DNA納米技術(shù)從試管走向細胞的歷程

1、DNA納米技術(shù)從試管走向細胞的歷程基于沃森-克里克堿基互補配對原則，隨著合成成本的降低，DNA在構(gòu)建自組裝分子結(jié)構(gòu)和動態(tài)分子裝置上得到了廣泛的應用。在無細胞環(huán)境中，DNA納米技術(shù)的研究者對DNA復雜系統(tǒng)和定量反應機制的研究已經(jīng)達到基因工程和細胞技術(shù)無法企及的程度。然而，DNA納米技術(shù)最有趣的應用（最大地利用DNA系統(tǒng)尺寸小、生物相容性好以及可塑性強的性質(zhì)）都停留在生物界面的程度。這篇綜述里，我們回顧了DNA納米技術(shù)研究從試管到細胞的歷程。我們著重介紹了DNA成像探針、智能治療及藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)發(fā)展過程中的關鍵性突破，同時展望了細胞DNA納米技術(shù)未來的挑戰(zhàn)和機遇。 DNA納米技術(shù)屬于純粹的分子生物工

2、程學技術(shù)。這一領域旨在將DNA作為工程學材料構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)和裝置。DNA堿基互補配對的自然特性使得控制DNA間的相互作用變得簡單，同時可以合理地設計具有精確尺寸的DNA納米結(jié)構(gòu)、自主移動的分子馬達和處理信息的DNA回路。目前還沒有任何其它分子工程技術(shù)可以像DNA納米技術(shù)這樣完全從頭設計復雜多樣的類分子生物系統(tǒng)。DNA納米技術(shù)的成功源于三個關鍵因素：1. 對DNA熱動力學的認知使得我們可以精確預測單鏈DNA自身折疊及DNA分子間的相互作用（1，2）；2. DNA合成成本不斷下降，質(zhì)量不斷提高（3）；3. 研究主要在無細胞環(huán)境中進行，DNA不會受到的DNA/RNA酶以及細胞內(nèi)可能會出現(xiàn)的其它復雜因子

3、的干擾，故而可以朝著設計的預期發(fā)展。長期以來，DNA納米技術(shù)的發(fā)展動力是構(gòu)建智能治療劑、藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、分子生物學工具以及其他可以與活細胞相互作用甚至能操控活細胞的裝置（4-7）（Fig.1）。這些應用是核酸結(jié)構(gòu)和裝置的顯著優(yōu)勢，特別是它們尺寸小、生物相容性好以及可控的通過雜交與細胞核酸作用的明確性質(zhì)。然而，要實現(xiàn)DNA納米技術(shù)的應用，必須解決從高度混合的反應緩沖液到空間結(jié)構(gòu)化、內(nèi)容復雜的細胞環(huán)境中，實驗依然可以進行（Box 1）。在這篇綜述里，我們總結(jié)了最近將DNA納米技術(shù)應用至細胞的研究進程。我們著重于核酸納米裝置及結(jié)構(gòu)的合理設計、化學修飾，然后轉(zhuǎn)運至哺乳細胞的過程。首先，我們簡單回顧了細胞

4、外DNA納米技術(shù)的研究；然后，轉(zhuǎn)向更多的類細胞環(huán)境的研究。在細胞裂解液或固定細胞等類細胞環(huán)境下，可以不完全的部分模擬復雜的細胞環(huán)境，獲得相關數(shù)據(jù)。接下來，在介紹轉(zhuǎn)運DNA裝置至細胞內(nèi)的相關工作前，我們討論了最近一些證明DNA納米裝置可控的與細胞表面蛋白相互作用的研究成果。緊接著介紹了在活細胞內(nèi)工作的裝置，同時回顧了利用DNA探針和邏輯門檢測、分析和調(diào)控細胞內(nèi)RNA水平的早期工作。我們通過著重介紹在活細胞內(nèi)增強DNA裝置表現(xiàn)的RNA成像探針、siRNAs或者ASOs的設計原則來介紹這一部分工作。最后，我們介紹了與DNA納米技術(shù)很大程度上有著相同目標但又用于遺傳編碼和轉(zhuǎn)錄RNA的RNA納米技術(shù)和R

5、NA合成學。Figure 1| DNA納米技術(shù)在生物界面上的應用 A，智能治療劑可以將結(jié)構(gòu)與分子邏輯結(jié)合，在特定的細胞或組織內(nèi)實現(xiàn)靶標治療（60）。B，DNA納米結(jié)構(gòu)可作為可設計的腳手架來附著藥物、靶標鏈和脂雙分子層等其他修飾（78）。C，一系列新奇的敏感特定的成像探針，基于DNA設計的與RNA序列特異性相互作用的信號放大器（52）。D，DNA折紙和其它結(jié)構(gòu)可精確控制功能分子基團的空間結(jié)構(gòu)，形成高效的細胞生物學定量檢測工具（66）。無細胞DNA納米技術(shù)為了在復雜潮濕的環(huán)境中可靠地實現(xiàn)功能，在活體用分子傳感器檢測環(huán)境變化；用分子馬達和致動器適應環(huán)境；用計算控制回路將傳感器信息轉(zhuǎn)換為馬達的運行；用

6、特定結(jié)構(gòu)的元素來保護并組織這些部件。有趣的是，在無細胞環(huán)境下，DNA納米技術(shù)在組織大部分模擬復雜生物現(xiàn)象的分子馬達必須的大部分功能化組件上已經(jīng)有了一定的進展。我們在這里回顧了一些無細胞DNA納米技術(shù)的主要成果并指出了其在細胞環(huán)境中的潛在應用。結(jié)構(gòu)DNA納米技術(shù)在上世紀80年代，Nadrian Seeman提出了DNA可以作為結(jié)構(gòu)工程學材料這一概念（8-10）。在1998年，Winfree等首次經(jīng)實驗實現(xiàn)了大尺寸結(jié)構(gòu)的合成：他們證明納米尺寸的DNA小塊可以通過多條寡聚核苷酸鏈自組裝形成微米級的周期性排列的DNA陣列（11）。隨后，tile自組裝和相關技術(shù)被成功的應用與構(gòu)建一系列的陣列和網(wǎng)絡DNA

7、結(jié)構(gòu)（11-19）。Rothemund通過DNA折紙將結(jié)構(gòu)DNA自組裝進一步發(fā)展。DNA折紙術(shù)操作簡單，結(jié)構(gòu)具有足夠的彈性來適應幾乎所有的二維結(jié)構(gòu)，而且能夠穩(wěn)定高效的形成目標結(jié)構(gòu)（20）。DNA折紙通過長單鏈與大量短訂書鏈雜交折疊成目的結(jié)構(gòu)。這項技術(shù)被快速廣泛地應用，而且廣泛的用于自組裝三維結(jié)構(gòu)（21-24）。DNA納米結(jié)構(gòu)一開始是作為藥物轉(zhuǎn)運工具和相似的應用來研究，因為DNA折紙上精確分布的腳手鏈，可以連接藥物和靶標等官能基團。另外，三維結(jié)構(gòu)可以設計成需載運藥物的保護結(jié)構(gòu)。動態(tài)DNA納米技術(shù)動態(tài)DNA納米技術(shù)通過DNA酶催化或DNA鏈置換反應介導的鏈雜交實現(xiàn)的自組裝構(gòu)建具有可移動部件或時變行

8、為的裝置。動態(tài)DNA納米技術(shù)可追溯至多方面的起源，包括Adleman關于DNA計算及功能化核酸的進展和表征研究（25）。然而，真正開啟這一領域的是Yurke及其合作者，他們證明功能化分子馬達可被合理地設計，并且僅通過雜交和鏈置換反應實現(xiàn)周期性工作（26）。隨后，Winfree和Pierce課題組證明多重鏈置換反應可以組合在一起構(gòu)建復雜的級聯(lián)反應（27，28）。由于DNA鏈置換級聯(lián)反應原理簡單，自從被應用以來已經(jīng)被廣泛和有效地應用于分子工程，成為大量動態(tài)DNA裝置的工作原理。動態(tài)DNA納米技術(shù)在分子馬達中的應用（29，30）包括：沿軌道自主移動的步行馬達（31-34）；分析復雜混合分子體系中信息

9、的分子回路（27，35-39）；可以檢測和放大信號的催化放大器（40-44）。很多這種系統(tǒng)有明顯的潛在生物學應用，比如：Shapiro及其合作者利用DNA和限制酶構(gòu)建通體外過檢測和分析一類基因調(diào)控類似產(chǎn)物的分子標簽來診斷疾病階段（6，45）。相反的，分子裝置和結(jié)構(gòu)在活細胞上和活細胞內(nèi)分析和檢測分子信息這一應用領域超越相應的電力學方法。Box 1|細胞內(nèi)的人工核酸研究人員在研究ASO、siRNA、分子信標以及相關技術(shù)的過程中發(fā)展了不同的技術(shù)、設計原則及限制因素，幫助我們認識核酸納米結(jié)構(gòu)進入細胞所需克服的困難。轉(zhuǎn)運在試管中，各種組分的濃度可以精確控制，實時監(jiān)測反應動力學數(shù)據(jù)。核酸裝置要在細胞內(nèi)發(fā)揮

10、功能，首先必須穿過細胞膜。不同的核酸轉(zhuǎn)運方法會導致截然不同的細胞攝取速率、攝取量、細胞器內(nèi)的分布甚至細胞狀態(tài)。例如通常用于轉(zhuǎn)染的脂類試劑能夠有效的轉(zhuǎn)運大量的探針進入細胞，但是一大部分都被包裹在溶酶體內(nèi)，并不能進入細胞質(zhì)（132，133）。相反，顯微注射可以將核酸直接遞送至細胞質(zhì)或細胞核，但僅限于相關的少數(shù)細胞。我們參考了Bao等（134）更深入地比較轉(zhuǎn)運合成核酸至細胞的不同方法及Davis等關于納米顆粒藥物載運的綜述（85）。穩(wěn)定性與化學修飾未作化學修飾的短鏈核酸在細胞內(nèi)的半衰期很短（135）。然而，大量針對核酸五碳糖、堿基和骨架的化學修飾已被證明能夠有效的增強其穩(wěn)定性。最常用的修飾有核苷內(nèi)連

11、接處的磷酸化修飾和核糖的2甲氧基修飾（136）。因為化學修飾能有效保護核酸抵抗核酸酶的降解，一些化學修飾（比如磷酸化鍵合（137）可能會影響細胞活性（138）。因此，在選擇核酸裝置修飾時，必須平衡裝置穩(wěn)定性與細胞活性。分子聚集與細胞區(qū)域化細胞內(nèi)密布著蛋白和其它生物大分子，會干擾多級多輸入邏輯回路和其它具有很多相互作用組分系統(tǒng)的運行。隨著分子尺寸的變化，合成DNA在細胞質(zhì)內(nèi)的擴散率為水溶液中1-20%（139）。在細胞環(huán)境和緩沖液中，單鏈互補核酸的雜交速度也不一樣（140）。另外，哺乳動物細胞由多種不同的單元組合形成，這些單元間的分隔會阻礙回路中的不同組分在細胞內(nèi)相遇。免疫活性進入細胞的外源核酸

12、會通過激活TLR受體引發(fā)自發(fā)免疫應答。TLR3識別雙鏈RNA，TLR7和TLR8識別單鏈RNA，TLR9識別DNA中的非甲基化CpG。哺乳細胞基因組中的CpG是完全甲基化的，而細菌的沒有，TLR9的任務就是檢測細胞內(nèi)的細菌源的非甲基化CpG（79）。蛋白激酶R結(jié)合的長于30bp的雙鏈RNA會激活細胞免疫應答，導致細胞死亡（141）。TLR9（142）或PKR（143）激活介導的免疫應答被認為是具有治療意義的，所以這兩種通路的免疫刺激可能是大家喜聞樂見的。然而，避免這些免疫刺激更為普遍。細胞裂解液和固定細胞內(nèi)的DNA納米技術(shù)細胞環(huán)境與無細胞環(huán)境截然不同（Box 1）：DNA酶和RNA酶等核酸結(jié)合

13、蛋白的存在可能會影響裝置的功能。另外，細胞內(nèi)高度結(jié)構(gòu)化，限制了外源核酸的自由擴散。細胞裂解液、血清和固定細胞提供模擬活細胞某些性質(zhì)的反應環(huán)境，同時有保證了DNA裝置的檢測和觀察處于一個相對可控的環(huán)境中。DNA納米結(jié)構(gòu)在細胞裂解液和血清中的穩(wěn)定性裂解液是細胞內(nèi)容物的均勻混合物。即使DNA納米結(jié)構(gòu)在裂解液中遇到的細胞組分與細胞內(nèi)的濃度與活性不同，核酸裝置可以很容易進入這種模擬細胞內(nèi)環(huán)境的沒有細胞壁的環(huán)境中。Yan Hao, Meldrum和合作者發(fā)現(xiàn)DNA折紙細胞裂解液中孵育12小時后可以重新提取并表征（46），而長單鏈和雙鏈孵育后無法重新獲得。由于折紙與裂解液混合液的詳細條件并沒有公布，很難判斷

14、該反應條件與生理環(huán)境的相似度。另外，DNA折紙實在高Mg2+濃度（10 Mm）的溶液中折疊的，向裂解液中加入大量的結(jié)構(gòu)會提高反應液的Mg2+濃度，使得結(jié)構(gòu)看上去很穩(wěn)定，但是在細胞內(nèi)就很難預測了。即使這樣，這些效應都是可以控制的，細胞裂解液仍然是探索納米裝置在生理環(huán)境表現(xiàn)的有效方法。將納米結(jié)構(gòu)送入細胞和動物要求結(jié)構(gòu)在血清和含血清的培養(yǎng)基中能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。血清跟裂解液一樣含有核酸酶，缺乏維持結(jié)構(gòu)所需的鎂等鹽離子。Conway等發(fā)現(xiàn)具有三棱柱結(jié)構(gòu)的三鏈小結(jié)構(gòu)血清內(nèi)穩(wěn)定性比無結(jié)構(gòu)混合鏈好（47）。電泳分析顯示無結(jié)構(gòu)鏈在10%胚牛血清中的半衰期小于1小時，而具有完整結(jié)構(gòu)的鏈半衰期接近兩小時。對鏈進行化學

15、修飾后，結(jié)構(gòu)的半衰期甚至大于24小時。Perrault和同事全面分析了三維折紙在含血清的哺乳動物細胞培養(yǎng)基內(nèi)的穩(wěn)定性，證明折紙結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的強弱取決于：折紙的設計、Mg2+濃度及核酸酶的活性（48）。通過電泳和TEM表征，他們發(fā)現(xiàn)折紙與細胞培養(yǎng)基孵育一天后，3次試驗中有兩次出現(xiàn)了部分折紙分解的現(xiàn)象，而向培養(yǎng)基中加入6mM Mg2+可以抑制分解。有趣的是具有三級結(jié)構(gòu)的DNA折紙納米管即使不在培養(yǎng)基中加鹽也能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。向培養(yǎng)基中加入高于5%的胚牛血清，孵育24小時后3種結(jié)構(gòu)皆被DNA酶部分降解。當加入能與核酸競爭性結(jié)合的肌動蛋白后核酸酶對結(jié)構(gòu)的降解作用神奇地減弱了，并且這種修飾在細胞培養(yǎng)環(huán)境下也

16、有效。為了定量DNA酶對納米結(jié)構(gòu)降解的程度，Keum和Bermudez檢測了DNA四面體在DNAase 1存在下的半衰期，發(fā)現(xiàn)DNA四面體比雙鏈DNA穩(wěn)定3倍（49）。DNA折紙也同樣被證明在核酸酶的環(huán)境中比雙鏈DNA穩(wěn)定。Castro等將折紙與不同的核酸酶孵育24小時后，通過TEM和電泳評估折紙的降解程度（50）。在DNase 1和T7核酸內(nèi)切酶環(huán)境中檢測到了降解，然而在DNase 1中折紙的降解速度比DNA雙鏈慢了幾百倍。比較折紙與四面體的研究，證明DNA折紙比較小的四面體更穩(wěn)定，可能是應為折紙中鏈之間的連接更緊密。上述的研究說明DNA納米結(jié)構(gòu)比簡單的單雙鏈核酸更能抵抗核酸酶的降解。而且一

17、些納米結(jié)構(gòu)在生理鹽濃度下能夠長時間保持結(jié)構(gòu)的完整。以后的研究必需完全揭示結(jié)構(gòu)的功能與穩(wěn)定性的內(nèi)在關系。固定細胞內(nèi)的DNA納米技術(shù)通透化處理的細胞和組織在某些方面依然能夠模擬細胞環(huán)境：固定化細胞的很多結(jié)構(gòu)組織依然保存完好，特別是區(qū)域化分布的mRNA和蛋白。固定化細胞為免疫或熒光原位雜交觀測細胞內(nèi)的mRNA和蛋白分布提供了一個可控的環(huán)境。基于DNA納米結(jié)構(gòu)的新方法很實用并且提高免疫或熒光原位雜交的靈敏度和特異性。例如基于HCR的分子探針已經(jīng)在完整的脊椎動物胚胎中對5種靶標RNA實現(xiàn)了同時成像（51，52）。通過在靶標mRNA雜交一系列適配鏈，Choi等可控地催化兩種帶有熒光標記的發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)生聚合反

18、應，反應產(chǎn)物與靶標mRNA結(jié)合，實現(xiàn)熒光信號放大，就可以很容易地通過熒光顯微鏡實現(xiàn)成像（Fig. 2a）。Raj和同事將鏈置換與單分子FISH (smFISH)相結(jié)合，通過檢測個體內(nèi)的mRNA可以獲得單堿基突變信息（53）。進行單分子熒光原位雜交時，大量單獨標記的DNA短鏈透過固定的細胞膜與靶標mRNA的不同區(qū)域結(jié)合（54）。對同一靶標mRNA上的探針進行共定位，可以得到普通熒光顯微鏡就能區(qū)分的不連續(xù)的熒光亮點。單堿基水平的區(qū)分是通過另外加入修飾熒光/淬滅劑的鏈置換探針實現(xiàn)的（53）。如果Toehold和靶標區(qū)域出現(xiàn)單堿基突變就會明顯降低探針鏈通過Toehold介導鏈置換的速度，對單堿基突變探

19、針進行共定位就可以分析是否出現(xiàn)突變（Figure 2b）。固定細胞內(nèi)的鏈置換也已經(jīng)用于研究DNA標記的蛋白研究（55）。這種雜交和鏈置換的能力使得多種蛋白成像不再受限于顯微鏡能提供的波長（通常四種），轉(zhuǎn)而之受限于能夠?qū)崿F(xiàn)雜交和鏈置換的序列數(shù)量。DNA-PAINT同樣利用了DNA雜交的可逆性質(zhì)。短的、熒光標記的DNA成像序列可以瞬間與互補的錨定鏈結(jié)合，從而附著至靶標上（56）。這種自發(fā)的結(jié)合與解離使得熒光像開關一樣在打開與關閉之間切換，這使得靶標位點在全內(nèi)反射顯微鏡上的成像分辨率達到10nm。綜上所述，DNA-PAINT可逆的性質(zhì)使其不受限于熒光分子的數(shù)量，而且標記于序列上的熒光染料可以反復使用

20、。DNA-PAINT在固定細胞內(nèi)已經(jīng)通過DNA錨定鏈結(jié)合的抗體來靶向細胞內(nèi)的蛋白實現(xiàn)了三維成像（57）。Figure 2| 固定細胞內(nèi)的mRNA原位成像。A, HCR FISH（52）。左：起始鏈雜交至靶標mRNA，然后引發(fā)兩種熒光標記的發(fā)卡結(jié)構(gòu)H1，H2之間發(fā)生聚合反應，使得mRNA上結(jié)合多個熒光分子，可以通過熒光顯微鏡成像。右：斑馬魚Z軸上不同位置的共聚焦顯微鏡成像。HCR探針用于檢測四種不同的mRNA (紅: Tg (flk1:egfp); 藍: tpm3; 綠: elevl3; 黃: ntla). B, 通過鏈置換探針檢測單堿基突變（53）。左：反應機制，突變型和野生型探針與靶標mRN

21、A競爭性結(jié)合。由于結(jié)合能力取決于Toehold序列，每一種探針都趨向于結(jié)合同源mRNA。通過多mRNA靶向探針與單核酸突變檢測探針共定位進一步證明信號確實位于mRNA上。右：導向探針（image 1）、野生型探針（image 2）和突變探針（image 3）對BRAF mRNA進行熒光成像。Image 4顯示了mRNA被區(qū)分為野生型或突變型。與細胞表面的標簽相互作用哺乳動物細胞是由大量的區(qū)域和結(jié)構(gòu)組成，不同的結(jié)構(gòu)和區(qū)域負責不同的生化反應。細胞表面最容易接近的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)雙分子層結(jié)合了許多表面蛋白，不同類型的細胞表面蛋白也不一樣。最近的幾篇文獻證明DNA納米系統(tǒng)通過設計可以與細胞表面的標簽相互作用

22、；像抗體、適配體一樣（58），DNA治療劑最成熟的例子是靶向血液中的細胞表面標簽和細胞，而不需要將納米結(jié)構(gòu)攝取至特定的細胞或組織中。Stojanovic和同事通過將DNA鏈置換探針共價修飾蛋白抗體的方法使探針結(jié)合特定的細胞表面蛋白（59）。細胞結(jié)合一種或者兩種探針取決于細胞表面具有哪種蛋白。探針結(jié)合至蛋白后，加入引發(fā)鏈，激發(fā)包括探針在內(nèi)的一系列的鏈置換反應，結(jié)果取決于細胞表面探針的種類和數(shù)量，從而區(qū)分細胞種類（Fig. 3a）。雖然在細胞表面標記兩種熒光標記的抗體也能獲得類似的結(jié)果，但是這項工作提供了更容易實現(xiàn)細胞狀態(tài)分選的方法，使同時分析多種分子標簽和將信息匯總為更容易翻譯的動態(tài)信號更有可能

23、實現(xiàn)。Douglas等組裝了DNA納米機器人，載帶可捕獲特定種類細胞的分子（60）。這種捕獲是通過適配體與原本不能捕獲細胞的Origami鏈雜交將細胞與Origami連接在一起的。適配體是選擇性結(jié)合特定蛋白或完整細胞的DNA或RNA（61，62），能夠通過鏈雜交將納米機器人與特定細胞結(jié)合，避免了將DNA與抗體結(jié)合。適配體也屬于捕獲機制的一部分，其與靶標蛋白結(jié)合后會發(fā)生構(gòu)象變化，從而使Origami可以捕獲。由兩種不同的適配體設計組合成的邏輯與門被用來將不同的熒光和藥物分子靶向至細胞（Fig. 3b）。有趣的是，一種相似的納米機器人被證明可以在蟑螂血流中發(fā)揮作用，并與其它納米機器人共同實現(xiàn)邏輯運

24、算（63）。Tan課題組也利用適配體構(gòu)建的邏輯門區(qū)分混合的多種細胞（64）。該課題組最近證明模塊化設計的邏輯門可以有更多的信號輸入，能結(jié)合更多的雜交鏈，可以降低脫靶效應（65）。DNA納米裝置不僅可以標記細胞表面的標簽，Origami的可尋址性可以在納米尺度上精確控制適配體鏈的組裝密度（66）。Shaw等DNA系統(tǒng)的可尋址性還可以為DNA進入細胞制造特殊身份。Francis和同事發(fā)展了一種將合成DNA固定至活細胞表面的方法，從而可以不受特意性分子數(shù)量限制的標記細胞（67）。合成糖處理細胞后變形并和細胞膜融為一體，可以作為“化學手臂”，然后磷酸化修飾的單鏈DNA通過Staudinger連接法連接

25、至“化學手臂”（68）。Gartner和Bertozzi證明這種方法可以用于將細胞組織形成三維細胞聚集結(jié)構(gòu)（69）。作為結(jié)構(gòu)指導膜功能的例子，作者將中國倉鼠細胞組織成“微膜”結(jié)構(gòu)，為造血原細胞（FL5.12）的生長提供生長因子IL-3。造血原細胞只有接合至分泌IL-3的細胞才能生長。Gartner課題組進一步將這一策略用于不同細胞間不同的Ras信號對這種微膜結(jié)構(gòu)變化的影響（70）。除了可以模仿細胞間的連接基元外，DNA還可以被用于模仿其它蛋白的功能。通過修飾親水基團，DNA結(jié)構(gòu)可以插入脂膜（71，72）。Burns等證明納米孔通道插入脂膜后具有較強的細胞毒性（73），可能是由于離子、營養(yǎng)物及其

26、它跨膜分子的自由移動導致。Figure 3| 細胞表面計算A，通過細胞表面標簽的原位評估進行細胞種類區(qū)分（59）。細胞先包裹DNA修飾的抗體（DNA回路、抗體以矩形和橢圓表示，DNA鏈用各種顏色的鏈表示），一個或兩個邏輯門結(jié)合至細胞后，通過表面標簽勾勒細胞輪廓。隨后加入的起始鏈（紅色）引發(fā)一系列鏈置換反應（完全互補的序列用同樣的顏色標志）?？扇芙獾膱蟾鎻秃衔镏荒芙Y(jié)合表面同時結(jié)合了兩種邏輯門的細胞。 B. 對特定細胞種類進行治療的分子機器人。概要圖介紹了管狀納米機器人響應細胞表面表達的特定抗原（鑰匙）的機制（60）。納米機器人最初由兩條適配體鎖鏈固定為一個封閉的結(jié)構(gòu)，只有當它遇到膜表面呈現(xiàn)兩種對

27、應抗體的細胞時才能打開，從而釋放藥物。底部：納米機器人關閉和打開狀態(tài)下的TEM圖片（比例尺：20nm）。DNA納米結(jié)構(gòu)作為藥物載運裝置討論至此不僅證明在細胞裂解液和培養(yǎng)基（以及昆蟲內(nèi)）中納米裝置和結(jié)構(gòu)的可能性，而且展示了納米系統(tǒng)與細胞表面蛋白相互作用的例子?，F(xiàn)在，我們回顧一下將納米裝置轉(zhuǎn)運至哺乳動物細胞內(nèi)的困難，并討論它們作為藥物轉(zhuǎn)運裝置的工作。DNA納米結(jié)構(gòu)的細胞攝取毛成德等通過構(gòu)建了葉酸修飾的DNA納米管，靶向很多癌細胞表面過表達的葉酸受體，成功證明DNA大結(jié)構(gòu)可以進入細胞。他們進一步在納米管上修飾熒光標簽確認納米管或者碎片是同過于受體結(jié)合進入細胞的（7）。Walsh等證明脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑存在

28、與否人類胚腎細胞對DNA四面體的攝取效率幾乎一樣，并通過FRET證明被細胞攝取很長時間后DNA四面體依然保持結(jié)構(gòu)完整（74）。Schuller等證明比DNA四面體大的DNA折紙結(jié)構(gòu)在無轉(zhuǎn)染試劑輔助下也能進入細胞（75）。標記于折紙上的熒光在內(nèi)化過程中可以示蹤折紙的攝取過程，但是無法證明折紙在細胞內(nèi)是否完整。應為DNA自身攜帶負電荷，然而令人驚奇的是在沒有轉(zhuǎn)染試劑的情況下細胞依然能攝取DNA納米結(jié)構(gòu)。梁樂等最近研究了DNA四面體細胞攝取機制，發(fā)現(xiàn)DNA四面體進入哺乳動物細胞是受體（特別是小窩蛋白）介導的內(nèi)吞。進入細胞后DNA四面體沿著微管運動，最終在溶酶體內(nèi)聚集。為了證明DNA納米結(jié)構(gòu)能夠靶向細

29、胞內(nèi)的不同位置，梁樂等在DNA四面體上修飾核定位序列，并在細胞核內(nèi)成功檢測到它們（76）。雖然DNA納米結(jié)構(gòu)可以有效的進入細胞，額外的修飾可以增強攝取效率或穩(wěn)定性。比如Mikkila等證明人類胚腎細胞攝取病毒衣殼蛋白包裹方塊DNA折紙的效率是lipofectamine2000轉(zhuǎn)染的10倍（77）。Perrault和Shih構(gòu)建了包裹在雙層脂內(nèi)的DNA八面體。八面體通過與修飾了脂質(zhì)分子的DNA鏈雜交在表面形成脂鞘（78）。被包裹的八面體不僅免疫活性降低，而且在小鼠內(nèi)循環(huán)內(nèi)比位包裹脂質(zhì)的八面體表現(xiàn)出更好的生物利用度（Fig. 1b）。藥物轉(zhuǎn)運CpG寡居脫氧核苷酸（ODNs）是可以刺激TLR9受體引

30、發(fā)強烈自身免疫的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤序列（79）。CpG ODNs是很好的治療藥物，因為可以完全通過雜交的方式將CpG直接連接至DNA納米結(jié)構(gòu)。Takakura和合作者構(gòu)建基于CpG的Y型DNA刺激免疫應答（80，81）。他們發(fā)現(xiàn)與常見的單鏈或雙鏈DNA相比，Y型DNA更容易被巨噬細胞攝取，因此可以增強免疫刺激。之后的研究證明修飾多個CpG ODN的多臂結(jié)構(gòu)（82）、DNA四面體（83）、DNA折紙（75）可以被有效攝取并刺激免疫應答。Chang和合作者以鏈霉親和素和CpG修飾DNA四面體構(gòu)建了合成疫苗（84）。鏈霉親和素模擬抗原，而CpG作為免疫佐劑增強免疫應答。這種結(jié)構(gòu)首先在小鼠類

31、巨噬細胞細胞系內(nèi)驗證，然后注射至小鼠體內(nèi)進行試驗。注射了該種合成疫苗的小鼠比注射聯(lián)合親霉素與CpG混合物的小鼠表達更多的抗聯(lián)合親霉素IgG抗體。DOX是一種廣泛應用于癌癥治療的細胞毒素類藥物，DNA納米結(jié)構(gòu)也已被設計成DOX轉(zhuǎn)運載體。之前已經(jīng)有工作證明納米顆粒包裹DOX可以降低副作用，同時有效增強體內(nèi)循環(huán)時間（85）。另外，DOX可以嵌入DNA，天生適合于DNA顆粒一起轉(zhuǎn)運，這一思路首先出現(xiàn)于DNA適配體領域（58）。Chang等首次利用DNA納米結(jié)構(gòu)（特別是20面體線框）轉(zhuǎn)運DOX至癌細胞（86）。Jiang等基于這一思路設計了三角和管狀DNA折紙轉(zhuǎn)運DOX至胸腺癌細胞，折紙的大尺寸大大增加

32、了DOX的載帶量，而且該復合結(jié)構(gòu)不僅對常規(guī)的癌細胞有毒性，對DOX抗藥癌細胞也作用（87）。Kim等同樣發(fā)現(xiàn)DNA四面體載帶的DOX也能作用于其他的抗DOX細胞系（88）。Hogberg及合作者發(fā)現(xiàn)通過改變DNA納米管折紙的結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)角度可以調(diào)控DOX的載帶、轉(zhuǎn)運和釋放（89）。Zhu等利用類似HCR的機制制備DNA聚合物來轉(zhuǎn)運DOX（90）。這種聚合物可以通過適配體識別癌細胞，抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。Zhang等通過尾靜脈注射載帶DOX的三角折紙至腫瘤小鼠發(fā)現(xiàn)相比相同計量的游離DOX，基于折紙的DOX轉(zhuǎn)運能更快的降低腫瘤的重量（91）。已經(jīng)有相關工作研究siRNA和ASO轉(zhuǎn)運。Keum等在DN

33、A四面體的一條邊鏈上插入一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反義序列證明ASO可以通過RNase H介導的序列特異性靶標mRNA降解降低蛋白表達量（92）。Lee等將siRNA和癌癥靶向序列雜交至DNA四面體，證明DNA四面體可以轉(zhuǎn)運siRNA至小鼠腫瘤（93）。他們證明在細胞培養(yǎng)環(huán)境中，DNA四面體上siRNA數(shù)量及相對位置會影響攝取與基因沉默效率。耦合了siRNA和靶向序列的DNA四面體在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高度的組織靶向性，大多聚集于腎臟和腫瘤，其它區(qū)域幾乎沒有。有一點需要說明的是體內(nèi)實驗和體外表征的四面體結(jié)合了不同數(shù)量的接合鏈。另外，文中并未提供DNA四面體在體內(nèi)穩(wěn)定性的相關數(shù)據(jù)，所以很難判定結(jié)構(gòu)在此種環(huán)境中

34、的結(jié)構(gòu)是否完整。最后，Weziman及合作者通過RCA制備長單鏈構(gòu)建了周期性納米帶狀折紙。納米帶進入細胞是通過網(wǎng)格蛋白介導的途徑。siRNA共價結(jié)合至納米帶后基因沉默效率高于兩者簡單的混合（94）。這部分討論的工作證明了：DNA納米結(jié)構(gòu)可以作為藥物轉(zhuǎn)運顆粒。DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運與其它納米顆?；蚓酆衔镛D(zhuǎn)運方法的區(qū)別主要是DNA納米結(jié)構(gòu)的可設計行，以及可實現(xiàn)形狀和尺寸的高度均一性。Figure 4|哺乳動物細胞內(nèi)的納米機器和邏輯門a,b, pH敏感的DNA納米裝置同時檢測弗林蛋白酶（Fu）和蛋白轉(zhuǎn)移酶（Tf）通路（97）。左：轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的DNA納米機器Tf-ITf受限于轉(zhuǎn)鐵蛋白通路。納米機器首先進入分

35、類內(nèi)體（SE），然后進入循環(huán)內(nèi)體（RE），最后回到細胞膜。DNA納米機器Fu-IFu靶向弗林蛋白酶通路：首先進入分類內(nèi)體，然后進入晚期內(nèi)體（LE），最后集中于反面高爾基體（TGN）。納米機器的熒光對不同內(nèi)體環(huán)境之間不同的pH敏感。右：DNA納米機器的pH敏感元件IFu（綠線，上部）和ITf（粉紅色線，底部）在低pH環(huán)境下呈現(xiàn)i構(gòu)型，熒光分子間發(fā)生FRET。 b，基于酶性DNA的與門在活細胞內(nèi)工作（113）。左：包含miR-21和miR-125b序列的合成輸入與邏輯與門一起顯微注射進入細胞。右：反應機制。輸入B首先結(jié)合至發(fā)卡（綠色部分），然后與輸入A作用將與門的兩個部件結(jié)合在一起。然后酶性DNA

36、剪切基質(zhì)，將熒光分子（紅點）從淬滅劑（黑點）附近釋放，發(fā)出熒光。活細胞內(nèi)的DNA動力學納米裝置這部分我們回顧在細胞內(nèi)工作、對特殊環(huán)境因素產(chǎn)生應答的動力學核酸裝置，包括對pH等環(huán)境變化敏感的裝置。最近還有工作檢測細胞內(nèi)特定信息的攜帶者RNA。最后，我們討論了核酸裝置的輸出對基因表達水平的調(diào)控，回顧了邏輯回路檢測和分析多分子標簽的早期工作。細胞環(huán)境傳感酶性DNA和適配體等功能核酸已被作為生物傳感器，廣泛應用于細胞內(nèi)分子水平的檢測。在這里我們重點介紹兩個將功能核酸傳感器與DNA納米馬達或結(jié)構(gòu)相結(jié)合的工作。Pei等構(gòu)建了一系列具有一條或兩條邊鏈可重構(gòu)的DNA四面體，這些邊鏈會隨著溶液內(nèi)的質(zhì)子、ATP和

37、水銀等特定分子的信號變化而發(fā)生形變（95）。他們采用FRET報告策略實現(xiàn)了可形變的DNA四面體隨著細胞內(nèi)ATP濃度的變化而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化。這證明將DNA納米結(jié)構(gòu)與細胞傳感器結(jié)合的可行性，這對潛在的智能藥物的載帶具有重要意義。Modi等通過相似的方法，利用DNA探針對活細胞內(nèi)體途徑各階段的pH進行成像檢測（96）。他們借鑒Yuke的DNA鑷子設計，并以對pH敏感的i四聯(lián)體作為開關來打開和關閉DNA鑷子（Fig. 4a）。傳感器被飛蟲血細胞內(nèi)吞后經(jīng)歷早期內(nèi)體（pH 6）和晚期內(nèi)體（pH 5.5），最終成為溶酶體（pH 5）。隨著內(nèi)體的酸性增強四聯(lián)體的熒光發(fā)生變化，從而間接的檢測pH。將傳感器與轉(zhuǎn)運蛋

38、白結(jié)合可以對特定受體介導的內(nèi)吞途徑進行成像。后續(xù)的研究中，該課題組證明pH敏感納米機器可以在同一個細胞內(nèi)同時追蹤多個通路（97）。細胞RNA檢測細胞的種類和健康狀況往往可以通過RNA水平反映出來，但是檢測處于細胞質(zhì)的mRNA和miRNA要求納米材料能夠進入細胞質(zhì)。另外，很多RNA是低拷貝的，必須進行信號放大。同時，RNA的二級結(jié)構(gòu)和RNA結(jié)合蛋白也會降低某些探針序列與靶標RNA的結(jié)合能力。活細胞成像領域的很多相關問題已經(jīng)被解決，同時發(fā)展了大量的可以在活細胞內(nèi)檢測特定mRNA的核酸探針。用于增強活細胞成像探針的化學和結(jié)構(gòu)修飾方法也可以用于增強DNA納米裝置在細胞內(nèi)的表現(xiàn)。莖上同時標記熒光分子和淬

39、滅劑的莖環(huán)式分子信標可能是目前用于活細胞mRNA成像研究最多的探針（98）。當探針處于游離狀態(tài)時，熒光處于淬滅狀態(tài)；而當探針與靶標mRNA雜交后，熒光轉(zhuǎn)換為發(fā)光狀態(tài)。在該設計為基礎可增強探針表現(xiàn)：加入更長額RNA靶向序列或轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）序列會促進探針從細胞核進入細胞質(zhì)，從而促進其與mRNA的相互作用（99-101）（Fig. 5a）?；瘜W修飾，特別是RNA 2甲氧基修飾被用與阻值細胞內(nèi)核酸酶的降解，增強探針的穩(wěn)定性（102）。類似于上面描述的FISH技術(shù)，多探針共定位可以降低本底熒光的干擾（101）。通過鏈和親霉素將幾條寡聚核苷酸鏈連接在一起的MTRIP等多價探針也可以增強信號（103

40、）（Fig. 5b）.Mirkin與合作者設計的納耀斑結(jié)構(gòu)首次在活細胞內(nèi)實現(xiàn)了與RNA的鏈置換反應（Fig. 5c）。納耀斑結(jié)構(gòu)以納米金為核心，外圍功能化修飾靶向mRNA或miRNA的DNA寡聚核苷酸鏈。較短的熒光標記的鏈與納耀斑結(jié)構(gòu)上的DNA鏈雜交，由于熒光分子靠近納米金，所以處于被淬滅的狀態(tài)（104）。與靶標結(jié)合后，短鏈被置換導致熒光信號增強。有一種修飾納耀斑結(jié)構(gòu)的技術(shù)是利用LNA修飾的短鏈來增強與靶標RNA的結(jié)合能力，雖然同是會導致靶標的降解（105，106）。Halo等進一步證明納耀斑結(jié)構(gòu)與流失細胞技術(shù)結(jié)合可在全血環(huán)境中分選循環(huán)的獲得癌細胞（107）。調(diào)節(jié)細胞RNAASO、酶性核酸和s

41、iRNA等非編碼核酸基因調(diào)節(jié)技術(shù)的出現(xiàn)不僅使得在細胞內(nèi)設計DNA納米系統(tǒng)成為可能，也可以與DNA納米裝置結(jié)合調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境。Afonin等證明可以自組裝成功能siRNA的兩種DNA:RNA復合物單獨存在細胞內(nèi)時是不能實現(xiàn)RNA干擾的（108）。反應是從兩個復合物中處于單鏈狀態(tài)的延伸鏈間的雜交開始，可能是通過四通鏈置換的方式進行的（109）。在體外培養(yǎng)的細胞和異種移植的腫瘤鼠模型中檢測到了siRNA活性。如果這種調(diào)控的反饋可以檢測特定的分子信標將會更加有趣。Benenson和同事首次在這一方向進行研究，他們設計了能與細胞裂解液組分相互作用的核酸鏈置換回路（110）：當需檢測的RNA加入裂解液后引

42、發(fā)鏈置換反應，生成有功能的siRNA。Pierce與合作者證明在無細胞生化分析中形成可被Dicer酶切的RNA的更普遍的規(guī)律（111）。Yokobayashi與合作者構(gòu)建了遺傳編碼的RNA莖環(huán)系統(tǒng)作為RNA干擾通路的基底，通過合成的外源轉(zhuǎn)運輸入的寡聚核苷酸鏈激活（112）。分子計算實現(xiàn)多輸入和多重分子回路是動態(tài)DNA納米技術(shù)的一個重大的成就。相比基于合成基因調(diào)控網(wǎng)絡的技術(shù)，DNA納米技術(shù)在實現(xiàn)細胞內(nèi)“生物計算”有什么優(yōu)勢？第一，DNA回路的組分的反應機制簡單，可在分子水平上進行合理設計，因此可以對反應通路進行高度的控制。第二，通過簡單的序列改變就可以設計新的或正交的組分，很易實現(xiàn)模塊化的擴大系

43、統(tǒng)規(guī)模。第三，與遺傳編碼蛋白組裝的系統(tǒng)相比，很多DNA裝置具有相對的小DNA足印。Shapiro課題組將酶性DNA邏輯與門和miRNA延伸的輸入一起顯微注射至胸腺癌細胞MCF-7中（113）（Fig. 4b）。為了防止核酸酶降解邏輯門，在3末端修飾額外的反向胸腺嘧啶。邏輯門的運算通過熒光顯微鏡測定，熒光僅在兩種輸入同時存在的情況下才能增強，這與邏輯與門的模式一致。DNA鏈置換邏輯門最近也已經(jīng)被用于檢測活細胞內(nèi)的mRNA聚合物?；隗w外已經(jīng)證明的設計（27），Hemphill和Deiters利用DNA組件的邏輯與門在肝癌細胞Huh7中檢測內(nèi)源mRNA miR-122和miR-21（114）。邏輯

44、門是通過標準的轉(zhuǎn)染方式進入細胞的，其僅在同時表達兩種輸入miRNA的細胞中才能激活。這部分所回顧的結(jié)果證明動態(tài)DNA裝置的設計在檢測細胞內(nèi)信息、通過嵌入分子控制回路來分析信息以及對細胞內(nèi)產(chǎn)生的變化等方面有快速的進步。Figure 5|活細胞內(nèi)mRNA成像a, 比率計生物分子信標（101）。頂部：與靶標mRNA的結(jié)合使得熒光分子（紅點）從淬滅劑（黑點）上釋放，從而發(fā)射高水平熒光。多個RBMB可以結(jié)合至異源mRNA 3UTR的串聯(lián)重復靶標，可以呈現(xiàn)活細胞內(nèi)的單拷貝mRNA。參照染料是掌控分子信標的轉(zhuǎn)運在不同細胞間的差異。底部：RBMB和FISH探針對HT1080細胞內(nèi)相同mRNA的熒光成像。圖1：

45、FISH探針；圖2：RBMB報告染料；圖3：包含細胞核染色（藍色）的合并圖像。b, 多標記四價RNA成像探針（MTRIPs）（103）。頂部：MTRIPs由多條熒光標記的短鏈與鏈合青霉素（紫色）連接組成。通過設計可以使多個MTRIPs雜交至一條mRNA上，這樣就可以在活細胞內(nèi)對單條mRNA成像。底部：A549細胞內(nèi)的-actin mRNA共聚焦成像。圖1：MTRIPs；圖2：競爭探針；圖3：包含細胞核染色（藍色）的合并圖像。c, 納耀斑結(jié)構(gòu)（104-107）。左：納耀斑結(jié)構(gòu)包含較長的“捕獲鏈”和熒光標記的“燃耗鏈”，熒光處于被納米金淬滅的狀態(tài)。當靶標mRNA與“捕獲鏈”結(jié)合，“燃耗鏈”被置換，

46、使得熒光增強。右：Hela細胞的熒光共聚焦成像，左側(cè)為對照納耀斑處理的細胞，右側(cè)為Survivin（靶標mRNA）納耀斑處理的細胞。遺傳編碼的結(jié)構(gòu)和裝置從基因治療到代謝管理，都需要應用植入來長期控制基因表達。活細胞內(nèi)通過遺傳編碼或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA和調(diào)控元素比瞬時轉(zhuǎn)運的合成DNA系統(tǒng)更適合。要通過改進將目前的DNA納米技術(shù)適于轉(zhuǎn)錄需要大量的實驗方法調(diào)整和分子設計。雖然這看上去是很大的挑戰(zhàn)，但其實已經(jīng)有了較大的突破。轉(zhuǎn)錄RNA的出現(xiàn)使得納米技術(shù)與合成生物學的界限越來越模糊，我們在這里強調(diào)幾個轉(zhuǎn)錄RNA相關的有趣工作?；跓o細胞RNA納米技術(shù)的二維和三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)五花八門，RNA能夠制備的結(jié)構(gòu)尺寸也在快速的變大（115-120）。比如Afonin等6條或者10條40bp左右的短鏈通過共轉(zhuǎn)錄和恒溫自組裝構(gòu)建RNA納米管（120）。最近，Geary，Rothemun