桃葉橙資源篩選評(píng)價(jià)及分子鑒定

1、桃葉橙資源篩選評(píng)價(jià)及分子鑒定摘要：以湖北省地方特色柑橘桃葉橙為研究對(duì)象，開(kāi)展了資源調(diào)查、搜集及評(píng)價(jià)工作。從品質(zhì)分析角度闡述了當(dāng)前桃葉橙已經(jīng)成為一個(gè)品種群體，果實(shí)大小、種子數(shù)量和可溶性 固形物含量等性狀變化較大，影響了桃葉橙的鮮食品質(zhì)，不利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)未來(lái)的發(fā)展。通過(guò)測(cè)定并從中優(yōu)選了 24份單株資源，并針對(duì)育種目標(biāo)進(jìn)行了資源分類(lèi)，為桃葉橙選育 工作奠定基礎(chǔ)。aflp分子鑒定從dna水平充分證明了參試樣 品發(fā)生了遺傳物質(zhì)的變異，同時(shí)也初步探明了各單株與桃葉 橙8號(hào)、18號(hào)和139號(hào)的遺傳進(jìn)化關(guān)系。關(guān)鍵詞：桃葉橙；資源；評(píng)價(jià)；鑒定中圖分類(lèi)號(hào)：s666. 4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào):0439-8114

2、(2012) 21-4823-04diversity assessment of taoye orange ( citrus sinensis (linn. ) osbeck cv. taoye cheng) germplasm resources and molecular characterization using aflp markershe li-gangl, jiang ying-chunl, wu li-mingl, xumiaol, tong zhul, wang zhi-jingl, sun zhong-hail,wu shu-yong2, cui xu-dong3(1. i

3、nstitute of fruit and tea, hubei academy ofagricultural sciences, wuhan 430209, china；2. local specialty service center in zigui county， yichang 443600, china；3. production and marketing professional cooperatives for taoyecheng orange in quyuan town of zigui county, yichang 443604, hubei, china)abst

4、ract: taking taoye orange as the research object, evaluation analysis on fruit quality showed that the range of fruit size, seed number and content of totol soluble solid altered widely in taoye orange, reduced the fresh food quality and contributed negatively to the development of taoye orange indu

5、stry. in addition, 24 germplasm resources were selected as candidates and classified into five classes for future selection according to breeding objectives. the results of aflp analysis revealed the relationship between individual and no. 8, no. 18， or no. 139， and suggested that a genetic variatio

6、n had happened definitely in selected germplasm resourceskey words： taoye orange； germplasm； diversity assessment； aflp桃葉橙原產(chǎn)于湖北省秣歸縣屈原鎮(zhèn)龍馬溪村低山地，由 于其春梢葉片呈披針形，狹長(zhǎng)似桃葉，故命名為桃葉橙。自 20世紀(jì)60年代開(kāi)始，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所就 已開(kāi)展了桃葉橙的相關(guān)研究工作。典型桃葉橙果實(shí)果形端 正，果面橙紅光滑，臍部有印圈，果肉橙黃，皮薄子少，濃 甜質(zhì)脆，汁多化渣，富玫瑰香氣，具有甜、香、脆的獨(dú)特風(fēng) 味，鮮食品質(zhì)極佳1。由于其品質(zhì)的優(yōu)越性，桃

7、葉橙與臍 橙、夏橙并譽(yù)為“峽橙三秀”，曾是中國(guó)柑橘三大地方良種 之一。20世紀(jì)80年代，桃葉橙是稀歸縣重點(diǎn)推廣和發(fā)展的柑 橘良種，在秣歸縣境內(nèi)各柑橘產(chǎn)區(qū)廣泛栽培。然而，20世紀(jì) 90年代臍橙引種成功，導(dǎo)致桃葉橙種植面積逐漸萎縮；同時(shí), 由于三峽庫(kù)區(qū)蓄水工程的順利推進(jìn)，原有桃葉橙優(yōu)良單株和 桃葉橙豐產(chǎn)園均被淹沒(méi)。其次，原產(chǎn)地栽培品種混雜，管理 措施相對(duì)落后，影響了桃葉橙原有優(yōu)良品質(zhì)的發(fā)揮，導(dǎo)致果 實(shí)大小參差不齊，種子偏多，品質(zhì)下降，嚴(yán)重阻礙了桃葉橙 商品化的生產(chǎn)2, 3。因此，桃葉橙在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì), 受市場(chǎng)影響原產(chǎn)地農(nóng)戶(hù)也出現(xiàn)拋棄桃葉橙改種臍橙的現(xiàn)象， 一定程度上更加速了桃葉橙種植面積的下

8、滑和桃葉橙產(chǎn)業(yè) 的衰落?；谔胰~橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀，擬通過(guò)對(duì)搜集到的桃 葉橙群體資源進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，以篩選 出果大、少核或無(wú)核和高糖低酸的候選單株，輔以aflp分 子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳變異鑒定，從基因水平進(jìn)一步確定桃葉 橙優(yōu)變單株，從而充分發(fā)揮桃葉橙特色資源優(yōu)勢(shì)和文化優(yōu) 勢(shì)，為桃葉橙提純選優(yōu)、新品種選育及桃葉橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠 定基礎(chǔ)。1材料與方法1. 1試驗(yàn)材料2009年和2010年連續(xù)兩年在秣歸縣屈原鎮(zhèn)廣泛開(kāi)展桃 葉橙資源調(diào)查，單株編號(hào)，并采集樹(shù)體中上部不同方位果實(shí) 15個(gè)以上，待測(cè)。針對(duì)2009年和2010年入選復(fù)選的優(yōu)良單 株，依據(jù)編號(hào)隨機(jī)采集樹(shù)體外圍無(wú)病蟲(chóng)危害的幼嫩葉片，液

9、 氮速凍后-80 "保存用于aflp分子鑒定。1.2品質(zhì)測(cè)定稱(chēng)取15個(gè)以上果實(shí)，計(jì)算單果重；分別用直尺一次性量取15個(gè)以上果實(shí)縱徑和橫徑，計(jì)算果 形指數(shù)；描述果實(shí)色澤（橙紅、橙黃、黃）和香氣有無(wú)；一 次性切取5個(gè)以上果實(shí)，描述風(fēng)味（甜酸、適中、酸甜）； 測(cè)定5個(gè)果實(shí)赤道面皮厚，計(jì)算單果皮厚，并統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量; 采用糖度數(shù)顯折射儀drb0-45 （購(gòu)自上海測(cè)維光電技術(shù)有限 公司）測(cè)定果實(shí)可溶性固形物含量；可滴定酸含量測(cè)定采用 酚駄指示劑法，vc含量測(cè)定采用2, 6-二氯靛酚滴定法4。1. 3 dna的提取桃葉橙葉片基因組dna提取采用改良ctab法5。最后 用3050 ul te緩沖液溶

10、解沉淀，并于0.8%瓊脂糖凝膠電 泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。1.4 aflp 分析aflp分析中所采用的引物及接頭序列見(jiàn)表1,其中e和 m分別表示ecor i系列引物和mse i系列引物，具體操作流 程參考文獻(xiàn)6。酶切連接反應(yīng)體系為25 ul, dna底物為 200 ng, ecor i 和 mse i 各 2 ul,接頭 1 u l, 10 mmol/l atp 2.5 pl, t4 dna連接酶1 ul,瞬時(shí)離心混合后37匸溫育 5 h, 8 £繼續(xù)保溫4 h, 4 °c過(guò)夜。預(yù)擴(kuò)增采用25 ul反 應(yīng)體系，dna模板2 ul,預(yù)擴(kuò)增引物1 ul, dntps 0. 5 ul,

11、taq聚合酶0.5 ul,瞬時(shí)離心數(shù)秒，擴(kuò)增參數(shù)：94 變性 30 s, 56 °c退火30 s, 72 °c延伸80 s, 30個(gè)循環(huán)。預(yù)擴(kuò) 增產(chǎn)物采用te稀釋20倍，取2卩l(xiāng)作為選擇性擴(kuò)增模板， 選擇性擴(kuò)增引物1 ul, dntps 0. 5 ul, taq聚合酶0. 5 ul, 加入ddh20至25 ul,瞬時(shí)離心數(shù)秒混勻，第一輪擴(kuò)增參數(shù): 94 °c變性30 s, 65 °c退火30 s, 72 °c延伸80 s,以后每 輪循環(huán)溫度遞減0.7 °c, 12個(gè)循環(huán)；第二輪參數(shù)：94變 性30 s, 55 °c退火30

12、s, 72 °c延伸80 s, 23個(gè)循環(huán)。擴(kuò) 增產(chǎn)物加入10 ul loading buffer混勻，95 °c變性，4% 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。1.5數(shù)據(jù)處理品質(zhì)測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入excel軟件中，計(jì)算單果重、果形指 數(shù)、皮厚以及可滴定酸和vc含量，采用sas 9.2軟件對(duì)計(jì) 算結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。aflp分析中獲得 的dna譜帶進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，有帶的位置計(jì)為1,無(wú)帶的位 置計(jì)為0,將統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸入excel表格中，利用ntsys pc2. 10e數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。2結(jié)果與分析2. 1桃葉橙資源評(píng)價(jià)2009年和2010年分別測(cè)定29份和44份桃葉橙單株

13、果 實(shí)樣品。室內(nèi)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃葉橙果實(shí)色澤橙紅，普遍具 有香氣，風(fēng)味酸甜為主，汁多化渣。表2和表3統(tǒng)計(jì)分析結(jié) 果表明，桃葉橙果實(shí)單果重89. 00205. 40 g,變異系數(shù) 2009、2010年分別為14.56%、14.99%,性狀表現(xiàn)參差不齊; 種子數(shù)變化大，變化范圍0.7015. 70粒，變異系數(shù)2009 年、2010年分別為39.87%、53.47%,極不穩(wěn)定，影響鮮食 品質(zhì)；可溶性固形物含量變化相對(duì)較小，最低11%,最高可 達(dá)14%,變異系數(shù)2009、2010年分別為6.28%、4. 67%；可 滴定酸含量也有較大幅度變化，變異系數(shù)2010年達(dá)40. 36%； 此外，果皮厚度變異也

14、比較嚴(yán)重。根據(jù)大果、少核或無(wú)核和 高糖等選育目標(biāo)，2009年7份、2010年17份入選復(fù)選（表3、表4）,并初步確定wgh-01. dyl-63和wsf-40作為重點(diǎn) 候選優(yōu)株，進(jìn)入優(yōu)良性狀遺傳穩(wěn)定性觀(guān)察階段。為儲(chǔ)備桃葉 橙特色育種資源，對(duì)入選優(yōu)株進(jìn)行資源分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表5。2. 2 aflp聚類(lèi)分析對(duì)20092010年參選的桃葉橙資源中的23份單株進(jìn)行 aflp分子鑒定發(fā)現(xiàn)，64對(duì)通用引物中引物對(duì)e-act/m-caa. e-act/m-ctt、 e-acc/m-caa、 e-acg/m-caa、 e-agc/m-caa 和 e-agc/m-cac能夠?qū)⒋蟛糠謽悠穮^(qū)別開(kāi)。其中，以桃葉橙雜 交父

15、本金水柑為外部對(duì)照，桃葉橙各單株（包括雜交親本及 子代）在相似系數(shù)為0.280.67水平上聚類(lèi)（圖1）, 3株 桃葉橙候選優(yōu)株中，wsf-40和dyl-63與18號(hào)較為臨近，與 8號(hào)相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明wsf-40和dyl-63可能為18號(hào)營(yíng)養(yǎng)系后 代；wgh-01為139號(hào)營(yíng)養(yǎng)系后代，與18號(hào)、8號(hào)差別均比 較明顯，聚類(lèi)分析充分證明了這一觀(guān)點(diǎn)。3小結(jié)以柑橘地方特色品種秣歸桃葉橙作為研究對(duì)象，旨在為 重振桃葉橙產(chǎn)業(yè)奠定理論基礎(chǔ)。桃葉橙在原產(chǎn)地具有深厚的 群眾基礎(chǔ)和文化底蘊(yùn)，在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的今天，充分挖 掘和利用資源優(yōu)勢(shì)，有利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)的復(fù)蘇和壯大。擁有 自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種是市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的核心，發(fā)展

16、桃葉橙產(chǎn)業(yè)必 須具有性狀優(yōu)良的桃葉橙品種（系），針對(duì)這一目標(biāo)，開(kāi)展 了廣泛的資源調(diào)查、搜集及評(píng)價(jià)工作，并且初步確定桃葉橙 品種（系）候選優(yōu)株，然而由于桃葉橙目前在原產(chǎn)地栽培環(huán) 境復(fù)雜，多為小范圍種植，資源搜集難度較大，群體的覆蓋 率難以保證；其次，大多數(shù)單株資源僅采用一年的試驗(yàn)數(shù)據(jù), 其遺傳穩(wěn)定性還有待連續(xù)的觀(guān)察和研究。aflp分子鑒定分析中，雖然將大部分樣品區(qū)別開(kāi)，但是 對(duì)于桃葉橙8號(hào)、18號(hào)和139號(hào)的進(jìn)化關(guān)系仍不明確，根據(jù) 記載，18號(hào)來(lái)源于8號(hào)，聚類(lèi)分析圖中可以說(shuō)明這一點(diǎn)，然 而139號(hào)為18號(hào)的營(yíng)養(yǎng)系后代，聚類(lèi)分析沒(méi)有反映這一點(diǎn)， 這可能與分子鑒定過(guò)程中篩選的引物數(shù)量有關(guān)，由于僅采用

17、 了 6對(duì)引物，無(wú)法覆蓋全部基因組，不能客觀(guān)反映基因組序 列中所有的差異位點(diǎn)，通過(guò)增加篩選引物組合數(shù)量可以緩 解。參考文獻(xiàn)：1向長(zhǎng)海秣歸開(kāi)展桃葉橙優(yōu)良單株選育j.中國(guó)果 業(yè)信息，2009, 26 (12)： 44.2孫林紅，王耀群，吳述勇，等桃葉橙豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽 培技術(shù)措施j.柑桔與亞熱帶果樹(shù)信息，2001, 17 (2)： 22-23.：3向長(zhǎng)海，周志虎，戈偉，等一代名品“桃葉橙” 的發(fā)展現(xiàn)狀與振興對(duì)策j.現(xiàn)代園藝，2008 (9)： 49-51.4李錫香.新鮮果蔬的品質(zhì)及其分析法m.北京：中 國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994.5許淼，蔣迎春，孫中海，等.鄂柑一號(hào)極柑少核芽 變的 aflp 分析j.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(17)： 3556-3559.6周延清.dna分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用m. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2