姜黃素對結直腸癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化的影響及作用機制

1、    姜黃素對結直腸癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化的影響及作用機制    張曉梅 趙玉濤 王菊美 趙社芬 韓坤嶺 李艷霞 韓雪 范秀敏摘要 目的：探究姜黃素對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲以及上皮間質轉化的影響。方法：取結直腸癌hct116細胞系，隨機分為對照組和觀察組，觀察組細胞使用姜黃素50 g/ml處理，對照組給予等量二甲基亞砜處理;采用噻唑藍（mtt）法檢測細胞增殖;劃痕愈合實驗檢測細胞遷移;transwell實驗檢測細胞侵襲;蛋白免疫印跡法（western blotting）檢測細胞中上皮性鈣黏蛋白（e-cadherin）、神經性鈣黏蛋白（n-

2、cadherin）、波形蛋白（vimentin）、磷酸化jagged 1蛋白（p-jag1）、磷酸化notch受體1蛋白（p-notch1）以及磷酸化notch受體2蛋白（p-notch2）表達水平。結果：mtt法檢測顯示，姜黃素可顯著抑制hct116細胞增殖。劃痕愈合實驗以及transwell實驗顯示姜黃素可顯著抑制hct116細胞遷移及侵襲。western blotting實驗顯示姜黃素可增加e-cadherin蛋白表達水平，降低n-cadherin和vimentin蛋白以及p-jag1、p-notch1、p-notch2等蛋白的表達水平（均p關鍵詞 姜黃素;結直腸癌;增殖;遷移;侵襲;上

3、皮-間質轉化effects and mechanism of curcumin on cell migration，invasion，and epithelial-mesenchymal transformation in colorectal cancer cellszhang xiaomei1，zhao yutao1，wang jumei1，zhao shefen1，han kunling1，li yanxia2，han xue3，fan xiumin4（1 handan central hospital，handan 056001，china; 2 department of gener

4、al surgery，affiliated hospital of hebei engineering university，handan 056002，china; 3 department of pharmacy，hebei university of chinese medicine，shijiazhuang 050200，china; 4 department of hematology，handan first hospital，handan 056002，china）abstract objective：to investigate the effects of curcumin

5、on the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation（emt） of colorectal cancer cells.methods：hct116 cell lines of colorectal cancer were taken and randomly divided into a control group and an intervention group.hct116 cells in intervention group were treated with curcumi

6、n 50 ug/ml，and hct116 cells in control group were treated with the same amount of dimethyl sulfoxide.the cell proliferation ability was detected by thiazolium blue（mtt） assay.cell migration ability was detected by scratch healing assay.cell invasion ability was detected by transwell assay.expression

7、 levels of epithelial cadherin（e-cadherin），neuronal cadherin（n-cadherin），vimentin，p-jagged 1（p-jag1），p-notch receptor 1（p-notch 1），and p-notch receptor 2（p-notch2） were detected by western blotting.results：detection of mtt assay showed that curcumin could significantly inhibit the proliferation of h

8、ct116 cells.wounding healing assay and transwell assay showed that curcumin could significantly inhibit hct116 cell migration and invasion.western blotting experiments showed that curcumin could increase the expression level of e-cadherin protein，and decrease the expression levels of n-cadherin and

9、vimentin proteins，as well as p-jag1，p-notch1，p-notch2 and other proteins（pkeywords curcumin; colorectal cancer; proliferation; migration; invasion; epithelial-mesenchymal transformation中圖分類號：r284;r735.3文獻標識碼：adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.014結直腸癌（colorectal cancer，crc）是一種常見的惡性腫瘤，每年全世界crc死亡病例超

10、過60萬，并且約25%的crc患者在確診時已經出現遠處轉移1-2。晚期crc患者的預后較差，5年生存率不超過10%3。目前越來越多的研究證實某些中草藥可用于腫瘤的治療4。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及抗腫瘤等多種藥理作用，常應用于心血管疾病以及消化系統(tǒng)疾病的治療5-6。已有研究發(fā)現，姜黃素可抑制crc致瘤性激酶pbk的活性，降低hct116細胞的增殖水平，并誘導細胞凋亡7。然而，姜黃素對crc細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，emt）中的作用和具體機制尚不清楚。本研究旨在探討姜黃素對h

11、ct116細胞增殖、遷移、侵襲以及emt相關蛋白表達的影響。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細胞株 結直腸癌細胞hct116，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。將細胞置于含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，在37 、5%co2的環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。1.1.2 藥物 姜黃素粉，含量99.5%，cas號：458-37-7，分子量：368.38，規(guī)格100 mg（sigma公司，美國，批號：78246）。1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（thermo fisher scientific公司，美國，貨號：a3160901）;dmem培養(yǎng)基（thermo fisher scientific公司，美國，貨號：0

12、417）;二甲基亞砜（dmso）（上海碧云天生物科技公司，批號：st038-100）;噻唑藍（mtt）試劑盒（abcam公司，英國，貨號：ab211091）;上皮性鈣黏蛋白（e-cadherin）抗體（abcam公司，英國，貨號：ab244084）;神經性鈣黏蛋白（n-cadherin）抗體（abcam公司，英國，貨號：256744）;波形蛋白（vimentin）抗體（abcam公司，英國，貨號：8069）;transwell室（corning公司，美國，貨號：3383）;磷酸化jagged 1蛋白（p-jag1）（cell signaling公司，美國，貨號：70109s）;磷酸化notch

13、受體1蛋白（p-notch1）（cell signaling公司，美國，貨號：8216s）;磷酸化notch受體2蛋白（p-notch2）（cell signaling公司，美國，貨號：4530s）;全自動凝膠成像和化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（thermo scientific公司，美國，chemidoc tmmp型）;酶標儀（biotek公司，美國，synergy2型）;光學顯微鏡（olympus公司，日本，ix70型）。1.2 方法1.2.1 分組與給藥 將姜黃素粉末充分溶解于dmso中，配成濃度為50 g/ml的溶液。將細胞分為2組，觀察組細胞使用50 g/ml姜黃素處理;對照組細胞則使用等量

14、dmso處理。每組3個樣本。1.2.2 檢測指標與方法1.2.2.1 檢測細胞增殖采用mtt實驗8 以每孔1×104接種于96孔板中，在培養(yǎng)72 h后，每孔加入mtt溶液10 l，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入dmso 100 l，使用酶標儀在570 nm波長處檢測光密度（optical density，od）值。細胞成活率（%）=（觀察組od值-空白組od值）/（對照組od值-空白組od值）×100%。1.2.2.2 檢測細胞遷移采用劃痕愈合實驗9 將各組細胞接種于6孔板上培養(yǎng)，當細胞達到90%融合后，用200 l微量移液器的吸管刮細胞層產生一條無細胞區(qū)域，測量此時劃痕寬度，記

15、為d 0 h。隨后將細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，測量劃痕寬度，記為d 24 h。細胞遷移率（%）=（d 0 h-d 24 h）/d 0 h×100%1.2.2.3 檢測細胞侵襲采用transwell實驗10 將各組細胞懸浮液添加到transwell上室，下室加入600 l完全培養(yǎng)基，在37 ，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，甲醛固定10 min，然后用1%結晶紫染色10 min，在顯微鏡下隨機取5個視野的細胞并計數。1.2.2.4 檢測細胞中e-cadherin、n-cadherin、vimentin、p-jag1、p-notch1以及p-notch2表達水平采用weste

16、rn blotting實驗11 將各組細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入1%的蛋白酶抑制劑和ripa裂解液提取蛋白，根據說明使用bca蛋白試劑盒定量檢測，使用10% sds-page凝膠電泳分離并轉移到聚偏氟乙烯（pvdf）膜上，在室溫下將膜浸泡在5%脫脂牛奶和tbst緩沖液中封閉2 h，隨后將膜加入抗e-cadherin、vimentin、n-cadherin、p-jag1、p-notch1、p-notch2抗體稀釋液（11 000），以gapdh作為內參，并在4 中孵育過夜，將膜加入羊抗兔二抗稀釋液（11 000）于37 孵育2 h，ecl發(fā)光顯影。1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用spss 2

17、5.0軟件統(tǒng)計進行數據分析，所有實驗重復3次。計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 姜黃素對hct116細胞增殖的影響與對照組比較，觀察組中24 h、48 h和72 h細胞成活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均p<0.05）。見表1。2.2 姜黃素對hct116細胞遷移能力的影響對照組細胞遷移率（57.61±2.32）%，觀察組細胞遷移率為（48.92±2.21）%，2組差異有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。見圖1。2.3 姜黃素對hct116細胞侵襲能力的影響對照組細胞侵襲數（81.

18、14±2.26）個，觀察組細胞侵襲數為（54.28±2.72）個，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。見圖2。2.4 姜黃素對hct116細胞emt相關蛋白表達的影響與對照組比較，觀察組中e-cadherin蛋白的表達水平顯著升高，n-cadherin蛋白、vimentin蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均p<0.01）。見表2，圖3。2.5 姜黃素對hct116細胞中jag1/notch2通路的影響與對照組比較，觀察組中p-jag1蛋白、p-notch1蛋白、p-notch2蛋白表達水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均p<0.05）。見表3，圖

19、4。3 討論目前在我國，結直腸癌已經位列惡性腫瘤發(fā)病第3位12。姜黃素是從中藥姜黃、莪術等中藥種提取的，具有抗腫瘤和抗氧化的功效13-14，可調節(jié)多種信號轉導途徑，已有研究證實其在體外細胞模型或動物模型中對腫瘤的預防和治療具有重要作用，如在胃癌中，姜黃素可通過抑制hsp90-jak/stat3信號通絡的激活，顯著降低胃癌細胞sgc-7901的增殖水平，并抑制細胞的遷移和侵襲15-16。當結直腸癌細胞發(fā)生emt時，上皮細胞表型缺失，e-cadherin等蛋白表達減少，而n-cadherin、vimentin等間質細胞的分子標志物表達增加，從而導致細胞間黏附能力下降甚至喪失17-18。已有相關研究

20、報道，jag1/notch2信號通路與乳腺癌、crc、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，當信號通路失調后可誘發(fā)腫瘤，屬于致癌信號通路19-20。當jag1/notch2信號通路活化后，可通過磷酸化作用誘導下游靶基因表達和轉錄，從而導致jag1、notch1、notch2蛋白的磷酸化水平增加21-23。本研究使用50 g/ml姜黃素處理細胞，并進行細胞功能實驗，結果說明姜黃素可通過下調jag1/notch2信號通路，抑制crc細胞的增殖、遷移、侵襲以及emt。既往研究顯示，姜黃素可通過靶向mir-491/peg10抑制hct116細胞的增殖，并促進細胞凋亡24。鄭旦等25、胡艷紅等26學者研究體

21、外培養(yǎng)crc細胞系sw480，并使用不同濃度的姜黃素進行處理，結果顯示均可以顯著降低細胞的增殖能力，其作用與時間及濃度相關。本研究結果與之相似。然而本研究僅限于體外細胞實驗，后續(xù)將進行體內實驗進一步證實此結論。綜上所述，本研究為結直腸癌的治療提供了一個新靶點，同時有待進一步深究進而為直腸癌的防治提供理論依據。參考文獻1siegel rl，miller kd，jemal a.cancer statistics，2018j.ca cancer j clin，2018，68（1）：7-30.2路麗娟，劉明浩，劉建軍，等.微小rna-135b在結直腸癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用研究進展j.中國醫(yī)藥，201

22、8，13（3）：477-480.3van cutsem e，nordlinger b，cervantes a.advanced colorectal cancer：esmo clinical practice guidelines for treatmentj.ann oncol，2010，21（suppl 5）：v93-97.4戴玲玲，陳冬梅，周韶梅，等.“兩階段三步曲法”輔助防治結直腸癌化療不良反應j.中醫(yī)雜志，2019，60（11）：982-985.5許東暉，王勝，金晶，等.姜黃素的藥理作用研究進展j.中草藥，2005，36（11）：1737-1740.6宋魏，崔云，張建波，等.姜黃素對

23、人胰腺癌細胞增殖抑制作用及對wnt信號通路的影響j.世界中醫(yī)藥，2018，13（5）：1226-1228.7于蕾，韓爽，郎朗，等.中藥有效成分對乳腺癌細胞g2/m期調控的研究進展j.中國實驗方劑學雜志，2021，27（4）：205-215.8丁凱，尹麗，顧佳佳，等.znf488對電離輻射誘發(fā)的鼻咽癌細胞cne1侵襲遷移能力的影響j.中國腫瘤，2017，26（5）：395-399.9陳永勝，曾珊珊，鄭文英，等.黏蛋白5b上調高遷移率族蛋白組a1促進乳腺癌細胞侵襲轉移j.實用醫(yī)學雜志，2020，36（1）：6-10.10李冠軍，亞國偉，唐正嚴，等.mir-153靶向prdm2基因并通過jak/st

24、at信號通路影響膀胱癌的侵襲和遷移j.中國病理生理雜志，2018，34（1）：58-63.11葛文秀，羅云，謝學恒，等.燈盞花乙素藥理作用機制研究進展j.中國實驗方劑學雜志，2020，26（22）：193-200.12萬嫣，蘇羚子，李柏.運動與結直腸癌關系研究進展j.臨床與病理雜志，2019，39（5）：1117-1122.13姚慶華，林妙，汪玉琪，等.氧化應激在姜黃素誘導肺癌細胞凋亡中的作用及機制研究j.中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（2）：614-618.14陳雅琳，白天鴿，李瑤瑤，等.抑制自噬增強柔紅霉素與姜黃素合用引起人u937白血病細胞凋亡的機制j.中國新藥雜志，2020，29（10）：1166-1174.15李磊，陳志武.姜黃素對胃癌細胞增殖、遷移及hsp90/jak/stat3通路的影響j.安徽醫(yī)科大學學報，2019，54（3）：448-451，457.16姚慶華，林妙，汪玉琪，等.氧化應激在姜黃素誘導肺癌細胞凋亡中的作用及機制研究j.中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（2）：614-618.17胡佳慧，許盼盼，侯麗娟，等.細胞代謝輪廓分析策略