微生物實驗器材與基本操作

1、微生物實驗器材與基本操作微生物實驗器材與基本操作 內(nèi)容實驗室的基本設備培養(yǎng)器皿準備培養(yǎng)基的制備滅菌與消毒微生物的無菌操作與檢查實驗室的基本設備玻璃試管 管壁必須較厚，沒有翻口接種工具培養(yǎng)皿的準備（一）清洗 (清潔的玻璃器皿是得到正確實驗結果的重要條件之 一）目的：除污垢（灰塵、油污、無機鹽）洗滌劑：洗衣粉 洗潔精 玻璃儀器的清洗u新購買的玻璃器皿的清洗（表面附有游離的堿性物質(zhì)）u比色皿的清洗 不可用強堿，也不可用超聲清洗 用洗液浸泡，再用自來水沖洗，應內(nèi)外不掛水珠使用過的玻璃器皿的清洗u一般玻璃器皿u染菌的玻璃器皿 121高壓蒸汽滅菌，2030minu染菌的移液管 使用后立即放入5%石炭酸溶液

2、中浸泡數(shù)小時塑料器皿的清洗硅膠塞：新購置的硅膠塞帶有帶量的滑石粉，用自來 水沖洗，再用2%NaOH溶液煮1020min。再 用自來水沖洗，然后再用5%鹽酸溶液浸泡 30min，最后再用自來水沖洗。含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿u用玻璃棒將瓊脂培養(yǎng)基刮下u瓊脂培養(yǎng)基已干燥 將器皿放入少量的水中煮沸，使瓊脂熔化后趁熱倒出洗滌后培養(yǎng)皿的放置（二）包扎（1）培養(yǎng)皿的包扎 洗凈晾干后的培養(yǎng)皿，用舊報紙包扎，每包610套。（2）吸管的包扎（3）試管的包扎 塞上合適的試管塞（塞子的1/21/3進入試管），然 后710支一捆用報紙包扎，滅菌。（4）試劑瓶的包扎 用報紙或牛皮紙包扎后，滅菌。 （5）三角瓶的包扎 塞上

3、合適的試管的塞，或蓋上8層紗布，外加一層報 紙，用棉繩包扎后滅菌。 （6）吸頭和Eppendorf管 吸頭根據(jù)不同的規(guī)格戴手套加入不同的盒子； Ed管放入飯盒中，滅菌，50烘干后備用。培養(yǎng)基的制備按物理狀態(tài)分：u液體培養(yǎng)基u 固體培養(yǎng)基 1.5%2%凝固劑 u 半固體培養(yǎng)基 少量凝固劑（0.2%0.7%） 常用培養(yǎng)基成分一般細菌 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 真菌 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：放線菌 高氏1號培養(yǎng)基：霉菌 查氏培養(yǎng)基：酵母菌 （1）PDA （2）麥芽汁培養(yǎng)基 （3）豆汁葡萄糖培養(yǎng)基 （4）YPD培養(yǎng)基 1% Yeast Extract（酵母膏） 2% Peptone（蛋白胨） 2

4、% Dextrose (glucose)（葡萄糖） 若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉（一）液體培養(yǎng)基的配制1、稱量2、溶解 加水至總容積的4/5左右，慢慢攪拌使其溶解。 如有需要，可加熱。3、調(diào)PH 培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫用PH試紙測PH， 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)PH。（緩 慢少量多加攪拌）再加水到所需的量。4、分裝 分裝于三角瓶時，分裝量不得超過容積的1/2。5、封口 瓶口處蓋上68層紗布，瓶口布外包一層牛皮 紙或兩層報紙，用棉繩捆綁。6、滅菌 做好標記，放入高壓滅菌鍋中120 ，20min7、冷卻后接種（二）平板培養(yǎng)基的配制1、稱量 按比例稱取一定量的瓊脂

5、粉（1.5%2%）， 放入三角瓶中。2、按液體培養(yǎng)基的配制13步操作，調(diào)好PH，定容3、分裝 分裝量不得超過三角瓶的1/24、封口 68層紗布，再外包一層牛皮紙或兩層報紙5、滅菌 做好標記，高壓滅菌鍋中120 ，20min6、冷卻 放入55烘箱或水浴中，溫度降至55，進 入無菌室倒平板。7、倒平板 在超凈臺的酒精燈火焰旁的無菌區(qū)內(nèi)進行操作，右手那裝有培養(yǎng)基的三角瓶，拔出試管塞；左手將培養(yǎng)皿的蓋在酒精燈火焰旁打開一條縫，讓三角瓶口深入；倒入培養(yǎng)基，蓋好后順著超凈臺邊緣將平板推入，平放在超凈臺上。8、倒置 冷卻至培養(yǎng)基凝固后，倒置平板，裝入保鮮袋中扎好，放入4 冰箱中保存?zhèn)溆?。（三）斜面培養(yǎng)基的配

6、制1、按液體培養(yǎng)基配制13步操作，調(diào)好PH，定容2、稱量 稱取1.5%2%的瓊脂粉，加入已溶解的藥品中，再熔 化 瓊脂（控制火力，防止培養(yǎng)基溢出，不斷攪拌）， 最后補足所失的水分。3、分裝 趁熱分裝于試管內(nèi)，分裝量不超過高度的1/51/4，不 要污染試管塞。4、滅菌 加試管塞，7支成一捆，試管塞外包一層牛皮紙，或兩 層報紙，貼上標簽。高壓蒸汽鍋中121 ，20min。5、擺斜面 溫度降至55 左右，將滅菌后的斜面培養(yǎng)基，趁熱放于玻璃棒或移液管上，調(diào)整斜度，培養(yǎng)基的斜面不超過試管長度的1/2。6、保存 冷卻后，裝入保鮮袋中扎好，置于4 冰箱中。（四）半固體培養(yǎng)基的配制1、稱量 稱取0.7%左右的

7、瓊脂粉2、同固體培養(yǎng)基相同（五）無菌水的準備1、100ml三角瓶（裝有玻璃珠），裝雙蒸水 45ml2、試管裝4.5ml雙蒸水3、塞上管塞或蓋上塑料蓋子4、包扎、滅菌5、備用注意事項1、藥匙不要混用2、PH：(1)調(diào)PH要逐步滴加，勿使過酸過堿，破壞培養(yǎng) 基中的某些成分，防止回調(diào)或反復調(diào)整PH。 （2）滅菌后PH會發(fā)生改變，要注意檢測滅菌后的 PH狀況。（較特殊的用于確定最適PH，最值PH）3、瓊脂：待液體培養(yǎng)基煮沸后，再加入瓊脂。4、分裝：避免培養(yǎng)基粘到管口或瓶口，如不小心粘上， 應立即擦干凈。5、制斜面和平板的培養(yǎng)基：溫度不宜太高，一般60左右。6、試管塞：1/22/3進入試管內(nèi)。7、液體培

8、養(yǎng)：三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基量一般為1/51/3,不應 超過容積的1/2。8、斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基裝量為試管高度的1/51/4，滅菌 后制成的斜面長度不超過1/2。9、半固體培養(yǎng)：培養(yǎng)基為試管高度的1/3,滅菌后垂直 待凝。10、平板：100ml 56個平板 一個平板大約1520ml培養(yǎng)基，鋪滿皿底高 1.52mm滅菌與消毒滅菌 采用強烈的理化因素，使微生物永遠失去其生長繁殖的能力，如121 高壓滅菌20min。消毒 采用一種較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌。如用70%酒精進行皮膚表面的消毒。防腐 利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，防止食品發(fā)生霉腐。物理消毒滅菌1

9、、干熱滅菌法 原理：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性 方法：火焰灼燒滅菌&熱空氣滅菌 特點：溫度高160180，2h2、濕熱滅菌法 原理: 高溫使原生質(zhì)中的蛋白質(zhì)凝固變性，破壞酶 的活性。 方法：高壓蒸汽滅菌法3、紫外線滅菌法 原理：（1）誘導胸腺嘧啶二聚體形成，抑制DNA 復制； （2）輻射使O2電離為O，然后形成O3， 或是水 形成H2O2； 缺點：殺菌能力較強，但穿透力弱，一張薄紙， 玻璃或水層就可濾過大部分的紫外線。 對象：空氣和表面殺菌4、過濾除菌 原理：通過機械作用濾去液體或其氣體中的細菌。 對象：不能采用加熱滅菌的物質(zhì)，如維生素、血 清、抗生素、酶液等 缺點：濾量有限，只適用于實驗室

10、小量溶液 （20ml以下）的過濾除菌。5、化學藥劑消毒滅菌高壓蒸汽滅菌法1、在高壓鍋內(nèi)加入一定量的水，將包扎好的物品放入物品框中。2、接通電源，進行加熱。3、將排氣閥打開，待排出大氣后關閉排氣閥；或關閉排氣閥，待壓強升到0.5kg/cm2時，再打開排氣閥，待壓強回到0時關閉排氣閥。4、壓強達到1kg/cm2時，滅菌鍋內(nèi)的溫度為121，維持2030min。5、滅菌時間一到，切斷電源，待壓強降至0打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。注意事項1、加上鍋底水，防止干燒；2、鍋內(nèi)物品之間留有縫隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜過多，過擠，鍋內(nèi)應留出三分之一空間。以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。4、三

11、角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。5、盡可能排出鍋內(nèi)冷空氣；6、滅菌結束后，要緩慢放氣降壓（尤其是液體培養(yǎng)基滅菌），切勿突然打開排氣閥降壓，會引起瓶子爆破或培養(yǎng)基沸騰沖出容器，污染試管塞，瓶口布。微生物的無菌操作實驗前無菌室的紫外線殺菌 注意事項1、操作區(qū)消毒 ：無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。2、消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。3、實驗用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精

12、擦拭后才能帶入無菌操作臺，同時紫外線消毒。4、操作：開啟無菌操作臺風機運轉10分鐘后，才可開始實驗操作，動作要準確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動，增加污染機會。5、必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通。6、實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。7、為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。8、工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。9、實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺，如需要繼續(xù)進行下一個實驗，則

13、用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運轉10分鐘后，才可進行下一個實驗操作。倒平板 涂棒涂布1、超凈臺上酒精燈旁，取0.10.2ml，加到凝固好的培養(yǎng)基上。2、涂棒浸入酒精中，取出后在火焰上過一下，點燃酒精后，離開火焰。3、等涂棒上酒精燃燒完畢后，在火焰邊上，涂棒在培養(yǎng)皿內(nèi)側稍做停留。4、涂棒放在平板上不接觸細胞的地方進一步冷卻。5、在平板上緩慢旋轉涂布細胞，使其分散均勻。（不可將涂棒往下壓，利用涂棒自身重力產(chǎn)生壓力）6、涂布完畢后，適當?shù)臏囟龋ㄈ?537）下倒置培養(yǎng)。接種環(huán)接種1、接種環(huán)在酒精燈外焰上充分燒紅，金屬棒部分轉動著通過火焰3次。2、火焰邊上打開菌種試管或培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基上或玻璃管壁上稍作冷卻。3、挑取菌體，迅速接到新的培養(yǎng)基上。4、接種環(huán)通過火焰燒紅滅菌，還原。5、適當條件下培養(yǎng)移液器接種1、將移液器容量調(diào)到所需數(shù)值，豎直裝上合適吸頭。2、酒精燈旁，左手拿培養(yǎng)液，右手小指與手掌夾住培養(yǎng)液的蓋子、打開培養(yǎng)液的蓋子，洗去一定量的樣品，蓋回蓋子。3、在酒精燈旁，將樣品接種到試管或三角瓶中。4、輕輕混勻，放入合適溫度