限制性內(nèi)切酶酶切注意事項(xiàng)

1、-作者xxxx-日期xxxx限制性內(nèi)切酶酶切注意事項(xiàng)【精品文檔】一、限制性內(nèi)切酶酶切注意事項(xiàng)    在進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)過程中，影響限制性酶切反應(yīng)效果的因素較多，要設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)，一般均應(yīng)考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件、反應(yīng)體積、底物性質(zhì)及星型反應(yīng)等因素。根據(jù)各種不同的條件，酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)一般應(yīng)注意以下問題：1. 大多數(shù)限制酶貯存在50甘油溶液中，以避免在-20條件下結(jié)冰。當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于12時(shí)，某些限制酶的識(shí)別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會(huì)抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。2. 濃縮的限制

2、酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長(zhǎng)期保存。3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當(dāng)用其它二價(jià)陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時(shí)，酶活性會(huì)被抑制，或改變酶的特異性，導(dǎo)致星型反應(yīng)。4. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：非最適的pH；Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；酶濃度大于25u/ug；鹽濃度降低；高濃度甘油的存在(>12%)；有機(jī)溶劑的存在。5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4u

3、g/ul。6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中，根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對(duì)不同的限制酶，各廠家均有一最大的消化量指標(biāo)可參考。7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時(shí)切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應(yīng)；使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。8. 用同一種酶切割不同的DNA時(shí)，所需酶量不同，可根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與DNA存在位點(diǎn)的數(shù)目比較后，決定用酶量。對(duì)于超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂

4、糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。9. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個(gè)重要因素，所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。12.要保證酶作用時(shí)的最佳反應(yīng)條件(ph, 溫度)和底物用量，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。13.反應(yīng)取酶時(shí)應(yīng)使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。14.高于37或需長(zhǎng)時(shí)間保溫時(shí)，可

5、加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。15.反應(yīng)混合物混勻時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。16.反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。17.用已硅化的離心管進(jìn)行酶切反應(yīng)，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；若需進(jìn)一步反應(yīng)(如連接，切割等)，可將反應(yīng)管置65保溫20-30分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)?？捎梅?氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作。19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時(shí)請(qǐng)查明相關(guān)條件及數(shù)

6、據(jù)。二、限制性酶解中常見的問題及解決措施：限制性酶切割DNA底物的操作過程中，會(huì)出現(xiàn)一些問題，產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非最佳狀態(tài)，包括DNA的純度和特性，反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積、反應(yīng)時(shí)間及溫度等。(下一頁)分子生物學(xué)產(chǎn)品常見問題分析 (2)(接上頁) 問題原因解決辦法DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割1) 內(nèi)切酶失活標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性2) DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA3) 條件不適（試劑、溫度）檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳4) DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)

7、菌菌株5) DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增6) DNA位點(diǎn)上存在其它修飾將DNA底物與DAN混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證7) DNA不存在該酶識(shí)別順序換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證DNA切割不完全1) 內(nèi)切酶活性下降用5-10倍量過量消化2) 內(nèi)切酶稀釋不正確用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶3) DNA不純，反應(yīng)條件不佳同上4) 內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上反應(yīng)前離心數(shù)秒6) 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)將內(nèi)切酶

8、稀釋，增大取樣體積7) 酶切后DNA粘末端退火電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷8) 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩9) 過度稀釋使酶活性降低適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏10)反應(yīng)條件不適使用最佳反應(yīng)體系11)識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序加大酶量5-10倍DNA片段數(shù)目多于理倫值1) 內(nèi)切酶星狀活性檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量2) 其它內(nèi)切酶污染用DNA作底物檢查酶切結(jié)果3) 底物中含其它DNA雜質(zhì)電泳檢查DNA，換用其它酶切，

9、純化DNA片段酶切后沒有觀察到DNA片段的存在1) DNA定量錯(cuò)誤（如RNA含量較高）用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活1) 保存溫度不合適內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在-20低溫保存2) 以稀釋形式保存稀釋酶液不宜長(zhǎng)期存放，應(yīng)一次使用3) 貯藏緩沖液不適當(dāng)使用廠家推薦的貯藏緩沖液4) 低蛋白濃度內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一1) DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)電泳前上樣液65加熱5min，并加入0.1%的SDS

10、，酚/氯仿抽提純化2) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶酶切后的DNA片段連接效率低1) 含磷酸鹽的濃度高透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽2) 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶延長(zhǎng)滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端連接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收DNA5) 連接緩沖液不合適重新配制連接緩沖液三、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)問題分析：?jiǎn)栴}原因解決辦法帶弱或無DNA帶1) 上樣DNA的量不夠增加DNA的上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝膠減短電泳時(shí)間，

11、降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度4) 對(duì)于EB染色的DNA，所用紫外光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm），紫外燈增強(qiáng)靈敏度DNA帶缺失1) 小DNA帶走出凝膠減短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度2) 分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度3) DNA 變性電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA4) 巨大DNA鏈，凝膠電泳不合適在脈沖電聲凝膠電泳上分析DNA帶模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) DNA上樣量過多減少凝膠中DNA上樣量3) 所用電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30,巨大DNA鏈，溫度應(yīng)15，核查所用電泳緩沖液是否有

12、足夠的緩沖能力4) DNA樣含鹽過高電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽5) 有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白6) DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA不規(guī)則DNA帶遷移1) 對(duì)于/Hind III片段COS位點(diǎn)復(fù)性電泳前加熱DNA 65加熱5-10分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘2) 電泳條件不合適電泳電壓不超過20V/cm，溫度30，電泳緩沖液有足夠的緩沖能力3) DNA變性以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱以/Hind III為代表的DNA酶切片段用作電泳分析中的分子量標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)發(fā)現(xiàn)電泳后分子量條帶不對(duì)的問題，解釋原因如下：在Lambda DNA分子的左右

13、臂存在著12個(gè)堿基組成的具有互補(bǔ)順序的單鏈突出端-COS位點(diǎn)，COS位點(diǎn)的退火復(fù)性，在DNA片段電泳分離時(shí)會(huì)出現(xiàn)問題，含左右臂片段在膠上應(yīng)出現(xiàn)的地方條帶會(huì)減弱或完全看不到，而復(fù)性的左右臂片段會(huì)結(jié)合成大的片段，即在較大的分子量區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)額外的條帶，這就造成了不正常的帶型。解決以上問題的辦法，是在電泳之前，把DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)67加熱約10分鐘，然后立即放入冰浴中驟冷，待樣品冷卻后上樣。這樣即可解離復(fù)性的粘性末端，使電泳過程DNA片段形成正常的帶型分布。四、凝膠電泳操作注意事項(xiàng)：1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5. 電泳系統(tǒng)