豬球蟲與球蟲病研究進展

1、豬球蟲與球蟲病研究進展sunshine豬球蟲與球蟲病研究進展蔡建平、謝明權(quán)、覃宗華(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東廣州510640)豬球蟲病是由豬等電球蟲(isospara suis)和某些艾美耳屬(eimcria)球蟲寄生于哺乳 期及新近斷奶的仔豬小腸上皮細胞所引起的以腹瀉為主要臨床癥狀的原蟲病，在成年豬 群，雖冇球蟲寄牛:，但一般不引起臨床表現(xiàn)，多呈帶蟲現(xiàn)象，而成為木病的傳染原，尤其 是母豬帶蟲，常'引起一窩仔豬同時或先后發(fā)病，或引起死亡，引起較大的經(jīng)濟損失。近年 來，該病在歐、美、澳、東南亞國家和地區(qū)流行嚴重，引起獸醫(yī)寄生蟲學(xué)考的充分關(guān)注， 在病原學(xué)、流行病學(xué)、免疫學(xué)等方而取得

2、了不少進展。1病原生物學(xué)1.1豬球蟲的種類豬球蟲最早報道于1878年，由zurn和rivalta首先發(fā)現(xiàn)，但未作具體的描述和分類命 名1。douwes (1921)也曾描述過從豬糞便中分離的腸球蟲，但未予命名；次年該氏描 述并命名了豬的蒂氏艾美耳球蟲(e. debliecki) lo自此z后寄生蟲工作者先后報道并 命名了 15種艾美耳球蟲和2種等抱球蟲(pelllerdy, 1974)1，但其中至少有5種艾美耳球蟲和1種等砲球蟲的有效性值得懷疑，仍有待研究 2。目前根據(jù)不同國家和地區(qū)豬球蟲病的流行病學(xué)調(diào)杳結(jié)果，人多數(shù)學(xué)考比較認可豬球 蟲的有效種計有艾美耳屬8種和等抱屬1種,即粗糙艾美耳球蟲(e

3、. scabra),光滑艾美 耳球蟲(e. poll ta)，極細艾美耳球蟲(eperminuta),蒂氏艾美耳球蟲(e. debliecki),豬 艾美耳球蟲(e. suis),種豬艾美耳球蟲(e. porci)、有刺艾美耳球蟲(e. spinosa), 新蒂氏艾美耳球蟲(e. neodebliecki)和豬等砲球蟲(1. suis)2o據(jù)snith稱，在歐洲，上述豬球蟲中比較常見的是isuis、e. debliecki >e. scabra3。而據(jù)daugschies等對大多數(shù)文獻報道的分析，上述各種球蟲除e. neodebliecki外,在歐洲都很普遍,尤其是i. suis,常在種

4、豬場的仔豬群中引起疾病 流行4；但koudela等在捷克的調(diào)查認為，e. neodebl iecki這一山種廣泛存在，且有較 強致病力，可引起臨床型腹瀉5。由于豬艾美耳球蟲生活史的潛隱期和他子化時間較 氏，種內(nèi)形態(tài)變異較大，等砲屬和艾美耳屬的非孑包子化卵囊形態(tài)種間差異不大等特點，出 現(xiàn)這些差并并不奇怪。12豬球蟲的生活史迄今為止，在豬球蟲中，僅只有i. suis、e. debliecki、e. scabra、e. spinosa和 e. neodebliecki 5種的生活史得到實驗研究，對其它4種艾美耳球蟲的生活史過程還不詳細了解。一般而言，豬艾美耳球蟲的潛隱期多在10-14日間，排卵囊持續(xù)

5、期(明顯期)也 長達6-10 el在2. 5%重鋸酸鉀溶液中于25°c抱子化時一般也需10天以上。據(jù)調(diào)查, 從新鮮豬糞便中分離的7種艾美耳球蟲卵囊(未發(fā)現(xiàn)e. neodebliecki)在1. 25%的重銘酸 鉀溶液中于30°c通氧孵化，12天時冇97%的卵囊完成砲子化。但豬等砲球蟲的潛隱期較 短，為4-6天，明顯期為3-13天，卵囊的體外孑包子化時間為3-5天?，F(xiàn)以 e. neodebliecki的生活史為例說明豬艾美耳球蟲的生活史5。e. neodebliecki的卵囊為橢圓形或卵圓形，卵囊壁雙層，無色，外層光滑，無微孔。他 子化卵囊大小為19. 8x15. 2 (17

6、-24x14-18)剛，無卵囊殘體,有極粒。抱子囊長卵圓形, 有明顯的斯氏體和砲了囊殘體，砲了囊大小為sunshinesunshine13. 1x6. 1 (12-14x5-7) mm。在2. 5%重鋸酸鉀中于25°c孑包子化需時10-12天，而在20°c 時則需16犬才能完成孑包子化。其內(nèi)工性發(fā)育是距回盲口 50-300cm處的中后段空腸腸絨毛 上皮細胞內(nèi)進行的。口服感染e. neodebliecki 25x104砲子化卵囊后5天時，首先在后段 空腸的組織切片中，于腸隱窩處的腸細胞內(nèi)出現(xiàn)未成熟的單核裂殖體，呈球形，位于宿主 細胞核上方的頂端胞質(zhì)中，大小為1.5-3 mm,

7、每個細胞內(nèi)可達5個裂殖體，至第7天時， 對見到球形的成熟裂殖體，沿周邊分布有10-18個核，至第8天裂殖體增殖至最人，含 12-20個新月形的裂殖子，此時刮取腸粘膜涂片進行顯微鏡檢查，可見到大小為8. 1x1.0- 1.5如的裂殖子。至第9天，開始出現(xiàn)未成熟的大配子體(3-5剛)，第10天時，裂殖生 殖仍在進行，但已冇合子形成，此時的組織切片上可見到8%的耒成熟的裂殖體，13%的未 成熟的大配子體，59%的成熟大配子體，16%的正在發(fā)育的小配子體和4%卵張。在he染色 切片上，成熟人配子的特征是胞質(zhì)屮含水量多量嗜伊紅顆粒。在成熟的小配子體屮小配子 呈現(xiàn)周邊分布，中央冇一 8t0陽大小的殘體。1

8、1t2天時仍冇少量冇性期蟲體，至14天 時在腸切片上再也未見內(nèi)生性各階段蟲體。感染后10天時，糞便中對查到卵囊，排卵囊 持續(xù)期6-8天，排卵囊高峰期為感染后第10天(48 065±21 789 0pg)和11天(34 445±32 026 0pg)。臨床癥狀顯示期為第8-11天。盡管在這一研究中只發(fā)現(xiàn)一代裂殖 體，但所見到的裂殖體很可能是第二代裂殖體，因為感染后第5-6天時球形單核的裂殖體 大量出現(xiàn)，表明此z前應(yīng)存在第一代裂殖生殖，只不過出于數(shù)量較少，而在組織節(jié)片或粘 膜涂片上未能發(fā)現(xiàn)而已。1.3豬球蟲分類的一些進展豬球蟲的分類也主要是依據(jù)卵囊的形態(tài)人小及結(jié)構(gòu)、潛隱期和砲了

9、化時間、寄生部位等 特性來進行。但這種分類方法對研究者的個人經(jīng)驗及技能有很人依賴，h豬艾美耳球蟲和 等胞球蟲及各種艾美耳球蟲間的未砲子化卵囊差異很小，需進行較長時間的砲子化后才能 進行分類，使豬艾美耳球蟲的分類比較因難，近年來，借助于計算機輔助的數(shù)值分類法和 以pcr法為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分類法己開始用于豬球蟲的流行病學(xué)調(diào)查，取得一定進展。根據(jù)已報道的豬的7種艾美耳球蟲(不包括e. neodebliecki)卵囊形態(tài)特征， daugschio等6將卵囊色澤和卵囊形態(tài)數(shù)值化，在色澤兇子(cf)中，設(shè)定卵囊壁無色者 數(shù)值為t。黃色者為1,褐色考為5,黑褐色為&在形狀因子(sf)屮將亞球形，球

10、形， 橢圓形或圓形設(shè)為-1,卵圓形或不對稱形設(shè)為1,以德國萊卡公司的計算機輔助圖像分析 系統(tǒng)用萊卡顯微鏡1000倍下測處卵囊和孑包子囊的長、寬值，首先根據(jù)卵囊壁外層的光滑 度及有無微孔存在將混合種卵囊分為3組后，再根據(jù)卵囊長度(1。)形狀因子(sf)色澤 因子(cf)泡子囊長度(is)、淪子囊寬度(ws)、泡子囊形狀指數(shù)(sp=ls/ws),用excel7. 0和windowsspss軟件進行分析和數(shù)值分類，以u檢驗法進行統(tǒng)計處理（種間差民 顯著的p值應(yīng)小于0.05）,并與傳統(tǒng)的分類方法進行比較。結(jié)果表明，用該法nengl対該 次調(diào)查中糞便中存在的所有7種艾美耳球蟲卵囊進行準確分類。根據(jù)數(shù)據(jù)庫

11、中卵囊壁外層 的光滑度將豬糞便中的混合卵囊分成的3組中，第1組卵囊壁粗糙，包括e. perminuta.e. polita> e. scabra 3種再依拯lo、sf和cf等參數(shù)進行數(shù)值分類，可將這3種球蟲準 確分類至種。e. perminuta總能準確分類（100%）,而對e. polita e. scabra則有1%- 3%的錯誤分類率。第2組卵囊具有黃色或褐色粗糙卵喪壁并帶有明顯針刺樣構(gòu)造，此時不 需要其它參數(shù)，對直接分類至單一種e. spinosa,第3組卵囊的壁光滑，包括e. deblieckix esuis、e. porci,需先行抱子化后再根據(jù)sf、cf、lo和抱子囊形狀指

12、數(shù) 進彳亍數(shù)值分類，結(jié)果100%的e. debliecki可準確分類，e. suis s unshinesuns h i n e和e.porci的準確率也達93%。在這一分類方法的實際應(yīng)用中，對這7種球蟲子的準確 率總體達到98.9%。稍后plite等又在此基礎(chǔ)上進行了改進，使整個分類過程實現(xiàn)半口動 化，達到了方便、快速、準確，用少量卵囊即可進行球蟲種流行病學(xué)調(diào)查的目的6。這種以形態(tài)為基礎(chǔ)，借助于計算機技術(shù)進行的數(shù)值分類方法，雖然可避免傳統(tǒng)分類方法 的一些缺陷，但仍較為費時，需拍攝許多幅單-卵張的照片，11對光滑型卵張的球蟲子種需 用先行他子化，具實用性受到一定限制。近來，ruttkowski

13、7等根據(jù)球蟲18s rdna序列 中高度保守區(qū)序列設(shè)計了兩個引物（api和19）進行pcr擴增，結(jié)果在所研究的3種球蟲 （e. polita> e.porci、e. scabra）擴增出長度分別為 1 318 bp （前兩種）和 1 316 bp （后考）的dna片段，三考間的相互差異僅為2%,與i. suis的相應(yīng)擴增產(chǎn)物分別有87% （e. polita）和86% （e. scabra和e.porci）相吻合。經(jīng)對擴增關(guān)產(chǎn)物測序,發(fā)現(xiàn)其種間 序列變異主要在680-770bp和1 070-1 100bpz間，以此間序列為基礎(chǔ)分別構(gòu)建成了 e. polita、e. pore is e.

14、scabra 和 t. suis 的特異性正向引物（20-23bp） , pcr 擴增后, 在e. porci形成330bp的擴增產(chǎn)物，而在其它3種則產(chǎn)生560bp的產(chǎn)物。在針對這4種球 蟲特異性引物中,除e. scabra和scab-1與e. porci有交叉反應(yīng)外，其余引物者都有是種 特異性的，能根據(jù)從豬糞便中的新鮮卵囊（無需抱子化）所提取的dna將球蟲方便地鑒定 至種。理論上計算，僅需250個艾美耳球蟲了卵囊和25個等砲球蟲卵龔即可進行準確分 類;且該法可用于對卵囊或砲子囊結(jié)構(gòu)已冇損傷或氏時間保存的陳舊性卵囊進行精確分 類。而在豬等砲球蟲子，同樣以18s rdna的pcr產(chǎn)物進行多態(tài)性分

15、析和聚類分析后發(fā)現(xiàn)， 有斯氏體或無斯氏體的不同種等抱球蟲差異較大，在無斯氏體的等砲球蟲18s rdna與肉 他子蟲科成員間同源性更大-些，而有斯氏體者則與艾美耳科由源性較人，因此有人建議 在系統(tǒng)分類上，i. suis （無斯氏體）應(yīng)歸于肉孑包子蟲科（sarcocystidae） 18 o2致病性和流行病學(xué)1. 1豬艾美耳球蟲過去，一般認為l.suis的致病力較強，?？梢鸩溉樽胸i的嚴重腹瀉，而艾美耳球蟲 的致病菌力較弱。但近年來的流行病學(xué)調(diào)查和試驗研究都表明，豬的艾美耳球蟲病實際上 普遍存在，即使是在亞臨床狀態(tài)，其損失也可能是很大的。豬的數(shù)種艾美耳球蟲（如 e. polita、e. scabr

16、a、e. debl iecki> e. suis> e. spinosa 和 e. neodebliecki 都可在乳豬和斷奶后仔豬引起發(fā)熱、腹瀉、體重降低、食欲下降等癥狀5 ,9, 10,11,12, 13, 14o以 25x104e. neodebliecki砲子化卵囊接種18只30日齡仔豬,結(jié)果在感染后8-11天間出現(xiàn) 嚴重腹瀉，糞便呈現(xiàn)粘液狀帶泡沫，褐色或綠色，常粘附于會陰部，12天時糞便呈現(xiàn)糊 狀，并在13-14天時逐漸恢復(fù)至正常。在8-11天時剖檢實驗豬冇明顯的肉眼病變，表現(xiàn) 為在中后段空腸有卡它性或局灶偽膜性炎癥，粘膜表而有斑點狀岀血和纖維性壞死斑塊， 腸系膜淋巴結(jié)水

17、腫性增人；顯微鏡下對見腸絨毛萎縮，腸上皮細胞灶性壞死，在絨毛頂端 有纖維索性壞死物，并可在上皮細胞內(nèi)見到人量成熟的裂殖體，裂殖子等內(nèi)生性階段蟲 體。豬的艾美耳球蟲病一般發(fā)生斷奶前后的仔豬。但對其流行病學(xué)的研究仍很少。2. 2豬等砲球蟲i.suis是引起豬球蟲病的主耍病源，且常為原發(fā)性，發(fā)生于產(chǎn)房內(nèi)的哺乳期或新斷奶的 仔豬。在世界各國，其發(fā)生率約占仔豬腹瀉性疾病中的15%20%： 16 o拯歐洲國家的流行 病學(xué)調(diào)杳有83%100%的豬場有i.suis感染17,在美國每年導(dǎo)致的經(jīng)濟損失高達1億美 元以上。i. suis主要寄生于豬小腸，偶可寄生于盲腸s unshinesunshine及結(jié)腸，其屮以

18、空腸或腸尤為常見，以5x10卵囊試驗接種1-3 h齡仔豬可引起嚴重腹 瀉，接種7x1043x105卵龔則引起仔豬死亡。腹瀉以糊狀糞便開始，2-3天后轉(zhuǎn)為水 樣，常昱現(xiàn)黃色或灰口色但無血便，有強烈的酸奶味。以2x10 5感染3日齡仔豬后2-4 天開始發(fā)生腹瀉，并一直持續(xù)至感染后10或11 x; 4.5x時即在糞便中出現(xiàn)卵張，第7 天時為排卵囊高峰；在整個病程中分別于5-7天和12天時出現(xiàn)兩次排卵囊高峰，說明有 -次循環(huán)感染出現(xiàn)。顯微鏡下可見腸絨毛萎縮、融合、腸隱窩增生，并有壞死性腸炎的病 理表現(xiàn)，在腸上皮細胞內(nèi)可見到雙核形并以內(nèi)出芽生殖的1型裂殖體和多核的ii型裂殖體 。仔豬出生后對立刻感染i.

19、suiso由于豬等抱球蟲生活史短暫，5-7 s齡吋仔豬生活環(huán)境 中即有人量卵囊，因而等抱球蟲病常發(fā)生于7-14 h齡的乳豬18o但新近的調(diào)查表明更 大日齡的仔豬也可發(fā)生。sayd等證實10-19日齡仔豬的t. suis檢出率更高；哺乳期仔豬 和常規(guī)斷奶后的仔豬卵變檢出率也無明顯差異19。在一次更人范圍的調(diào)查小20, moyer發(fā)現(xiàn)在大型機械化養(yǎng)豬場，3-4周齡的仔豬感染最高。在歷時一年的連續(xù)采樣檢查 中發(fā)現(xiàn)5個種豬場（母豬群155-238只）的264窩仔豬（按總產(chǎn)仔豬窩數(shù)的10%抽樣）中 總體累加感染率為53. 8% （在不同的豬場分別為20%-81. 5%）,至哺乳末期,腹瀉病發(fā)生 率最高，

20、可占采樣禹數(shù)的66. 3%,有63. 4%的腹瀉仔豬糞檢等砲球蟲卵龔陽性糞檢陽性的 豬有78.2%發(fā)生臨床型球蟲病;夏季（66.3%）和秋季（61.0%）的發(fā)生率明顯高于冬季 （37.9%）和春季（47.9%）,且常與致病性大腸桿菌和蘭氏類圓線蟲（strongyloides ransomi）混合感染。不同的斷奶方式對斷奶仔豬的i. suis感染率似有影響，早期斷奶的 仔豬在斷奶后6-7周育成期間3次采樣檢查，感染率從37.5%下降至20. 2%再至4. 1%,與 此同時腹瀉發(fā)生率則從36. 5%降至11. 0%再至3. 3%；而常規(guī)斷奶的仔豬則從17. 2%上升至 21.9%再稍降至21.0%

21、,腹瀉發(fā)生率則分別為34.4%、33. 0%和57%。有自動除糞系統(tǒng)的仔 豬欄中仔豬感染率較低，網(wǎng)孔型地板欄舍內(nèi)仔豬的感染率明顯小于平實型地板欄舍的仔 豬。產(chǎn)房污染是仔豬感染的主要來源，并可造成在同一產(chǎn)房內(nèi)的一窩窩仔豬的連續(xù)感染 21,22。極少量的殘存卵囊即足以導(dǎo)致這種連續(xù)感染22, 窩仔豬中只要一只感染, 很快引起全禽仔豬同群感染，較短的潛隱期和他子化時間及仔豬欄內(nèi)較高的溫度（對達35°c）,使i.suis生活史很易完成，可能是感染在同窩仔豬間迅速擴散的主要因素。但 大多數(shù)研究認為母豬帯山対其仔豬等他球蟲病發(fā)生的流行病學(xué)意義不大。3免疫対豬球蟲病的免疫機理研究還非常少。但一些臨床表現(xiàn)說明仔豬能対球蟲感染產(chǎn)牛:免疫 力。sturt等實驗證明仔豬試驗或自然感染i.suis后對再感染有很強的抵抗力，不但無臨 床癥狀，且很少甚至無卵囊排;lh 口齡仔豬口服4x105砲子化卵龔后出現(xiàn)水樣腹瀉，甚 至引起死亡；但給19 h齡仔豬同樣劑量的卵囊則只引起輕微臨床表現(xiàn)，說明仔豬對 i.suis感染有年齡免疫現(xiàn)象。仔豬出個后3-4周內(nèi)，腸相關(guān)淋巴組織的結(jié)構(gòu)和功能是逐漸 發(fā)育成熟的，隨著年齡的增長，腸道局部抗球蟲免疫的特異性細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的細胞和 體液因子逐漸發(fā)揮作用，且非特異性免疫因子可能比特異性免疫因子冇更重耍的作用。4診斷和防治豬球蟲病發(fā)生