微生物實(shí)驗(yàn)器材與基本操作

1、微生物實(shí)驗(yàn)器材與基本操作微生物實(shí)驗(yàn)器材與基本操作 內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備培養(yǎng)器皿準(zhǔn)備培養(yǎng)基的制備滅菌與消毒微生物的無(wú)菌操作與檢查實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備玻璃試管 管壁必須較厚，沒有翻口接種工具培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備（一）清洗 (清潔的玻璃器皿是得到正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要條件之 一）目的：除污垢（灰塵、油污、無(wú)機(jī)鹽）洗滌劑：洗衣粉 洗潔精 玻璃儀器的清洗u新購(gòu)買的玻璃器皿的清洗（表面附有游離的堿性物質(zhì)）u比色皿的清洗 不可用強(qiáng)堿，也不可用超聲清洗 用洗液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，應(yīng)內(nèi)外不掛水珠使用過的玻璃器皿的清洗u一般玻璃器皿u染菌的玻璃器皿 121高壓蒸汽滅菌，2030minu染菌的移液管 使用后立即放入5%石炭酸溶液

2、中浸泡數(shù)小時(shí)塑料器皿的清洗硅膠塞：新購(gòu)置的硅膠塞帶有帶量的滑石粉，用自來(lái) 水沖洗，再用2%NaOH溶液煮1020min。再 用自來(lái)水沖洗，然后再用5%鹽酸溶液浸泡 30min，最后再用自來(lái)水沖洗。含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿u用玻璃棒將瓊脂培養(yǎng)基刮下u瓊脂培養(yǎng)基已干燥 將器皿放入少量的水中煮沸，使瓊脂熔化后趁熱倒出洗滌后培養(yǎng)皿的放置（二）包扎（1）培養(yǎng)皿的包扎 洗凈晾干后的培養(yǎng)皿，用舊報(bào)紙包扎，每包610套。（2）吸管的包扎（3）試管的包扎 塞上合適的試管塞（塞子的1/21/3進(jìn)入試管），然 后710支一捆用報(bào)紙包扎，滅菌。（4）試劑瓶的包扎 用報(bào)紙或牛皮紙包扎后，滅菌。 （5）三角瓶的包扎 塞上

3、合適的試管的塞，或蓋上8層紗布，外加一層報(bào) 紙，用棉繩包扎后滅菌。 （6）吸頭和Eppendorf管 吸頭根據(jù)不同的規(guī)格戴手套加入不同的盒子； Ed管放入飯盒中，滅菌，50烘干后備用。培養(yǎng)基的制備按物理狀態(tài)分：u液體培養(yǎng)基u 固體培養(yǎng)基 1.5%2%凝固劑 u 半固體培養(yǎng)基 少量凝固劑（0.2%0.7%） 常用培養(yǎng)基成分一般細(xì)菌 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 真菌 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：放線菌 高氏1號(hào)培養(yǎng)基：霉菌 查氏培養(yǎng)基：酵母菌 （1）PDA （2）麥芽汁培養(yǎng)基 （3）豆汁葡萄糖培養(yǎng)基 （4）YPD培養(yǎng)基 1% Yeast Extract（酵母膏） 2% Peptone（蛋白胨） 2

4、% Dextrose (glucose)（葡萄糖） 若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉（一）液體培養(yǎng)基的配制1、稱量2、溶解 加水至總?cè)莘e的4/5左右，慢慢攪拌使其溶解。 如有需要，可加熱。3、調(diào)PH 培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫用PH試紙測(cè)PH， 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)PH。（緩 慢少量多加攪拌）再加水到所需的量。4、分裝 分裝于三角瓶時(shí)，分裝量不得超過容積的1/2。5、封口 瓶口處蓋上68層紗布，瓶口布外包一層牛皮 紙或兩層報(bào)紙，用棉繩捆綁。6、滅菌 做好標(biāo)記，放入高壓滅菌鍋中120 ，20min7、冷卻后接種（二）平板培養(yǎng)基的配制1、稱量 按比例稱取一定量的瓊脂

5、粉（1.5%2%）， 放入三角瓶中。2、按液體培養(yǎng)基的配制13步操作，調(diào)好PH，定容3、分裝 分裝量不得超過三角瓶的1/24、封口 68層紗布，再外包一層牛皮紙或兩層報(bào)紙5、滅菌 做好標(biāo)記，高壓滅菌鍋中120 ，20min6、冷卻 放入55烘箱或水浴中，溫度降至55，進(jìn) 入無(wú)菌室倒平板。7、倒平板 在超凈臺(tái)的酒精燈火焰旁的無(wú)菌區(qū)內(nèi)進(jìn)行操作，右手那裝有培養(yǎng)基的三角瓶，拔出試管塞；左手將培養(yǎng)皿的蓋在酒精燈火焰旁打開一條縫，讓三角瓶口深入；倒入培養(yǎng)基，蓋好后順著超凈臺(tái)邊緣將平板推入，平放在超凈臺(tái)上。8、倒置 冷卻至培養(yǎng)基凝固后，倒置平板，裝入保鮮袋中扎好，放入4 冰箱中保存?zhèn)溆?。（三）斜面培養(yǎng)基的配

6、制1、按液體培養(yǎng)基配制13步操作，調(diào)好PH，定容2、稱量 稱取1.5%2%的瓊脂粉，加入已溶解的藥品中，再熔 化 瓊脂（控制火力，防止培養(yǎng)基溢出，不斷攪拌）， 最后補(bǔ)足所失的水分。3、分裝 趁熱分裝于試管內(nèi)，分裝量不超過高度的1/51/4，不 要污染試管塞。4、滅菌 加試管塞，7支成一捆，試管塞外包一層牛皮紙，或兩 層報(bào)紙，貼上標(biāo)簽。高壓蒸汽鍋中121 ，20min。5、擺斜面 溫度降至55 左右，將滅菌后的斜面培養(yǎng)基，趁熱放于玻璃棒或移液管上，調(diào)整斜度，培養(yǎng)基的斜面不超過試管長(zhǎng)度的1/2。6、保存 冷卻后，裝入保鮮袋中扎好，置于4 冰箱中。（四）半固體培養(yǎng)基的配制1、稱量 稱取0.7%左右的

7、瓊脂粉2、同固體培養(yǎng)基相同（五）無(wú)菌水的準(zhǔn)備1、100ml三角瓶（裝有玻璃珠），裝雙蒸水 45ml2、試管裝4.5ml雙蒸水3、塞上管塞或蓋上塑料蓋子4、包扎、滅菌5、備用注意事項(xiàng)1、藥匙不要混用2、PH：(1)調(diào)PH要逐步滴加，勿使過酸過堿，破壞培養(yǎng) 基中的某些成分，防止回調(diào)或反復(fù)調(diào)整PH。 （2）滅菌后PH會(huì)發(fā)生改變，要注意檢測(cè)滅菌后的 PH狀況。（較特殊的用于確定最適PH，最值PH）3、瓊脂：待液體培養(yǎng)基煮沸后，再加入瓊脂。4、分裝：避免培養(yǎng)基粘到管口或瓶口，如不小心粘上， 應(yīng)立即擦干凈。5、制斜面和平板的培養(yǎng)基：溫度不宜太高，一般60左右。6、試管塞：1/22/3進(jìn)入試管內(nèi)。7、液體培

8、養(yǎng)：三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基量一般為1/51/3,不應(yīng) 超過容積的1/2。8、斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基裝量為試管高度的1/51/4，滅菌 后制成的斜面長(zhǎng)度不超過1/2。9、半固體培養(yǎng)：培養(yǎng)基為試管高度的1/3,滅菌后垂直 待凝。10、平板：100ml 56個(gè)平板 一個(gè)平板大約1520ml培養(yǎng)基，鋪滿皿底高 1.52mm滅菌與消毒滅菌 采用強(qiáng)烈的理化因素，使微生物永遠(yuǎn)失去其生長(zhǎng)繁殖的能力，如121 高壓滅菌20min。消毒 采用一種較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌。如用70%酒精進(jìn)行皮膚表面的消毒。防腐 利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，防止食品發(fā)生霉腐。物理消毒滅菌1

9、、干熱滅菌法 原理：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性 方法：火焰灼燒滅菌&熱空氣滅菌 特點(diǎn)：溫度高160180，2h2、濕熱滅菌法 原理: 高溫使原生質(zhì)中的蛋白質(zhì)凝固變性，破壞酶 的活性。 方法：高壓蒸汽滅菌法3、紫外線滅菌法 原理：（1）誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體形成，抑制DNA 復(fù)制； （2）輻射使O2電離為O，然后形成O3， 或是水 形成H2O2； 缺點(diǎn)：殺菌能力較強(qiáng)，但穿透力弱，一張薄紙， 玻璃或水層就可濾過大部分的紫外線。 對(duì)象：空氣和表面殺菌4、過濾除菌 原理：通過機(jī)械作用濾去液體或其氣體中的細(xì)菌。 對(duì)象：不能采用加熱滅菌的物質(zhì)，如維生素、血 清、抗生素、酶液等 缺點(diǎn)：濾量有限，只適用于實(shí)驗(yàn)室

10、小量溶液 （20ml以下）的過濾除菌。5、化學(xué)藥劑消毒滅菌高壓蒸汽滅菌法1、在高壓鍋內(nèi)加入一定量的水，將包扎好的物品放入物品框中。2、接通電源，進(jìn)行加熱。3、將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓強(qiáng)升到0.5kg/cm2時(shí)，再打開排氣閥，待壓強(qiáng)回到0時(shí)關(guān)閉排氣閥。4、壓強(qiáng)達(dá)到1kg/cm2時(shí)，滅菌鍋內(nèi)的溫度為121，維持2030min。5、滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓強(qiáng)降至0打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。注意事項(xiàng)1、加上鍋底水，防止干燒；2、鍋內(nèi)物品之間留有縫隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜過多，過擠，鍋內(nèi)應(yīng)留出三分之一空間。以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。4、三

11、角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。5、盡可能排出鍋內(nèi)冷空氣；6、滅菌結(jié)束后，要緩慢放氣降壓（尤其是液體培養(yǎng)基滅菌），切勿突然打開排氣閥降壓，會(huì)引起瓶子爆破或培養(yǎng)基沸騰沖出容器，污染試管塞，瓶口布。微生物的無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)前無(wú)菌室的紫外線殺菌 注意事項(xiàng)1、操作區(qū)消毒 ：無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。2、消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。3、實(shí)驗(yàn)用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精

12、擦拭后才能帶入無(wú)菌操作臺(tái)，同時(shí)紫外線消毒。4、操作：開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才可開始實(shí)驗(yàn)操作，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。5、必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時(shí)移出,以利氣體流通。6、實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。7、為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。8、工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。9、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，則

13、用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，再讓無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才可進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作。倒平板 涂棒涂布1、超凈臺(tái)上酒精燈旁，取0.10.2ml，加到凝固好的培養(yǎng)基上。2、涂棒浸入酒精中，取出后在火焰上過一下，點(diǎn)燃酒精后，離開火焰。3、等涂棒上酒精燃燒完畢后，在火焰邊上，涂棒在培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)稍做停留。4、涂棒放在平板上不接觸細(xì)胞的地方進(jìn)一步冷卻。5、在平板上緩慢旋轉(zhuǎn)涂布細(xì)胞，使其分散均勻。（不可將涂棒往下壓，利用涂棒自身重力產(chǎn)生壓力）6、涂布完畢后，適當(dāng)?shù)臏囟龋ㄈ?537）下倒置培養(yǎng)。接種環(huán)接種1、接種環(huán)在酒精燈外焰上充分燒紅，金屬棒部分轉(zhuǎn)動(dòng)著通過火焰3次。2、火焰邊上打開菌種試管或培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基上或玻璃管壁上稍作冷卻。3、挑取菌體，迅速接到新的培養(yǎng)基上。4、接種環(huán)通過火焰燒紅滅菌，還原。5、適當(dāng)條件下培養(yǎng)移液器接種1、將移液器容量調(diào)到所需數(shù)值，豎直裝上合適吸頭。2、酒精燈旁，左手拿培養(yǎng)液，右手小指與手掌夾住培養(yǎng)液的蓋子、打開培養(yǎng)液的蓋子，洗去一定量的樣品，蓋回蓋子。3、在酒精燈旁，將樣品接種到試管或三角瓶中。4、輕輕混勻，放入合適溫度