細(xì)胞工程在細(xì)胞融合技術(shù)上的應(yīng)用

1、摘要：細(xì)胞工程是四大生物工程之一，細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的一項(xiàng)心基礎(chǔ)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果，而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。細(xì)胞融合技術(shù)的不斷改進(jìn)一方面表現(xiàn)在融合劑上，另一方面體現(xiàn)在新方法上，再者體現(xiàn)在融合對(duì)象的不斷擴(kuò)展上?，F(xiàn)在新的細(xì)胞融合方法正在嘗試將各種物理、化學(xué)手段綜合應(yīng)用，使細(xì)胞融合的方法和手段向操作更為簡(jiǎn)便，便于量化研究，同時(shí)又能使融合率得到不斷提高的方向發(fā)展。關(guān)鍵詞： 方法 動(dòng)物細(xì)胞融合 植物細(xì)胞融合 應(yīng)用1.細(xì)胞融合常用的技術(shù)1.1生物法 仙臺(tái)病毒HVJ誘導(dǎo)法 1962年日本的岡田善雄偶然發(fā)現(xiàn)了由日本血凝性病毒HVJ或稱仙臺(tái)病毒引起的艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核

2、細(xì)胞的現(xiàn)象+ 岡田善雄的研究為人工誘導(dǎo)體細(xì)胞雜交奠定了方法學(xué)基礎(chǔ), 細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)引起細(xì)胞學(xué)界的高度重視。 1.2化學(xué)法1.2.1鹽類融合法 此法是應(yīng)用最早的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法。鹽類融合劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞小。今后研究應(yīng)提高其融合率,使其對(duì)液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體能夠誘發(fā)融合。1.2.2高鈣和高pH值融合法 Keller首先發(fā)現(xiàn)高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)融合。Melchers用此法將煙草種內(nèi)2個(gè)光敏感突變體誘導(dǎo)融合成功并獲得100余株體細(xì)胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問(wèn)題。1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍華人高國(guó)楠(1974)用聚乙二醇(PEG)為融合劑誘發(fā)大豆與大

3、麥、大豆與玉米、哈加野豌豆與豌豆的融合5。此法比病毒更易制備和控制,活性穩(wěn)定,用PEG作為病毒的替代物誘導(dǎo)細(xì)胞融合。在PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效濃度范圍內(nèi)(50%55%)對(duì)細(xì)胞的毒性應(yīng)進(jìn)一步減小。1.3物理法1.3.1電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù),產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代,目前已成為細(xì)胞融合的有效手段之一。該技術(shù)融合效率高,是PEG的100倍,操作簡(jiǎn)便、快速,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒無(wú)害,可在顯微鏡下觀察融合全過(guò)程6。1.3.2激光融合技術(shù) 1987和1989年德國(guó)海德堡理化研究所采用準(zhǔn)分子激光器使油菜原生質(zhì)體融合,從開始照射到完成融合僅需幾秒鐘7。該法可選擇任意兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行融合,易于實(shí)現(xiàn)特異性

4、細(xì)胞融合,作用于細(xì)胞的應(yīng)力小,定時(shí)定位性強(qiáng),損傷小,參數(shù)易于控制,操作方便,可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個(gè)融合過(guò)程,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,無(wú)菌無(wú)毒性,但它只能逐一處理細(xì)胞。2細(xì)胞融合技術(shù)的最新進(jìn)展2.1基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)隨著微機(jī)電系統(tǒng)mems技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，微電極陣列的設(shè)計(jì)加工制作也日趨成熟，加之微通道網(wǎng)絡(luò)可以整合到生物芯片之上，這將使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺(tái)，利用微流控系統(tǒng)可以按照預(yù)定的要求大量融合異種細(xì)胞.目前，基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)已成為細(xì)胞融合技術(shù)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。優(yōu)點(diǎn)：基于芯片技術(shù)的微流控系統(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞的操控，比如轉(zhuǎn)移、定位、變形等，也可以同時(shí)

5、輸送、合并、分離和分選大量細(xì)胞，細(xì)胞融合在芯片上可以通過(guò)并行或快速排隊(duì)的方式實(shí)現(xiàn).缺點(diǎn)：由于在微通道內(nèi)的腔體容積很小，所以會(huì)大幅減少細(xì)胞融合中所需的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)細(xì)胞融合率和雜合細(xì)胞的成活率會(huì)大大提高.2.2高通量細(xì)胞融合芯片高通量細(xì)胞融合芯片利用微電極陣列在微米范圍內(nèi)（040um）產(chǎn)生的高強(qiáng)度、高梯度輻射電場(chǎng)，使得細(xì)胞在特殊輻射電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生介電質(zhì)電泳力，精確處理和刺激預(yù)定的目標(biāo)細(xì)胞，從而使目標(biāo)細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方向（可以是任何預(yù)先設(shè)計(jì)好的方向）以預(yù)定的速度（可以是不同種的細(xì)胞以不同的速度定向）移動(dòng)，從而按照設(shè)計(jì)要求準(zhǔn)確地、大批量地得到目標(biāo)細(xì)胞配型，集成微電極陣列的微流控系統(tǒng)，可以方便靈活

6、地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的操作、隔離和轉(zhuǎn)移.由于在微通道內(nèi)微電極間距可以做得很小，因此獲得同樣強(qiáng)度的輻射電場(chǎng)強(qiáng)度只需施加較低電壓的交變電場(chǎng)和脈沖即可，不用加載昂貴的高電壓發(fā)生裝置例如, 在20um 的電極對(duì)間距施加14 V的脈沖就相應(yīng)地可以獲得7 kV/cm 的高強(qiáng)度場(chǎng)強(qiáng), 這足以形成細(xì)胞融合所需要的電場(chǎng)強(qiáng)度。高通量細(xì)胞融合芯片可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電誘導(dǎo)融合等方法相互結(jié)合，比如：在細(xì)胞融合緩沖液中加入少量的peg可大大提高細(xì)胞的融合率.此外，二價(jià)陽(yáng)離子以及蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，融合率也可大幅提高$ 然而，截至目前各國(guó)與此相關(guān)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)工作只有幾篇文章見諸報(bào)端，許多構(gòu)想也只是在理論層次上的探討$2.3

7、空間細(xì)胞融合技術(shù)由于地球引力的存在，有液泡的原生質(zhì)體與無(wú)液泡的原生質(zhì)體的密度差加大，異源細(xì)胞間的融合得率十分有限. 在利用動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程中，由于無(wú)法排除地球引力的影響，要提高淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難世紀(jì)9 年代以來(lái)，人們?cè)诳臻g材料科學(xué)的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù).大量的飛行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在微重力條件下酵母細(xì)胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影響，而雜種細(xì)胞的活力增加可能是由細(xì)胞排列時(shí)間縮短引起的.在取得這些成功實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究融合后的細(xì)胞在空間培養(yǎng)的可能性已經(jīng)具備.2.4離子束細(xì)胞融合技術(shù)雷電、輻射等自然過(guò)程

8、中產(chǎn)生的低能離子可作用于生物體，20世紀(jì)80年代中期，中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所的余增亮等人發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了離子注入生物效應(yīng)和粒子沉積生物效應(yīng)的存在，建立了質(zhì)量、能量、電荷三因子作用機(jī)制體系. 在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動(dòng)量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場(chǎng)的改變. 據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)。此項(xiàng)研究一旦成功，將改變傳統(tǒng)的一對(duì)一細(xì)胞融合的弊端，減少供體細(xì)胞導(dǎo)入的染色體范圍，使融合更具目的性，大大減少篩選的工作量，將是細(xì)胞融合研究的一大進(jìn)步.2.5非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)，是利用某種外界因素- 常為：射線，輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選

9、擇性地破壞其細(xì)胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第2種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活.然后融合來(lái)自這2個(gè)原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合，或使前者被打碎的細(xì)胞核染色體片段中的個(gè)別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本之一全部?jī)?yōu)良性狀的同時(shí)改良其某個(gè)不良性狀。3. 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用3.1動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用3.1.1用于基因定位和繪制人類基因圖譜 JP2 雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與否與細(xì)胞的某一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系，從而可以實(shí)現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在

10、人和鼠的融合細(xì)胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，并證明利用這一特點(diǎn)有可能對(duì)人染色體上的基因進(jìn)行定位。1970年Ruddle等開始系統(tǒng)地用融合細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)繪制人類基因圖。3.1.2 用于生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗 一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表面抗原不能誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）與腫瘤細(xì)胞融合形成的樹突狀細(xì)胞疫苗能夠有效地激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，無(wú)論是在動(dòng)物研究還是在人體早期臨床試驗(yàn)中都證明這是一種方便、安全、可行的方法4。并且由于融合細(xì)胞可以在體內(nèi)存活，因此可以維持較長(zhǎng)時(shí)期的免疫應(yīng)答，有利于誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫。腫瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式與DCs結(jié)

11、合，或者將腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)化進(jìn)DCs中，使其內(nèi)源性地表達(dá)抗原，這兩種方法在抗腫瘤免疫應(yīng)答中均有效5-9，但適于免疫的腫瘤抗原及其基因難以鑒定從而限制了其應(yīng)用2，有實(shí)驗(yàn)證明用這兩種方法制備的腫瘤疫苗的免疫原性不及腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞直接融合的異核細(xì)胞，融合細(xì)胞保持了DCs和腫瘤細(xì)胞的特性，并且能高效地將未知的腫瘤抗原提呈給免疫系統(tǒng)，今后腫瘤疫苗的研究工作將集中在疫苗的純化上，以期用高度純化的雜合細(xì)胞來(lái)激發(fā)更為有效和強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，使得這種方法在臨床應(yīng)用中更為實(shí)際10-11。 3.1.3 用于生產(chǎn)單克隆抗體 使小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成能產(chǎn)生單克隆抗體（monoclonal antibody

12、,McAb）的雜交瘤細(xì)胞，單克隆抗體具有專一性和靈敏性，作為理論研究的工具在病原檢測(cè)和疾病治療以及食品安全領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。1985年，中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所研制成功抗北京鴨紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，同時(shí)還與有關(guān)醫(yī)學(xué)部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。在神舟四號(hào)上我國(guó)自制的細(xì)胞電融合儀分別進(jìn)行了植物細(xì)胞的電融合試驗(yàn)和動(dòng)物細(xì)胞的電融合試驗(yàn)，動(dòng)物細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)采用純化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，目的是獲得乙肝單克隆抗體。目前有關(guān)單位利用McAb作用的專一性這一特點(diǎn)正在探索用“生物導(dǎo)彈”對(duì)癌癥進(jìn)行早期診斷和治療。3.1.4用于動(dòng)物育種

13、體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer technique,SCNT）是將細(xì)胞核移植到另一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動(dòng)物體細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞難以發(fā)育再生為一個(gè)個(gè)體，但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細(xì)胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進(jìn)行的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)1。3.1.5用于細(xì)胞療法 SCNT將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合，融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是多能干細(xì)胞，對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來(lái)源問(wèn)題

14、，并且也避免了宿主對(duì)外來(lái)物的免疫排斥。3.1.6 動(dòng)物體細(xì)胞融合在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用 (1)用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系和個(gè)體發(fā)育。20世紀(jì)70年代初，誕生了細(xì)胞拆合工程。Carter于1967年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素B（CB）能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L細(xì)胞的排核作用。Prescott等1972年首先應(yīng)用離心術(shù)結(jié)合CB分離哺乳類細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功，為研究哺乳類細(xì)胞的核、質(zhì)相互關(guān)系、細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新的途徑12。異核體和細(xì)胞雜合子被用來(lái)確定基因調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子決定一個(gè)細(xì)胞表型消失或得以保持以及賦予受體新性狀；通過(guò)對(duì)供體和受體細(xì)胞所有細(xì)胞特異性基因表達(dá)研究，細(xì)胞融合有助于人們了解發(fā)育，特別是在研究

15、基因編碼的可逆性方面。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，血紅蛋白存在著從胚胎型向胎兒型（幼蟲）最終向成人型的轉(zhuǎn)換，對(duì)這些轉(zhuǎn)換進(jìn)行研究，除了揭示基因順序表達(dá)的調(diào)控機(jī)理外，在醫(yī)學(xué)方面也有意義，人們可以部分或全部扭轉(zhuǎn)從胚胎型向胎兒型的轉(zhuǎn)變從而治療鐮刀型貧血病13。（2）用于揭示疾病發(fā)生的機(jī)制。與其他技術(shù)結(jié)合使用，細(xì)胞融合是一種揭示疾病機(jī)理的有效方法。例如，細(xì)胞融合與免疫熒光，生化分析，電鏡技術(shù)相結(jié)合，Lattanzi G等對(duì)肌肉萎縮癥發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行了研究14。（3）用于膜蛋白動(dòng)力學(xué)研究。細(xì)胞融合技術(shù)與顯微鏡技術(shù)結(jié)合使用被用來(lái)研究膜蛋白動(dòng)力學(xué)以及這些膜蛋白之間的關(guān)系，Péter Nagy等的研究發(fā)現(xiàn)大型膜蛋

16、白群之間(主要組織相容性復(fù)合物major histocompatibility complex,MHC，包括MHC 和MHC ）發(fā)生蛋白質(zhì)交換，并且群內(nèi)蛋白之間也發(fā)生蛋白移位，小蛋白群之間也存在著蛋白重排現(xiàn)象。3.2植物細(xì)胞融合技術(shù) 3.2.1基礎(chǔ)理論研究 Yamagishi等設(shè)計(jì)了一種新的高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系,增加了不對(duì)稱雜交屬內(nèi)種間細(xì)胞融合率16?？梢栽O(shè)想,細(xì)胞融合技術(shù)改善后,可把人參和冬蟲夏草的細(xì)胞融合產(chǎn)生新的品種,并具備它們各自特有的藥效。3.2.2改善作物品質(zhì) 雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象在生物界普遍存在,利用這一現(xiàn)象是提高農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量的有效途徑之一,即可以利用雄性不育系進(jìn)行雜交一代種子生產(chǎn)。核

17、基因控制的雄性不育的保持系很難解決,而細(xì)胞質(zhì)雄性不育的不育系、恢復(fù)系和保持系較易通過(guò)體細(xì)胞雜交短期內(nèi)得到。3.2.3培育抗逆植株 Shelley用馬鈴薯二倍體作親本經(jīng)過(guò)體細(xì)胞雜交得到抗科羅拉多馬鈴薯甲蟲的四倍體體細(xì)胞雜種;Bastia等對(duì)耐霜凍的野生種和栽培種進(jìn)行體細(xì)胞雜交,獲得的所有體細(xì)胞雜種都比栽培種親本耐霜凍,其中有3株比野生種親本的耐性還高17。3.2.4應(yīng)用于種質(zhì)保存和有用物質(zhì)生產(chǎn)目前可將各種細(xì)胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體,從而有可能引起細(xì)胞遺傳性的改變,為某些珍稀植物的快速繁殖、植物的復(fù)壯提供可行的方法,還可應(yīng)用于種質(zhì)保存、無(wú)性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)

18、18。3.3微生物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用微生物細(xì)胞融合技術(shù)一方面用于生物藥品的生產(chǎn),包括抗生素、生物活性物質(zhì)、疫苗等;另一方面為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種,如釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交,分離子后代中個(gè)別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。4.結(jié)語(yǔ)；從目前的研究進(jìn)展來(lái)看, 細(xì)胞工程的前景是光明的, 值得提出的是它建立在生物資源的可循環(huán)性上即節(jié)約能源, 又有利于保持自然條件。然而對(duì)它也應(yīng)有個(gè)清醒而正確的估價(jià)。目前除少數(shù)產(chǎn)品外， 如某些單抗以外, 大多數(shù)項(xiàng)目離表現(xiàn)明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益還有很長(zhǎng)一段跪離, 其中涉及兩個(gè)主要問(wèn)題, 一是大量基礎(chǔ)性的研究和開發(fā)有待進(jìn)一步發(fā)展。二是如何將實(shí)驗(yàn)室中的成果轉(zhuǎn)為生產(chǎn)力, 這方面必須有工程技術(shù)人員的協(xié)同工作才能完成。但是也有其不利的一面，如細(xì)胞融合的確切機(jī)理至今仍不清楚,融合后獲得