第十節(jié)基因工程藥物制造實(shí)例

1、第十節(jié)第十節(jié) 基因工程藥物制造實(shí)例基因工程藥物制造實(shí)例 干擾素（interferon IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為、等4個(gè)類型。干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為1b、2a、2b等亞型，其區(qū)別在于個(gè)別氨基酸的差異上，早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的，產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，不能滿足需要，現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達(dá)來進(jìn)行生產(chǎn)。 一、基因工程菌的組建 目的基因的獲得：將生產(chǎn)干擾素的白細(xì)胞的mRNA分級分離，然后將不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母細(xì)胞，并測定合成干擾素的抗病毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12SmR

2、NA的活性最高，因此用這部分mRNA合成cDNA。將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12，的幾千個(gè)重組子克隆，每個(gè)克隆都用粗提的干擾素的mRNA去進(jìn)行雜交，把得到的雜交陽性克隆中的重組質(zhì)粒DNA放到一個(gè)無細(xì)胞蛋白合成體系中進(jìn)行翻譯，一、基因工程菌的組建 對每一個(gè)翻譯體系的產(chǎn)物進(jìn)行抗病毒的干擾素活性檢測，經(jīng)過多輪篩選獲得了產(chǎn)生干擾素的cDNA，最后將干擾素cDNA克隆入大腸桿菌表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)。二、基因工程干擾素的制備 啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提半成品制備 半成品檢定 分裝 凍干 成品檢定成品包裝 1、發(fā)酵人干擾素2b

3、基因工程菌為SW-IFN-2b/E.coli DH5, PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因，種子培養(yǎng)基 含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉。 分別接種人干擾素2b基因工程菌到4個(gè)裝有250毫升種子培養(yǎng)基的1000毫升搖瓶中，30培養(yǎng)10小時(shí)，二、基因工程干擾素的制備 作為發(fā)酵罐種子，用15升發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為10升，發(fā)酵培養(yǎng)基由1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.01%氯化銨、0.05%氯化鈉、0.6%磷酸氫二鈉、0.001%氯化鈣、0.3%磷酸二氫鉀0.01%硫酸鎂、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升氨芐青霉素、少量防泡劑組成，pH6.8。轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)每分，通氣量為1

4、：1溶氧為50%。30發(fā)酵8小時(shí)，然后在42誘導(dǎo)2-3小時(shí)完成發(fā)酵。 二、基因工程干擾素的制備 同時(shí)每隔不同時(shí)間取2毫升發(fā)酵液，10000轉(zhuǎn)每分離心除去上清夜，稱量菌體重量。2、產(chǎn)物的提取和純化發(fā)酵完畢后，冷卻，進(jìn)行4000轉(zhuǎn)每分離心，離心30分，得濕菌體1000克左右。取100克濕菌體重新懸浮于500毫升20毫摩爾每升磷酸緩沖液中（pH7.0），于冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，然后4000轉(zhuǎn)每分，離心30分，取沉淀部分，二、基因工程干擾素的制備 用100毫升含8摩爾每升尿素、20毫摩爾每升磷酸緩沖液（pH7.0）、0.5毫摩爾每升二巰基蘇糖醇的溶液，室溫?cái)嚢璩樘?小時(shí)，然后用15000轉(zhuǎn)每分離心

5、，30分，取上清夜，用20毫摩爾每升磷酸緩沖液（pH7.0）稀釋至尿素濃度為0.5毫摩爾每升，加二巰基蘇糖醇至0.1毫摩爾每升，4攪拌，15小時(shí)，15000轉(zhuǎn)每分，離心30分除去不溶物。上清夜經(jīng)截流量為10000相對分子量的中空纖維超濾器濃縮，將濃縮的人干擾素2b溶液經(jīng)過Sephadex D50 分離，二、基因工程干擾素的制備 層析柱2厘米*100厘米，先用20毫摩爾每升磷酸緩沖液（pH7.0）平衡，上柱后用同一緩沖液洗脫分離，收集人干擾素2b部分，經(jīng)SDS-PAGE檢查。將Sephadex D50柱分離的人干擾素2b組分，再經(jīng)DE-52柱（2厘米*50厘米）純化人干擾素2b組分，上柱后用含0

6、.05、0.1、0.15摩爾每升氯化鈉的20毫摩爾每升磷酸緩沖液（pH7.0）分別洗滌，收集含人干擾素2b的洗脫液。全過程蛋白回收率為20-25%，產(chǎn)品不含雜蛋白，DNA及熱源含量合格。 三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 1、半成品檢定效價(jià)測定、蛋白質(zhì)含量測定、活性測定、比活性測定、純度測定、相對分子量測定、核酸含量測定、鼠IgG含量測定、等電點(diǎn)測定、無菌試驗(yàn)、熱源質(zhì)試驗(yàn)等。（1）、效價(jià)測定用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準(zhǔn)為國際單位。三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 （2）、蛋白質(zhì)含量測定，福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。 （3

7、）、比活性，效價(jià)的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。（4）、純度，電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上。 三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 （5）、相對分子量測定，還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時(shí)用已知相對分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。 （6）、殘余外源性DNA含量測定，用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。 三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 （7）、殘余血清IgG含量測定，在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時(shí)必須進(jìn)行

8、此項(xiàng)檢定。（8）、殘余抗生素活性測定，半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。（9）、紫外光譜掃描，檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在280納米加減2納米。（10）、肽圖測定， 用CNBr裂解法，測定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。（11）、等電點(diǎn)測定，等電聚焦電泳。三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 （12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測定、無菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn)。 2、成品檢定外觀、活性、水分、無菌試驗(yàn)、安全毒性、熱源質(zhì)。（1）、物理性狀，凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）、鑒別試驗(yàn)，應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。（3）、水分測定，用卡氏法，應(yīng)低于3%。三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 （4）、無菌試驗(yàn)，同半成品。（5）、熱源質(zhì)試驗(yàn)，同半成品檢定。（6）、干擾素效價(jià)測定，同半成品檢定，效價(jià)不應(yīng)低于標(biāo)示量。（7）、安全試驗(yàn)，取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千