從掌葉大黃中提取的化合物對抗增殖雌激素受體基因的影響

1、從掌葉大黃中提取的化合物對抗增殖雌激素受體基因的影響掌葉大黃，在韓國是一種傳統(tǒng)藥材。在以前的研究中用于在重組酵母系統(tǒng)中篩選人雌激素受體（ER）表達(dá)質(zhì)粒和質(zhì)粒的雌激素活性。掌葉大黃中正己烷的EC50值，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，和甲醇提取物的水溶物的雌激素活性檢測分別為0.145，0.093，0.125，1.459，2.853克/毫升，在二氯甲烷部分，雌激素有明顯的活性。使用活性追蹤的方法，從二氯甲烷餾分分離已知得有蒽醌，大黃酚（1），大黃素甲醚（2），大黃素（3），蘆薈大黃素（4）、大黃酸（5）。其中化合物3具有最高的雌激素的相對效力（RP，17bestradiol = 

2、1）（6.3×10-2），其次是化合物4（3.8×10-3），化合物5（2.6×10-4），此外，掌葉大黃中二氯甲烷部位的化合物3和組分3（包含化合物3）對是ER陽性（MCF-7）和陰性（MDA-MB-231）的乳腺癌細(xì)胞系對表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。關(guān)鍵詞：掌葉大黃蒽醌類成分，酵母測定，雌激素樣作用，抗增殖作用引言：傳統(tǒng)上，許多植物被當(dāng)成天然藥物治愈了許多疾病。今天。植物雌激素更廣泛的用于對抗更年期疾病包括乳腺癌（埃德勒克羅茨和哲，1997）。利用現(xiàn)有的合成雌激素更年期雌激素替代療法有一些副作用，包括乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌由于非選擇性的雌激素樣作用其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（

3、Colditz等人，1995，1992；亨德森等人，1988；博爾頓等人，1998）。一般來說，中藥是安全的，不具有合成雌激素的副作用。雌激素的成長在女性和男性生殖系統(tǒng)中許多目標(biāo)的分化和功能起著重要的作用。雌激素還具有多種藥理作用，如保護(hù)骨質(zhì)量，維護(hù)保護(hù)心血管，腦保護(hù)（Smith，1994；Ciocca和roig，1995）。在更年期許多健康問題的風(fēng)險(xiǎn)都顯著增加，如雌激素缺乏癥，潮熱，睡眠，陰道干燥，關(guān)節(jié)疼痛，情緒波動(dòng)，骨密度降低，心血管疾病，等（?？说热耍?993；帕拉西奧斯，1999；賴默等人，2003）。天然中草藥，如掌葉大黃（蓼科），在中醫(yī)中通常應(yīng)用于治療癌癥。在以前的研究中，掌葉大黃

4、用于篩查婦科癌癥的雌激素活性和抗癌活性，在體外用人乳腺，卵巢婦科腫瘤活性，宮頸癌和肺癌細(xì)胞株（Kang et al，2006）。，在掌葉大黃.的根莖中含有一種活性成分大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌），具有抗癌，抗菌，做利尿劑和血管舒張的作用（Tsai and Chen, 1992; Liang et al., 1993; Koyama et al., 1988; Zhou and Chen,1988; Huang et al.1991)。也有報(bào)道，大黃素對HER-2/neu過度表達(dá)的肺癌細(xì)胞有治療作用，并且對HER-2/neu基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有抑制作用。(Zhang and

5、 Hung, 1996; Zhang et al, 1998)。然而，除大黃素外，掌葉大黃其他雌激素和抗增殖的成分和其生物效應(yīng)仍然未知。探討掌葉大黃的雌激素成分，人類雌激素受體表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒重組酵母系統(tǒng)一個(gè)人類雌激素受體表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒重組酵母制。此外，還使用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（ER陽性）和MDA-MB-231（ER）對體外抗婦科癌癥抗癌活性進(jìn)行評估。植物材料2005年10月，大黃的根在韓國漢城牦牛龍寺的傳統(tǒng)中藥市場購買。憑證標(biāo)本存放在成均館大學(xué)藥學(xué)院。酵母的雌激素活性檢測唐納德博士從釀酒酵母獲得了bj3505（杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的體育公司，美國）。bj3505重組酵母株在顫動(dòng)的孵化

6、器上，溫度為30。選擇性培養(yǎng)基含300 RPM的酵母氮基（沒有氨基酸67毫克/毫升），1 %葡萄糖，L -賴氨酸（36毫克/毫升）和L -組氨酸（24毫克/毫升）。孵化后的酵母樣品稀放在一個(gè)600 nm的光密度值（OD值），0.25和100µL，96孔培養(yǎng)板的選擇培養(yǎng)基里。每個(gè)樣品在quadruplicate assayed什么。-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)活動(dòng)是在100µL（Z緩沖區(qū)（60毫米的磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉40毫米，10毫米氯化鉀，1nM硫酸鎂，pH值7.0 2毫克/毫升）含鄰硝基苯基-D-半乳糖苷（ONPG），0.1%十

7、二烷基硫酸鈉，- toethanol mercap 50毫米和200 U /毫升（enzogenetics oxalyticase，科瓦利斯，OR）。之后20分鐘左右，在同步titertek MCC 344板閱讀器讀取每個(gè)孔的od590 和od420的測量值(Kang et al., 2006)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)有MCF-7（ER陽性乳腺癌）的磺基羅丹明B（SRB）法和MDA-MB-231（ER陰性的乳腺癌）細(xì)胞株法（Skehan等人。，1990）。對于SRB法，在96孔培養(yǎng)板每孔中的培養(yǎng)基中加入100µL的細(xì)胞懸液（4-5萬細(xì)胞

8、/毫升）。依附一天后，將時(shí)間控制板歸零。掌葉大黃組分中的二氯甲烷餾分（Fr.1Fr.10）和化合物1-5直接添加到細(xì)胞孵育板上在5% Co2，37的條件下培育48 h 。細(xì)胞固定在50µL的40的50%的三氯乙酸（TCA）中1h 并且用自來水將板洗滌5次，然后吹干燥。添加五十微升的SRB溶液（0.4% 1%乙酸）和讓細(xì)胞在室溫下染色30分鐘。殘余的染料用1%醋酸洗滌和并且在板上晾干。在每個(gè)板上加100µL Tris緩沖溶液（10毫米，pH 10.5）加入。光盤（外徑各井）密度測定用微孔板儀在540 nm。每個(gè)板酶標(biāo)儀測定的光

9、密度（OD）為540 nm。提取和分離掌葉大黃的根（2.4公斤）用甲醇在室溫下提取兩次。然后將甲醇提取液蒸減壓干燥，殘留物會(huì)在水中懸浮。最終的結(jié)果是是正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇連續(xù)分層。蒸發(fā)壓力下有機(jī)餾分在濃縮成的提取物分別為正己烷（13.5克），二氯甲烷（7.4克），乙酸乙酯（167.5克），正丁醇（46.1g），和水（66.1克）。具有雌激素樣活性的二氯甲烷提取物，在硅凝膠進(jìn)行柱色譜法在使用正己烷、乙酸乙酯連續(xù)洗脫順序（5：3：1，1，1：1）和正己烷、乙酸乙酯、甲醇（20:20：1，1，10:10，5:10：2）。結(jié)合薄層層析模式產(chǎn)量餾分為Fr.1Fr.10。餾分Fr.1, Fr

10、.3, and Fr.8在硅凝膠上分別用用正己烷-乙酸乙酯（15:1）、正己烷-乙酸乙酯（3:1）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇（15:10:2）作為洗脫劑生產(chǎn)大黃酚（1），大黃素（3），和大黃酸（5）。分別將餾分Fr.2 a和 Fr.4由硅凝膠層析(n-hexane/EtOAc = 15 : 1, 3 : 1)和Sephadex LH-20柱層析(CH2Cl2/MeOH = 4 : 6, 3 : 7)得到大黃素甲醚（2）、蘆薈大黃素（4）。大黃酚（1）黃棕色非晶粉末，核磁共振譜（300兆赫，CDCl3）2.44（3H，S，3-ch3），7.08（1H，BR，H-2），7.27（1H，D，J

11、0;= 8.6赫茲，H-7），7.63（1H，BR，H-4），7.64（1H，T字形，j = 8.4，7.2赫茲，H-6），7.80（1H，D，J = 7.8赫茲，5），11.98（1H，S，OH），12.09（1H，S，OH）；電噴霧質(zhì)譜m/z 277 M + Na+。大黃素甲醚（2）橙色非晶粉末；核磁共振譜（300兆赫，CDCl3）2.45（3H，S，3-ch3），3.94（3H，S，6-och3），6.72（1H，BR，H-7），7.10（1H，BR，H-2），7.36（1H，BR，H-4），7.65（1H，BR的，H5），12.10（1H，BR S，OH），12.3

12、0（1H，S，OH）；電噴霧質(zhì)譜m/z 307 M + Na+。大黃素（3）規(guī)范的的非晶體粉末；核磁共振譜（300兆赫，DMSO）2.45（3H，S，3-ch3），6.62（1H，D，J = 2.5赫茲，H-7），7.15（1H，D，J = 2.5赫茲，5），7.20（1H，BR，H-2），7.53（1H，BR S，H），12.05（1H，BR S，OH），12.12（1H，BR S，OH）；電噴霧質(zhì)譜m/z 293 M + Na+。蘆薈大黃素（4）棕色無定形粉末；核磁共振譜（300兆赫，DMSO）4.66（2H，S，3-ch2 -），5.61（1H，BR的，呵呵

13、），7.33（1H，BR，H-2），7.42（1H，D，J = 8赫茲，H-7），7.73（1H，BR S，H4），7.75（1H，D，J = 8赫茲，5），7.84（1H，T型，J = 8.4,7.2 Hz，H-6），11.98（2H，BR的，ohx2）；電噴霧質(zhì)譜m/z 293 M + Na +。大黃酸（5）黃色無非晶體粉末；核磁共振譜（300兆赫，DMSO）7.43（1H，DD，j = 8.4，1.2 Hz，H-7），7.75（1H，DD，j = 7.5，1.2 Hz，

14、5），7.78（1H，D，J = 1.2赫茲，H-2），7.86（1H，DD，J= 8.4，7.8 Hz，H-6），8.15（1H，D，J = 1.8赫茲，H-4），11.91（2H，BR的，ohx2），13.77（1H，BR，COOH）；電噴霧質(zhì)譜m/z 307 M + Na+。結(jié)果與討論在以往的研究中，常在掌葉大黃提取用來抗人乳腺，卵巢婦科腫瘤活性，宮頸癌和肺癌細(xì)胞株的雌激素活性和抗腫瘤體 (Kang et al., 2006)。在現(xiàn)在的研究中，常從掌葉大黃各種蒽醌成分中，用人類雌激素受體表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒重組酵母系統(tǒng)來搜索雌激素成分和表征提取物 (aloeemodin

15、, emodin, chrysophanol, etc.)。酵母培養(yǎng)中添加二甲基亞砜試樣 (OD420 nm = 0.1)，終濃度在0.001和1000µ克/毫升之間，孵育24 h，觀察-半乳糖苷酶和細(xì)胞增殖活性。 總結(jié)在表一，雌激素活性溶劑組分按下列順序依次增加：二氯甲烷組分（EC50 0.093µgml），乙酸乙酯（EC50 0.125gml），正己烷（EC50 0.145gml），正丁醇（EC50 1.459gml），和H2O（EC50 2.853µ克/毫升）。這表明二氯甲烷組分雌激素活性最高。在硅凝膠柱層析洗脫的順序?yàn)椋赫和?乙酸乙酯（5:1、3:1和1

16、:1）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（20201，10101和10：5：2）。餾分中薄層色譜模式產(chǎn)量組分為Fr.1Fr.10。二氯甲烷餾分中雌激素活性如表2依次增加：Fr.3,Fr.4, Fr.2, Fr.10, Fr.1, Fr.5 and Fr.8。各自的EC50值分別為：0.102, 0.186, 0.201, 2.358, 2.452, 2.862和3.048 µg/mL，陽性對照 (E2; EC50 value: 0.078 µg/mL)。進(jìn)一步的詳細(xì)的化學(xué)成分，二氯甲烷的餾分（fr.1-fr.10）在硅膠上反復(fù)層析，從餾分 Fr.1, Fr.3和Fr.8中脫離出化

17、合物1,3和5，分別從 Fr.2 和Fr.4中脫離出化合物2和4。五個(gè)已知化合物大黃酚（1）、大黃素甲醚（2），蘆薈（3）、大黃素（4）、大黃酸（5）通過光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)價(jià)值的確定 (Liu et al., 2004; Zhou et al., 2006)。如表3所示，二氯甲烷餾分中已知五個(gè)蒽醌類化合物的雌激素活性按下列順序依次增加：大黃素，蘆薈大黃素，大黃酸，大黃酚。各自的EC50值分別為： 0.08, 1.32, 18.96, 和 23.44 µg/mL，對于陽性對照17-雌二醇（E2；EC50值：0.005µ克/毫升）。大黃素甲醚沒有雌激素效應(yīng)（> 100

18、1;克/毫升）。植物雌激素是的植物自然產(chǎn)生，有干擾雌激素的作用，可通過與雌激素受體或間接調(diào)節(jié)內(nèi)源性雌激素濃度直接作用化合物的能力(Woods, 2002)。早期的研究指出了放牧對植物含有的豐富的植物雌激素有不良的影響，但是，到了今天，植物雌激素更廣泛用于對抗更年期癥狀和降低激素依賴性疾病，如乳腺癌的發(fā)病率(Adlercreutz和 Mazur, 1997).。Chen et al。(2002) 。最近報(bào)道，蒽醌類化合物中三個(gè)結(jié)構(gòu)類似的大黃素甲醚，大黃酚，大黃素對HL-60細(xì)胞最有細(xì)胞毒性的作用。在此之前，甲醇或乙醇提取物（掌葉大黃）被證明能夠抑制增長SK-OV-3和A549細(xì)胞(Kang et

19、 al., 2006)。為了進(jìn)一步研究這些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，許多研究已進(jìn)行了對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（ER陽性）和MDA-MB-231（ER）實(shí)驗(yàn)。 如表4所示，二氯甲烷餾分Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4和Fr. 7中的蒽醌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞依次降低。然而，非蒽醌餾分Fr.5, Fr.6, Fr.8, Fr.9和 Fr.10中MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞濃度小于100µg/mL，不受影響。今天，大黃素和蘆薈大黃素更多的用來誘導(dǎo)（MCF-7）和陰性（MDA-MB-231）細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，大黃素和蘆薈大黃素有雌激素，因此是天然雌激素很好的

20、替代乳腺癌的抗癌劑。盡管這項(xiàng)研究的結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用來ER-調(diào)節(jié)反應(yīng)和抗乳腺癌細(xì)胞的增殖，我們建議，掌葉大黃的雌激素成分，如大黃素和蘆薈大黃素，具有ER-mediated（雌激素）和ER-independent（抗乳腺癌）在細(xì)胞水平的影響，可以作為抗癌藥物。使用體外模型，與目標(biāo)分子介導(dǎo)雌激素或抗腫瘤活性的鑒定進(jìn)行功能分析。致謝該研究是由韓國京畿道省政府“grrc”項(xiàng)目的支持下完成的參考文獻(xiàn)Adlercreutz, H. and Mazur, W., Phyto-oestrogens and Western diseases. Ann. Med., 29, 95-120 (1997).Bolton

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