa：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來(lái)檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測(cè)首選方法之一。n二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯npbspbs沖洗沖洗3 3次，每次次，每次3 3分鐘分鐘n根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù) n0.3%0.3%過(guò)氧化氫甲醇液阻斷過(guò)氧化氫甲醇液阻斷2020分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性化物酶的活性npbspbs沖洗、浸泡沖洗、浸泡5 5分鐘，分鐘，3

5、3次次n正常山羊血清室溫封閉正常山羊血清室溫封閉1010分鐘分鐘dab-二氨基聯(lián)苯胺是過(guò)氧化物酶的生色底物，在過(guò)氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。用于檢測(cè)過(guò)氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好。是hrp結(jié)合物最常用的底物常在免疫組化,原位雜交,western blot等膜顯色或檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶中應(yīng)用廣泛。 蘇木素是從洋蘇木中提取的一種染色劑，它在被氧化后生成蘇木精，同媒染劑（常用的是三價(jià)的鐵或鋁的鹽）一起使用，能夠使細(xì)胞核染色。蘇木素是一種堿性染料。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié) 1）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗

6、原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。2）組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。3）血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來(lái)源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4）一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。

7、5）二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。6）封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專(zhuān)門(mén)的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。7）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。3）沖洗的

8、時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）pbs的ph和離子強(qiáng)度的使用附和要求。n目的目的: : （1 1）防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞 的固有形態(tài)。的固有形態(tài)。 （2 2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶 性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與自然狀態(tài)時(shí)相仿。防止組織細(xì)性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與自然狀態(tài)時(shí)相仿。防止組織細(xì) 胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。 （3 3）使

9、組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來(lái)而產(chǎn)生不同的折射率，造使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來(lái)而產(chǎn)生不同的折射率，造 成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 （4 4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制 片。片。 （5 5）防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。 （6 6）經(jīng)過(guò)固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便經(jīng)過(guò)固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便 于辨認(rèn)于辨認(rèn)組織材料的固定組織材料的固定n固定液的選擇：固定液的

10、選擇：(1)(1)甲醛固定液：甲醛固定液：1010福爾馬林，福爾馬林，1010中性福爾馬林，中性福爾馬林，1010中中 性緩沖福爾馬林性緩沖福爾馬林(2)4(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液(3)bouin s(3)bouin s液及改良液及改良bouin sbouin s液液(4)zenker s(4)zenker s液液(5)zamboni s(5)zamboni s液液 (6)plp(6)plp固定液：過(guò)碘酸固定液：過(guò)碘酸- -賴氨酸賴氨酸- -多聚甲醛固定液。該固定劑多聚甲醛固定液。該固定劑 較適合富含糖類(lèi)組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保較適合富含糖類(lèi)組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的

11、抗原性保 存較好。存較好。(7)plpd(7)plpd固定液固定液 取取plpplp固定液固定液25ml25ml，加入，加入2.5%2.5%重鉻酸重鉻酸25ml25ml。(8)kanovsky s(8)kanovsky s液液(9)methacarn(9)methacarn固定液，對(duì)核內(nèi)抗原的保存效果較好。固定液，對(duì)核內(nèi)抗原的保存效果較好。(10)peg(10)peg液液(11)0.4%(11)0.4%對(duì)苯醌對(duì)苯醌(12)(12)碳二亞酰胺碳二亞酰胺- -戊二醛（戊二醛（ecg-gecg-g）液）液(13)(13)丙酮及醇類(lèi)固定劑丙酮及醇類(lèi)固定劑n固定時(shí)間：固定時(shí)間： 固定時(shí)間要視組織塊的厚薄

12、，固定液的種類(lèi)及濃度，溫固定時(shí)間要視組織塊的厚薄，固定液的種類(lèi)及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時(shí)間成正比，固度而定，原則上，組織塊大小與固定時(shí)間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時(shí)間成反比。定液的穿透力及濃度與固定時(shí)間成反比。大組織：大組織：7575乙醇乙醇3030120min120min，8585乙醇乙醇3030120min120min，9595醇醇 2h 2h，9595乙醇乙醇 2h 2h，9595乙醇乙醇過(guò)夜，無(wú)過(guò)夜，無(wú)水乙醇水乙醇30 30 60min60min，無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇303060min60min，無(wú)水乙，無(wú)水乙醇醇60min60min120min120min，二

13、甲苯，二甲苯、和和各各15min15min（可（可視觀察結(jié)果而定），石蠟視觀察結(jié)果而定），石蠟30min30min石蠟石蠟112h2h，石蠟，石蠟223h3h。小組織：小組織：7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇30min30min，9595乙醇乙醇1h1h、1h1h、過(guò)夜或過(guò)夜或2h2h，無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇、和和各各30min30min，二甲苯，二甲苯15min15min、10min10min、10min10min（肉眼觀（肉眼觀察），石蠟察），石蠟30min30min，石蠟，石蠟30min30min，石蠟，石蠟112h2h。載玻片的清潔：載玻片的清潔： 市售載玻片需經(jīng)清潔

14、液浸泡市售載玻片需經(jīng)清潔液浸泡24h24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開(kāi)展原位雜交，還需將玻片涼干涂膠，如需開(kāi)展原位雜交，還需將玻片240240烤烤2h2h。切片粘合劑的使用：切片粘合劑的使用：（1 1）多聚賴氨酸（分子量）多聚賴氨酸（分子量300kd300kd）：）：0.5%0.5%濃度。濃度。（2 2）apesapes試劑（試劑（3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）氨基、丙基三氧基硅烷） 干凈載玻片干凈載玻片丙酮丙酮5min 5min 用鑷子夾住浸入用鑷子夾住浸入apesapes試劑試劑（1ml+50ml1ml+50ml丙酮）丙酮） 1 13 3次次純丙酮洗二

15、次純丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片用鋁箔用鋁箔包好，室溫或包好，室溫或44保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?（3 3）鉻礬明膠液：鉻礬）鉻礬明膠液：鉻礬0.5g 0.5g 明膠明膠5g h5g h2 2o o2 2 1000ml 1000ml （4 4）甲醛明膠液：）甲醛明膠液：4040甲醛甲醛2.5ml 2.5ml 明膠明膠0.5g h0.5g h2 2o o2 2 100ml 100ml切片：切片： 石蠟切片：石蠟切片： (1)(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/31/3。 (2)52(2)526060烤片烤片18h18h。 (3)(3)切片厚切片厚2 24 4m m。 (4)(4)

16、切片刀要快切片刀要快 (5)(5)編上號(hào)編上號(hào) (6)(6)切片可在切片可在44保存數(shù)年保存數(shù)年 冰凍切片：冰凍切片： (1) (1)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)蔗糖處理冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)蔗糖處理 24h24h，冰凍切片。，冰凍切片。 (2) (2)冰凍切片后需涼干后立即固定冰凍切片后需涼干后立即固定 (3) (3)冰凍切片固定后冰凍切片固定后-80-80保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆胣將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。n待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60以上后取出玻片。n用4%的多聚甲醛固定2h以上。n可加甘油封存置于零下20度保存。n離心將細(xì)胞收集出來(lái)，用預(yù)冷的pbs洗23

17、遍，最后用pbs將細(xì)胞重懸。n吸取3050ul（可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整）滴至處理過(guò)的載玻片上，然后涂抹均勻。n待稍微風(fēng)干以后加4多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞，固定24小時(shí)。n在細(xì)胞上加一層甘油放-20-20保存。保存。熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué) 直接法直接法 間接法間接法一、抗體的保存一、抗體的保存 濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在 4 4冰箱內(nèi)，保存時(shí)間可達(dá)冰箱內(nèi)，保存時(shí)間可達(dá)1-31-3年。年。 即用型抗體：理論上在即用型抗體：理論上在4 4 冰箱內(nèi)冰箱內(nèi) 可保存半年左右。可保存半年左右。 pbspbs或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般 只可放置只可放置1-1-2 2個(gè)月。個(gè)月。二、出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因二、出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因 組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過(guò)深，不能作為判斷陽(yáng)性的依據(jù)。織著色過(guò)深，不能作為判斷陽(yáng)性的依據(jù)。 出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，壞死細(xì)胞出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶均可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。釋放的內(nèi)源性過(guò)氧化物