基因芯片對(duì)生物學(xué)研究進(jìn)展的影響

1、生物芯片的應(yīng)用簡介生物芯片的應(yīng)用簡介雷安民雷安民西北農(nóng)林科技大學(xué)西北農(nóng)林科技大學(xué) . .干細(xì)胞研究中心干細(xì)胞研究中心西北農(nóng)林科技大學(xué)西北農(nóng)林科技大學(xué) . .動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院對(duì)基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展的影響對(duì)基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展的影響芯片技術(shù)用于基因序列測(cè)定芯片技術(shù)用于基因序列測(cè)定 第一代的雜交測(cè)序；第一代的雜交測(cè)序； 第二代的合成測(cè)序第二代的合成測(cè)序-單單/四核苷酸循環(huán)；四核苷酸循環(huán)； 第三代的納米芯片測(cè)序技術(shù)；第三代的納米芯片測(cè)序技術(shù)；傳統(tǒng)的基因測(cè)序方法 測(cè)序時(shí)分成四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)測(cè)序時(shí)分成四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的a, c, g, t核苷三磷酸(稱為ddatp, ddctp

2、, ddgtp, ddttp), 然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在聚合反應(yīng)過程中，ddntp 和dntp會(huì)隨機(jī)性的結(jié)合，一旦ddntp加入了新合成的dna鏈, 由于其3位的羥基變成了氫,不能形成磷酸二酯鍵，所以不能繼續(xù)延伸。由此產(chǎn)生a，t，c，g四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的page膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得dna 序列。 尿素變性的page電泳膠雜交測(cè)序原理雜交測(cè)序原理雜交測(cè)序原理示意圖雜交測(cè)序原理示意圖新一代的測(cè)序原理新一代的測(cè)序原理第一步，基因組被打斷為第一步，基因組被打斷為100-200bps的片段的片段每個(gè)片段被接上接頭序列每個(gè)片段被接上接頭序列接頭后的片段在片基上固定接頭后的片段

3、在片基上固定對(duì)應(yīng)鏈的邊合成邊測(cè)序?qū)?yīng)鏈的邊合成邊測(cè)序新型納米孔測(cè)序法（新型納米孔測(cè)序法（nanopore sequencing）是采用電）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進(jìn)行高通量物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進(jìn)行高通量檢測(cè)。此外，納米級(jí)別的孔徑保證了檢測(cè)具有良好的持續(xù)檢測(cè)。此外，納米級(jí)別的孔徑保證了檢測(cè)具有良好的持續(xù)性，所以測(cè)序的準(zhǔn)確度非常高。對(duì)于長達(dá)性，所以測(cè)序的準(zhǔn)確

4、度非常高。對(duì)于長達(dá)1,000個(gè)堿基的個(gè)堿基的單鏈單鏈dna分子、分子、rna分子或者更短的核酸分子而言，根分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記就可以使用納米孔測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，本無需進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記就可以使用納米孔測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，這使得便宜、快速地進(jìn)行這使得便宜、快速地進(jìn)行dna測(cè)序成為可能。如果對(duì)現(xiàn)測(cè)序成為可能。如果對(duì)現(xiàn)有納米孔測(cè)序法進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)展和改進(jìn)，那么它將有望成有納米孔測(cè)序法進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)展和改進(jìn)，那么它將有望成為第三代測(cè)序技術(shù)（也可稱為下、下一代測(cè)序技術(shù)），從為第三代測(cè)序技術(shù)（也可稱為下、下一代測(cè)序技術(shù)），從而幫助人們實(shí)現(xiàn)而幫助人們實(shí)現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)只花費(fèi)小時(shí)內(nèi)只花費(fèi)1,000

5、美元完成二倍體哺美元完成二倍體哺乳動(dòng)物基因組測(cè)序這一目標(biāo)。乳動(dòng)物基因組測(cè)序這一目標(biāo)。 2008年開始的第三代測(cè)序技術(shù)則是基于納米孔年開始的第三代測(cè)序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有望大大降低測(cè)序成本，改變個(gè)人醫(yī)療的前景。第望大大降低測(cè)序成本，改變個(gè)人醫(yī)療的前景。第三代測(cè)序技術(shù)的基本原理是在納米孔中配置納米三代測(cè)序技術(shù)的基本原理是在納米孔中配置納米電極，用電測(cè)方法測(cè)量一個(gè)電極，用電測(cè)方法測(cè)量一個(gè)dna的核酸堿基排列。的核酸堿基排列。但是電測(cè)識(shí)別一個(gè)分子的技術(shù)開發(fā)極其困難，因但是電測(cè)識(shí)別一個(gè)分子的技術(shù)開發(fā)極其困難，因此尚未有驗(yàn)證

6、該原理的實(shí)例。此尚未有驗(yàn)證該原理的實(shí)例。 孔道蛋白：是金黃色葡萄球菌孔道蛋白：是金黃色葡萄球菌溶血素；溶血素； 納米孔道的電位測(cè)量；納米孔道的電位測(cè)量；表達(dá)譜芯片的應(yīng)用表達(dá)譜芯片的應(yīng)用組織芯片組織芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片, , 又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基是指以蛋白質(zhì)分子作為配基, ,將其有序地固定在將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式

7、測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。子之間的相互作用關(guān)系。研究蛋白質(zhì)芯片的意義研究蛋白質(zhì)芯片的意義蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片蛋白質(zhì)功能芯片蛋白質(zhì)功能芯片 蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的制備蛋白質(zhì)芯片的制備蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片檢測(cè) 探針標(biāo)記檢測(cè)法探針標(biāo)記檢測(cè)法 無探針標(biāo)記檢測(cè)法無探針標(biāo)記檢測(cè)法p表面增強(qiáng)激光解吸離子化技術(shù)表面增強(qiáng)激光解吸離子化技術(shù)(surface enhanced laser desorption/ionization, seldi)p表面等離子體共振檢測(cè)技術(shù)表面等離子體共振檢測(cè)技

8、術(shù)（surface plasmon resonance, spr）p原子力顯微鏡檢測(cè)技術(shù)原子力顯微鏡檢測(cè)技術(shù)（atomic force microscope, afm ）p同位素標(biāo)記檢測(cè)同位素標(biāo)記檢測(cè)p熒光標(biāo)記檢測(cè)熒光標(biāo)記檢測(cè)p化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)p酶免疫標(biāo)記檢測(cè)酶免疫標(biāo)記檢測(cè)p膠體金標(biāo)記檢測(cè)膠體金標(biāo)記檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用u疾病診斷和預(yù)警疾病診斷和預(yù)警u藥物開發(fā)藥物開發(fā)u蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué) 定量檢測(cè)組織提取液中的腫瘤標(biāo)記物定量檢測(cè)組織提取液中的腫瘤標(biāo)記物孵育后的微陣列熒光圖孵育后的微陣列熒光圖 a 含抗原含抗原 b 無抗原無抗原微陣列方法與微陣列方法與elisa方法檢出結(jié)

9、果比較方法檢出結(jié)果比較疾病診斷疾病診斷upa 尿激酶型纖溶酶原激活因子尿激酶型纖溶酶原激活因子pai-1血漿纖溶酶原激活因子抑制因子血漿纖溶酶原激活因子抑制因子vegf 血管內(nèi)皮生長因子血管內(nèi)皮生長因子高通量篩選蛋白高通量篩選蛋白- -蛋白作用抑制劑蛋白作用抑制劑藥物開發(fā)藥物開發(fā)a 1500 個(gè)點(diǎn)陣的微陣列個(gè)點(diǎn)陣的微陣列b 局部點(diǎn)陣放大圖及局部點(diǎn)陣放大圖及spr信號(hào)信號(hào)his6-rb/gst-e7相互作用抑相互作用抑制劑篩選微陣列圖制劑篩選微陣列圖加入加入his6-rb加入含加入含 pepc抑制劑的抑制劑的his6-rb（1 1）疾病的蛋白質(zhì)組研究）疾病的蛋白質(zhì)組研究 通過比較正常與病理?xiàng)l件下

10、細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)在表達(dá)量上通過比較正常與病理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)在表達(dá)量上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與病理改變有關(guān)的蛋白質(zhì)和疾病特異性蛋的差異，可以發(fā)現(xiàn)與病理改變有關(guān)的蛋白質(zhì)和疾病特異性蛋白。作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，認(rèn)識(shí)發(fā)病機(jī)制，為早期診白。作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，認(rèn)識(shí)發(fā)病機(jī)制，為早期診斷治療和預(yù)防提供線索，對(duì)疾病進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)與控制。斷治療和預(yù)防提供線索，對(duì)疾病進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)與控制。q 對(duì)腫瘤特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)；對(duì)腫瘤特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)；q 在糖尿病及心血管疾病方面的應(yīng)用；在糖尿病及心血管疾病方面的應(yīng)用；q 對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物標(biāo)志分子的檢測(cè)；對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物標(biāo)志分子的檢測(cè)；q 對(duì)人

11、類細(xì)胞因子和趨化因子的測(cè)定和定量分析。對(duì)人類細(xì)胞因子和趨化因子的測(cè)定和定量分析。 蛋白質(zhì)芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用（2 2）病原微生物的蛋白質(zhì)組研究）病原微生物的蛋白質(zhì)組研究 病原微生物蛋白質(zhì)病原微生物蛋白質(zhì)組研究對(duì)于闡明感染性疾病的發(fā)病機(jī)制，實(shí)現(xiàn)有效的組研究對(duì)于闡明感染性疾病的發(fā)病機(jī)制，實(shí)現(xiàn)有效的預(yù)防，早期診斷和治療，制備新的藥物等方面有著重預(yù)防，早期診斷和治療，制備新的藥物等方面有著重要意義。要意義。（3 3）在藥物開發(fā)中的應(yīng)用）在藥物開發(fā)中的應(yīng)用 在病理狀態(tài)下表達(dá)異?；蛱卦诓±頎顟B(tài)下表達(dá)異常或特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，以及細(xì)胞信號(hào)傳遞通路中的關(guān)鍵異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，以

12、及細(xì)胞信號(hào)傳遞通路中的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)，都可能成為藥物設(shè)計(jì)的靶分子。性蛋白質(zhì)，都可能成為藥物設(shè)計(jì)的靶分子。（4 4）毒理學(xué)分析）毒理學(xué)分析 通過發(fā)生損傷的組織器官與正常組織器通過發(fā)生損傷的組織器官與正常組織器官之間的蛋白質(zhì)組比較，有助于闡明藥物毒副作用的官之間的蛋白質(zhì)組比較，有助于闡明藥物毒副作用的發(fā)生機(jī)制。發(fā)生機(jī)制。蛋白質(zhì)芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用 人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白譜人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白譜蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了揭示了oxidized low density lipoprotein誘導(dǎo)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的作用模式誘導(dǎo)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的作用模式細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞經(jīng)oxidi

13、zed low density lipoprotein作用后的蛋白譜作用后的蛋白譜檢出檢出298個(gè)蛋白個(gè)蛋白54個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化4.7% 抗原（一組細(xì)胞抗原（一組細(xì)胞-細(xì)胞間相細(xì)胞間相互作用分子）表達(dá)上調(diào)；互作用分子）表達(dá)上調(diào)；13.4%抗原抗原（結(jié)構(gòu)蛋白，體液響結(jié)構(gòu)蛋白，體液響應(yīng)蛋白）表達(dá)下降應(yīng)蛋白）表達(dá)下降存在的問題存在的問題 成本過高，需一系列昂貴的尖端儀器成本過高，需一系列昂貴的尖端儀器 芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題 提高芯片的特異性、簡化樣品制備和標(biāo)記提高芯片的特異性、簡化樣品制備和標(biāo)記操作程序、增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度和消除操作程序、增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度和消

14、除芯片背景對(duì)于結(jié)果分析的影響等等芯片背景對(duì)于結(jié)果分析的影響等等染色質(zhì)免疫沉淀芯片染色質(zhì)免疫沉淀芯片（chip-chip） chip-on- chip是染色體免疫共沉淀與芯片技術(shù)的結(jié)合，用于分析在活是染色體免疫共沉淀與芯片技術(shù)的結(jié)合，用于分析在活體細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白與基因組體細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白與基因組dna之間的相互作用。該技術(shù)能夠快速之間的相互作用。該技術(shù)能夠快速在目標(biāo)基因組的染色體中確定特異在目標(biāo)基因組的染色體中確定特異dna結(jié)合蛋白的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合蛋白的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)，chip芯片也可以在一個(gè)基因組的任何感興趣的區(qū)域內(nèi)尋找染色體的芯片也可以在一個(gè)基因組的任何感興趣的區(qū)域內(nèi)尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變。結(jié)

15、構(gòu)改變。一、一、chip-chip的用途的用途（1）在基因組范圍內(nèi)確定基因轉(zhuǎn)錄因子的）在基因組范圍內(nèi)確定基因轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合位點(diǎn)和其他結(jié)合位點(diǎn)和其他dna結(jié)結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合體的合蛋白或蛋白復(fù)合體的dna結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。（2）染色體活性狀態(tài)的定量分析。）染色體活性狀態(tài)的定量分析。（3）組蛋白修飾的功能研究。通過用?；蚣谆慕M蛋白的特異）組蛋白修飾的功能研究。通過用?；蚣谆慕M蛋白的特異抗體和沒有進(jìn)行修飾的組蛋白的特異抗體，可以確定與組蛋白修飾抗體和沒有進(jìn)行修飾的組蛋白的特異抗體，可以確定與組蛋白修飾有關(guān)的結(jié)合模式的變化。有關(guān)的結(jié)合模式的變化。（4）聚合酶活性的定量分析。）聚

16、合酶活性的定量分析。（5）精煉生物信息方法，用功能數(shù)據(jù)來確定啟動(dòng)子的位置。）精煉生物信息方法，用功能數(shù)據(jù)來確定啟動(dòng)子的位置。交聯(lián)與裂解細(xì)胞交聯(lián)與裂解細(xì)胞超聲破碎免疫共沉淀測(cè)序得到序列信息與基因組信息比對(duì) chip-on-chip技術(shù)能為一些重要機(jī)制的研究提供線索，技術(shù)能為一些重要機(jī)制的研究提供線索，包括包括dna復(fù)制、修飾、修復(fù)，更重要的還有甲基化以及復(fù)制、修飾、修復(fù)，更重要的還有甲基化以及組蛋白修飾等等；還能幫助我們更好的組蛋白修飾等等；還能幫助我們更好的 理解一些疾病的理解一些疾病的發(fā)生機(jī)理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，發(fā)生機(jī)理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，chip-o

17、n-chip技術(shù)也已在一些至關(guān)重要的生命過程中為技術(shù)也已在一些至關(guān)重要的生命過程中為我們提供了重要的線索，我們提供了重要的線索， 包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、癌包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、癌癥發(fā)生、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)生成等過程。癥發(fā)生、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)生成等過程。 研究基因啟動(dòng)子部位組蛋白的甲基化乙?；蛄姿峄芯炕騿?dòng)子部位組蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水平改變；平改變； 研究基因啟動(dòng)子部位研究基因啟動(dòng)子部位dna甲基化水平改變甲基化水平改變 研究轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合的所有基因啟動(dòng)子研究轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合的所有基因啟動(dòng)子dnagenechip-tilingarray技術(shù)簡介技術(shù)簡介af

18、fymetrix公司于公司于2006年年1月月24日宣布推出日宣布推出genechip（r）人類和鼠源嵌合芯片（人類和鼠源嵌合芯片（tilinga，ray）系列產(chǎn)品。該系列芯）系列產(chǎn)品。該系列芯 片研究范圍大大超出已知編碼蛋白序列，可以對(duì)整個(gè)人類和片研究范圍大大超出已知編碼蛋白序列，可以對(duì)整個(gè)人類和小鼠基因組進(jìn)行系統(tǒng)的研究小鼠基因組進(jìn)行系統(tǒng)的研究嵌合芯片嵌合芯片 （tilingarray）是迄今為止分辨率最高的基因芯）是迄今為止分辨率最高的基因芯片類型，其探針設(shè)計(jì)幾乎涵蓋了目標(biāo)片類型，其探針設(shè)計(jì)幾乎涵蓋了目標(biāo)dna的全部序列。迄今的全部序列。迄今為止，為止，affymetrix公司已經(jīng)開公司已經(jīng)開 發(fā)出了人、小鼠、酵母、線蟲、發(fā)出了人、小鼠、酵母、線蟲、擬南芥等模式生物的全基因組擬南芥等模式生物的全基因組tiling芯片，為全基因組規(guī)模芯片，為全基因組規(guī)模上研究目的蛋白與核酸的相互作用提供了強(qiáng)有力的分析工具。上研究目的蛋白與核酸的相互作用提供了強(qiáng)有力的分析工具。 genechip-t