植物組織培養(yǎng)：玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法及其研究進展

1、玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法及其研究進展摘要 隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入發(fā)展,大豆、玉米、油菜和棉花等轉(zhuǎn)基因作物大面積商品化生產(chǎn)為全球的糧食安全做出了巨大貢獻。近年來，玉米的轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速,農(nóng)藝性狀改良涉及抗除草劑、抗蟲、抗病、抗旱、抗鹽和品質(zhì)改良等，其中抗除草劑和抗蟲玉米已成為主要的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物。本文綜述了玉米遺傳轉(zhuǎn)化的幾種常用方法且對其利弊進行討論，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進展及應(yīng)用，展望了玉米轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展方向。 關(guān)鍵詞 玉米；遺傳轉(zhuǎn)化方法；轉(zhuǎn)基因技術(shù)；應(yīng)用 玉米是重要的糧食、飼料，同時也是現(xiàn)代工業(yè)的重要原料。隨著畜牧業(yè)、工業(yè)的 發(fā)展以及世界人口的增長，玉米在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有越來越重要的地位。19

2、98年 以來，玉米已超過水稻和小麥成為全球第一大作物1。建國以來，我國玉米播種 面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)量都呈持續(xù)增長趨勢，但與美國等玉米生產(chǎn)大國還存在較大差 距。玉米總需求的斷攀升使得玉米生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。自1988年Rhodes等2首次獲得玉米轉(zhuǎn)基因完整植株以來，玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了較大的發(fā)展，不但許多有價值的基因轉(zhuǎn)入玉米 , 而且轉(zhuǎn)基因方法也出現(xiàn)了多樣化：基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法等。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善與發(fā)展，更多的優(yōu)良外源基因?qū)⒈挥糜谟衩椎倪z傳改良，并且為闡述單子葉植物基因表達調(diào)控機理提供了新方法。而且，隨著研究的深入，在降低轉(zhuǎn)化受體依賴性、提高轉(zhuǎn)化效率、提出新型轉(zhuǎn)化方法等方面取

3、得了重要的進展。 1 玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法 1.1 電激法 電激法轉(zhuǎn)化外源基因是用短時、高脈沖電處理細胞，使細胞膜出現(xiàn)可恢復(fù)性孔隙，從而產(chǎn)生新的滲透點(3-4 nm)，為外源DNA進入細胞提供了通路。電激法不受宿主限制，可以用于原生質(zhì)體、愈傷組織、胚性懸浮細胞系、幼胚等，操作簡單，但轉(zhuǎn)化效率低，在玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究初期應(yīng)用較為廣泛。 1 1.2 花粉管通道法 花粉管通道法是在植物整體水平進行目的基因DNA片段的導(dǎo)入，直接獲得轉(zhuǎn)化種子，通過后代的篩選獲得帶有目的基因的片段。由于其利用自身的生殖系統(tǒng)作為載體，被眾多研究者采用?；ǚ酃芡ǖ婪o基因型限制且易實現(xiàn)大規(guī)?；蜣D(zhuǎn)化，而且不需要昂貴的儀器設(shè)備和

4、組織培養(yǎng)技術(shù)，但是產(chǎn)生變異后代的類型特別豐富，因此對后代的檢測比較繁瑣。 1.3 PEG法 1993年,Golovkin等3用PEG法將H89的原生質(zhì)體分別與含有CaMV35S啟動子和鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)突變基因( 氨甲喋呤抗性 )的質(zhì)粒 pMP和pDMP共培養(yǎng),其中pDMP的mdhfr基因插入了玉米 Ds1 轉(zhuǎn)座子，用氨甲喋呤篩選得到抗性愈傷組織，在不含激素的培養(yǎng)基上再生出植株。Omirulleh等4 用PEG法將外源基因?qū)氲接蒆E8的懸浮細胞系分離得到的原生質(zhì)體，建立了植株再生的轉(zhuǎn)化體系。PEG法轉(zhuǎn)化效率較高，但必須以裸露的原生質(zhì)體為受體，而且還受到基因型的限制。 1.4 基因槍

5、法 基因槍法又稱微粒槍法、微粒轟擊法(gene 2 gun,particlegun,particlebombard 2 ment)，是依賴高速度的金屬微粒將外源基因引入活細胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。它利用高速運動的金屬粒子，可以非特異地將外源基因?qū)胫参锏募毎?、組織和器官，不再受到受體基因型的限制，又能避開原生質(zhì)體再生的障礙，為玉米遺傳轉(zhuǎn)化掀開了新的一頁。 1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、轉(zhuǎn)化機理清楚、整合位點較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小等優(yōu)點，因而倍受重視。國際上近年來將注意力轉(zhuǎn)向農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物基因轉(zhuǎn)化方法的研究，并

6、取得了明顯的進展。Gould等(1991)5用 gus報告基因和Npt基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米Funk G90的芽尖，得到的再生植株及其子一代基因組中帶有標記基因，從而為建立玉米高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。Ishida等(1996)6建立了一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)化體系，通過對菌株、菌液濃度、幼胚等各種因素的優(yōu)化，使玉米的轉(zhuǎn)化效率達到了30%,成為玉米遺傳轉(zhuǎn)化進程中的一個里程碑。 2 玉米轉(zhuǎn)基因應(yīng)用現(xiàn)狀1996-2009年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物總面積的百分比穩(wěn)定增長(圖2)。目前，轉(zhuǎn)基因玉米農(nóng)藝性狀改良主要涉及抗除草劑、抗蟲、抗病、 抗旱和品質(zhì)改良等，商業(yè)化種植面積較多的是抗

7、除草劑、抗蟲和二者復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米(表1)毫無疑問，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越重要的作用。 圖2 全球轉(zhuǎn)基因玉米面積占轉(zhuǎn)基因作物面積百分比 產(chǎn)品2007 年2008 年抗蟲930710抗除草劑700570抗蟲 / 抗除草劑18802450合計35103730表1 全球轉(zhuǎn)基因玉性狀種植概況7 萬hm2 2.1 抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米 抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米是高效、低成本控制雜草的新途徑。目前，國內(nèi)已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得具有潛在利用價值的抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新材料，其抗除草劑基因主要來源于細菌等微生物。 2.2 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米能克服農(nóng)藥帶來的不利因素如：(1)玉米中有農(nóng)藥殘留；(2

8、)害蟲逐步產(chǎn)生抗藥性；(3)化學(xué)農(nóng)藥作用方式是非特異性的，殺死害蟲的同時也使其天敵受害，從而危及多種生物資源8。目前，來源于微生物的抗蟲基因是目前商業(yè)化應(yīng)用最有效基因之一。近年來，研究人員在嘗試克隆植物來源的抗蟲轉(zhuǎn)基因代替微生物來源基因。 2.3 抗病轉(zhuǎn)基因玉米 玉米生長期間常受到病毒性病害(矮花葉病、玉米粗縮病等)、真菌性病害(玉米紋枯病)和細菌性病害等侵襲而使其品質(zhì)及產(chǎn)量下降。常規(guī)育種由于抗原的缺乏和不同物種間的遺傳隔離，使抗病育種工作受到了極大的限制，而研究抗病轉(zhuǎn)基因玉米可以為玉米抗病育種提供新的種質(zhì)。挖掘新的抗病基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)多抗病基因的聚合轉(zhuǎn)化，培育多抗玉米材料將成為玉米抗

9、病分子育種的發(fā)展趨勢。 2.4 抗旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因玉米 我國水資源緊缺，干旱和半干旱耕地面積多，還有大片的鹽漬土壤，因此，培育抗旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因玉米新品種對提高作物的單位面積產(chǎn)量和擴大種植區(qū)域尤為重要。目前，孟山都公司宣布其研究開發(fā)的抗旱轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)進入實用階段，預(yù)計將于2010年以后投入市場。 2.5 改良玉米品質(zhì) 隨著人們生活水平的不斷提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，玉米品質(zhì)改良顯得尤為重要。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因或人工合成的高蛋白基因?qū)胗衩讈砀牧加衩椎臓I養(yǎng)品質(zhì)將成為研究熱點。 2.6 其他應(yīng)用 玉米轉(zhuǎn)基因研究還涉及雄性不育和生物反應(yīng)器等方面。 3 玉米轉(zhuǎn)基因研究存在的問題及展望 3.1 多

10、基因轉(zhuǎn)化和基因聚合 玉米轉(zhuǎn)基因研究的下一個目標是發(fā)展更有效的技術(shù)以高效地轉(zhuǎn)移并同時表達多個外源基因。有研究表明，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將相關(guān)外源基因 (psy,lcy,crtI)整合到水稻基因組中，培育出胚乳中富含-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因水稻品種，食用后可滿足人體每天所需VA,由于其稲米外觀顏色為黃色，也被稱為黃金米9。發(fā)展玉米多基因轉(zhuǎn)化和基因聚合技術(shù)改良玉米品質(zhì)，使其具有復(fù)合性狀是今后玉米分子育種的明顯特點。 3.2 選擇標記的安全性 玉米轉(zhuǎn)基因載體常采用選擇標記基因如抗生素或除草劑抗性基因，表達上述標記基因的轉(zhuǎn)化細胞對相應(yīng)的抗生素或除草劑產(chǎn)生抗性，但這些化學(xué)篩選劑會抑制轉(zhuǎn)化細胞的生長和再生而降低

11、轉(zhuǎn)化率。近年來這些選擇標記基因?qū)ι鷳B(tài)系統(tǒng)和人類健康的影響已引起公眾的關(guān)注。鑒于這些因素,培育無選擇標記的轉(zhuǎn)基因玉米植株已成為重要目標。從轉(zhuǎn)基因玉米植株中剔除選擇標記基因或無選擇標記基因轉(zhuǎn)化是目前獲得無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株的主要策略。 3.3 基因打靶或基因定點重組技術(shù) 基因定點重組技術(shù)是20世紀80年代后興起的建立在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種分子生物學(xué)技術(shù)10。所謂基因打靶技術(shù)是將攜帶有選擇標記的外源目的基因采用一定的方法導(dǎo)入受體細胞，再通過外源DNA序列與受體細胞染色體上同源DNA序列間發(fā)生重組，最終將外源DNA定點整合到受體細胞基因組某一確定的位點，或?qū)δ骋活A(yù)先確定的受體位

12、點進行定點突變，導(dǎo)致受體細胞基因功能敲除或者點突變發(fā)生的技術(shù)11。 3.4 葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù) 4 結(jié)語及討論目前,利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的抗蟲和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)應(yīng)用于玉米的商業(yè)化生產(chǎn),農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立的轉(zhuǎn)化體系也越來越成熟?；驑尫ú皇苁荏w基因型的限制,能避開原生質(zhì)體再生的障礙,但其價格比較昂貴,并且得到較多的多拷貝轉(zhuǎn)基因植株;而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可轉(zhuǎn)移相對較大的DNA片段,獲得較多的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)化效率高,但對有壁細胞或組織的轉(zhuǎn)化效果較差。有學(xué)者將基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)這兩種技術(shù)結(jié)合,取長補短。Hansen等(1996)12創(chuàng)建了農(nóng)桿槍法(Agrolistic)。與此同時，由于玉米轉(zhuǎn)基因育

13、種涉及多個環(huán)節(jié),發(fā)達國家及其相應(yīng)公司已致力于發(fā)展規(guī)模化轉(zhuǎn)基因玉米平臺,實現(xiàn)了工廠化的運作模式,開展了大規(guī)?；蚬δ荑b定和遺傳轉(zhuǎn)化。目前,我國正通過轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項整合國內(nèi)大部分科研院所的資源,來加快玉米轉(zhuǎn)基因研究步伐,爭取縮小與美國等發(fā)達國家在該領(lǐng)域內(nèi)的差距。另外，外國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司掌握了大量的基因及技術(shù)專利,因此，我國必須在重大項目實施過程中掌握一批擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的功能基因，保護我國的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。隨著我國玉米種植面積的穩(wěn)步上升及需求量的擴大，轉(zhuǎn)基因玉米研究將越來越受到全球化的挑戰(zhàn)。參考文獻1 張世煌，徐偉平，李明順，等。玉米育種面臨的機遇和挑戰(zhàn)。玉米科學(xué)，2008,16(6):

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