SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)簡介

1、silac定量蛋白質(zhì)組學(xué) 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-1663silac定量蛋白質(zhì)組學(xué)o 1：silac定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理o 2: 應(yīng)用 2.1：silac定量蛋白質(zhì)組學(xué) 2.2: silac研究蛋白質(zhì)相互作用 2.3：silac研究蛋白質(zhì)與dna相互作用 2.4：silac研究蛋白質(zhì)與rna相互作用 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16631 1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理o 1.11.1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)的原理定量蛋白質(zhì)組學(xué)的原理o 1.21.2：

2、silacsilac技術(shù)流程技術(shù)流程 .1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備：培養(yǎng)基準(zhǔn)備 .2：細(xì)胞標(biāo)記與測試：細(xì)胞標(biāo)記與測試 1.2.3: 1.2.3: 實驗處理實驗處理 .3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析 .4：結(jié)果形式：結(jié)果形式 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-1663 silac法。 1、標(biāo)記：在缺乏lys和arg的培養(yǎng)基中添加lys和arg的同位素lys(d4或13c6 15n4)、arg(13c6,或13c6 15n4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型”或“重型”； 2、細(xì)胞處理

3、，如藥物處理； 3、細(xì)胞裂解、提取蛋白質(zhì)； 4、等量混合對照與處理組蛋白質(zhì)、sds-page電泳、染色； 5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。1.11.1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理1.11.1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理 技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)優(yōu)勢目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法 （1）高效性：）高效性：silac是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%； （2）定量精確：）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異； （3）高通量、靈敏度高：）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白

4、質(zhì)，且檢可測測到納克級水平； （4）相容性：）相容性：可以對多種在dmem或rpmi 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記； （5）靈活性：）靈活性：在缺乏l-賴氨酸和l-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-166.1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備：培養(yǎng)基準(zhǔn)備材料：材料： （1）：lys或（和）arg缺陷型1640培養(yǎng)基， lys或（和）arg缺陷型dmem培養(yǎng)基。 （2）：透析fbs。 （3）：穩(wěn)定同位素標(biāo)記的lys和arg。l-lysine(13c6), l-lysine

5、 (13c6,15n2), l-lysine(13c6,15n2), l-lysine(15n2,d9), l-lysine(4,4,5,5-d4) ,l-arginine(13c6), l-arginine (13c6, 15n4), l-arginine(13c6,15n4)。培養(yǎng)基制備：培養(yǎng)基制備： 取相應(yīng)量的穩(wěn)定同位素氨基酸lys和arg各50mg,添加到500ml培養(yǎng)基中，同時添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um濾膜過濾，4度保存?zhèn)溆?。根?jù)實驗的需要，可以配制“中”型和“重”型培養(yǎng)基。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-1663

6、.2：細(xì)胞標(biāo)記與測試：細(xì)胞標(biāo)記與測試標(biāo)記：標(biāo)記： 一般細(xì)胞經(jīng)過添加同位素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-6代后，一天或2天傳代一次，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的lys和arg將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素（“中”或“重”型）的細(xì)胞與“輕”型細(xì)胞相比細(xì)胞生長速度可能偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在pbs里面透析，透析膜的孔徑一般為10kda.標(biāo)記測試：標(biāo)記測試： 在進(jìn)行正式實驗之前，需要對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記測試，測試細(xì)胞中蛋白質(zhì)的lys和（或）arg是否被相應(yīng)的同位素氨基酸取代。收取 蛋白質(zhì)后，等量混合，sds-page分離，lc-ms/ms檢測。 輝駿生物：輝駿生物：http

7、:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-166.2：細(xì)胞標(biāo)記與測試：細(xì)胞標(biāo)記與測試細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重重”型肽段取代型肽段取代 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16631.2.3: 1.2.3: 實驗處理實驗處理 當(dāng)標(biāo)記測試檢測到蛋白質(zhì)已被同位素氨基酸標(biāo)記后，可以進(jìn)行細(xì)胞處理，如藥物處理，病毒處理等。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-166.3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析o（1）：提取“輕

8、”型”，“中”型，“重”型細(xì)胞蛋白質(zhì)，等量混合，sds-page分離，染色。o（2）：割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶酶切。o（3）：lc-ms/ms（儀器：ltq orbitrap xl)分析，數(shù)據(jù)檢索。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-166.4：結(jié)果形式：結(jié)果形式 lc-ms/ms分析結(jié)果，將會給出每個肽段的質(zhì)譜峰圖及定量信息。結(jié)果將會已excel表格呈現(xiàn)。 肽段質(zhì)譜峰圖及表達(dá)量：2: silac2: silac應(yīng)用應(yīng)用o 2.1 2.1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)實例定量蛋白質(zhì)組學(xué)實例o 2.2: silac2.2: si

9、lac研究蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)相互作用o 2.32.3：silacsilac研究蛋白質(zhì)與研究蛋白質(zhì)與dnadna相互作用相互作用o 2.42.4：silacsilac研究蛋白質(zhì)與研究蛋白質(zhì)與rnarna相互作用相互作用 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16632.12.1：silacsilac定量蛋白質(zhì)組學(xué)實例定量蛋白質(zhì)組學(xué)實例 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16632.1 schematic for silacsilac實驗流程圖2.1 ms spectra showing the four m

10、ajor patterns of phosphorylation observed 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-1663silac定量結(jié)果圖例，質(zhì)譜峰的高度表示蛋白表達(dá)的相對強(qiáng)度. summary of fold change with her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. proteins with a ratio1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosi

11、ne phosphorylation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. in3t3-her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease 2.1 quantification of phosphorylation by silac 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16632.1 conclusion 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務(wù)熱線：免費服務(wù)熱線：400-699-16632.2 silac2.2 silac研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用j. cell biol. vol. 183 no