微生物限度檢查操作規(guī)程(中國(guó)藥典2015版四部通則)

1、標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 1 頁(yè)起 草 人審 核 人批 準(zhǔn) 人起草日期審核日期批準(zhǔn)日期起草部門質(zhì)量管理部頒發(fā)部門辦公室生效日期一、范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物限度的檢查方法和操作要求；適用于檢品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌的檢查。二、引用標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)藥典2015年版(通則1105-1106)三、目錄 1微生物限度標(biāo)準(zhǔn)2設(shè)備、儀器及用具3消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基4檢查總則（通則1105：非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法，通則1106 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法）5微生物計(jì)數(shù)法檢查6控制菌檢查法7實(shí)驗(yàn)技術(shù) 8. 附件1微

2、生物限度標(biāo)準(zhǔn)非無(wú)菌藥用原料及輔料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌藥用原料及輔料103102*未做統(tǒng)一規(guī)定。1.1成品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品 名法 定 標(biāo) 準(zhǔn)內(nèi) 控 標(biāo) 準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌需氧菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌大腸埃希菌沙門菌大腸埃希菌沙門菌乳糖1000100 無(wú)10050無(wú)水乳糖10010/10g/100g10010/10g/100g蔗糖無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)10050(1)“”為不

3、得檢出。(2)目測(cè)霉變者以不合格論。(3)“無(wú)”為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)或無(wú)相應(yīng)規(guī)定。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 2 頁(yè)1.2工藝用水微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品 名法 定 標(biāo) 準(zhǔn)內(nèi) 控 標(biāo) 準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌總數(shù)(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活飲用水100不得檢出100不得檢出純化水lOO不得檢出80不得檢出1.3內(nèi)包裝材料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品 名 (單位)需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)控制菌需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)控制菌藥用聚乙烯烴塑料袋(100cm2)1000cfu10

4、0cfu100cfu10cfu說(shuō)明：1“”為每100 cm2中不得檢出。2目測(cè)霉變者以不合格論。3“無(wú)”為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)或無(wú)相應(yīng)規(guī)定。2設(shè)施、儀器及用具2.1、設(shè)施：2.1.1微生物限度檢查室及相關(guān)設(shè)施：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。2.1.2其他設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器；細(xì)菌培養(yǎng)箱（3035）；霉菌培養(yǎng)箱（2528）；電爐（或其他適宜的加熱裝置）；恒溫水?。浑姛岣稍锵洌?50300）；電冰箱。生化試劑儲(chǔ)存箱。2.2儀器及器皿2.2.1菌落計(jì)數(shù)器；顯微鏡（

5、1500X）；電子天平或藥物天平（感量0.1g）；pH系列比色計(jì)。2.2.2玻璃器皿：錐形瓶（250300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干）、研缽（玻璃或陶瓷制，1012cm）、培養(yǎng)皿（9 cm）、量筒（100 ml）、試管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01， 10 ml分度0.1）、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。2.2.3新購(gòu)的玻璃器皿的清潔：先用流水沖洗，浸泡于1%2%鹽酸（工業(yè)用）液中約26小時(shí)，除去游離堿質(zhì)，再用流水沖洗。用于化學(xué)分析的玻璃儀器，需用重鉻酸鉀清潔液浸泡數(shù)分鐘后，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗23次，晾干備用。2.3用過(guò)的玻璃器皿：2.3.1未被病原微

6、生物污染的器皿：可隨時(shí)洗滌。用清水沖洗（或浸泡），除容量?jī)x器外，可用毛刷和肥皂粉，內(nèi)外刷洗，再用清水涮洗干凈，晾干備用。容量?jī)x器宜用清潔液浸泡或涮洗，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗23次。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 3 頁(yè)2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先經(jīng)過(guò)滅菌處理后再按常法洗滌。試管及培養(yǎng)皿：先正放或直立于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121滅菌30 分鐘。趁熱傾出培養(yǎng)物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮凈。吸管：全部直立浸沒(méi)于清潔液的長(zhǎng)筒形容器中，筒底應(yīng)襯有棉或橡皮墊，以防管尖損壞。24小時(shí)后，逐支用流水反復(fù)沖洗潔凈，晾干后包扎滅

7、菌備用。載、蓋玻片：應(yīng)分別浸泡于清潔液1224小時(shí)后，取出用流水沖洗，再放入3%5%肥皂水或5%碳酸鈉液內(nèi)煮沸1015 分鐘，待自然冷卻后，再用流水沖洗。瀝干后置95%乙醇中浸泡，晾干備用。2，3，3玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5 cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞），再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽121滅菌30 分鐘，烘干備用。2.4用具2.4.1大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%75

8、%乙醇溶液浸泡）。2.4.2無(wú)菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑45mm、長(zhǎng)度610cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12 cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基3.1消毒液、稀釋劑及試液。3.1.1 0.1%苯扎溴銨溶液：供洗手、擦拭操作臺(tái)面用。3.1.2 5%石碳酸溶液：配制后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用，抑或選用其他適宜消毒液。3.1.375%乙醇溶液：配好后制乙醇

9、棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.40.9%無(wú)菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121滅菌20分鐘。3.1.5司盤-80、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80：供非水溶性供試品供試液制備用。3.1.6無(wú)菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10 ml。3.1.7甲基紅指示液：取甲基紅0.1g，加入95%乙醇300ml，水適量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8V-P試液：氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g，加水使溶解成100ml；-萘酚乙醇試液：取-萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇使溶解成100ml。3.1.9革蘭染色液：沙黃染液：取沙黃0

10、.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸銨溶液80ml，混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存；碘試液：取碘化鉀2.0g，加水35ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀釋至300ml，置密標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 4 頁(yè)閉棕色瓶中儲(chǔ)存。3.1.10中性紅指示液：取中性紅1.0g，研細(xì)，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。變色范圍 pH6.88.0（紅黃）。 3.1.11亞甲藍(lán)指示液：取亞甲藍(lán)0.5g，加水使溶解成

11、100ml。3.1.12溴麝香草酚藍(lán)指示液：取溴麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍 pH6.07.6（黃藍(lán)）。3.1.13酸性品紅指示液：以酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時(shí)，濾過(guò)，即得。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)色，在倒管內(nèi)早期發(fā)酵易觀察，不易被還原。變色范圍 pH6.07.4（紅黃）。3.1.14曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15靛基質(zhì)試液：取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95

12、%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。3.2培養(yǎng)基3.2.1培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存3,2,1,1溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷器內(nèi)。加入純化水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。3.2.1.2在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將純化水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置1015 分鐘，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要加熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。3.2.1.3校正酸堿度：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H值。測(cè)定pH值是培養(yǎng)基配制過(guò)程

13、中的重要步驟之一，干燥培養(yǎng)基一般已校正過(guò)pH值，用時(shí)也必須再驗(yàn)證。pH值測(cè)定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基中觀察其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH值不符，可用酸或堿液加以校正。一般用氫氧化鈉校正的弱堿性培養(yǎng)基，高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH值高0.2左右，滅菌后基本合適。調(diào)整pH值后要加熱過(guò)濾，使培養(yǎng)基澄清。3.2.2培養(yǎng)基的分裝：3.2.2.1液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅菌前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加入成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。3.2.2.2固體培養(yǎng)基一般分裝在250 ml、500 ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。平皿：如傾注平

14、皿，應(yīng)在無(wú)菌室中放置34小時(shí)，如用塑料平皿須在35培養(yǎng)箱中倒置3060 分鐘。水蒸氣會(huì)自然蒸發(fā)。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積的1/5，滅菌后趁熱斜放于細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝時(shí)注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，避免污染。制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。3.2.3培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基多采用121、103.42kPa滅菌 15 分鐘，但容器和裝量較大時(shí)，可延長(zhǎng)至20 分鐘。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的冷空氣，再

15、逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全殺滅微生物的目的。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 5 頁(yè)3.2.4培養(yǎng)基的儲(chǔ)存：保存培養(yǎng)基的時(shí)間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的程度及有無(wú)污染而定，已制備好培養(yǎng)基要保存于冷暗處或冰箱中，但由于各種培養(yǎng)基的性質(zhì)不同，不可能固定一個(gè)保存期限。制備好的平板或試管培養(yǎng)基，為防止水分蒸發(fā)，應(yīng)置于塑料袋內(nèi)，4保存，可延長(zhǎng)使用期限。微量生化反應(yīng)管熔封于細(xì)玻管內(nèi)，室溫下可保存1年左右。3.3注意事項(xiàng)：3.3.1采用干燥培養(yǎng)基時(shí)，按說(shuō)明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以確定配制時(shí)瓊脂的

16、用量。試劑規(guī)格要求應(yīng)為化學(xué)純（CP）以上規(guī)格，其中不能含有對(duì)細(xì)菌、霉菌、大腸桿菌生長(zhǎng)有害的抑制物。3.3.2配制的培養(yǎng)基不應(yīng)該有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，并應(yīng)于2小時(shí)內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。3.3.3培養(yǎng)基的分裝量不得超過(guò)容器的2/3，以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。3.3.4配制培養(yǎng)基的pH值測(cè)定時(shí)，其波動(dòng)范圍應(yīng)在規(guī)定的pH±0.2之內(nèi)，還需注意高壓滅菌后的pH值變化。3.3.5每批培養(yǎng)基均應(yīng)有配制記錄，包括名稱、配制量（各種成分用量）、配制者、校對(duì)者、配制日期以及性能和無(wú)菌試驗(yàn)。3.3.6每批培養(yǎng)基在用于樣品的分離鑒定之前均應(yīng)作性能試驗(yàn)，以保

17、證微生物檢驗(yàn)的質(zhì)量。性能試驗(yàn)須用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行預(yù)試，符合要求方可應(yīng)用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松緊應(yīng)適宜，過(guò)松易污染雜菌，過(guò)緊影響透氣性；每次用后需高壓滅菌并隨即烘干，要防塵、防霉；變硬無(wú)彈力時(shí)需更換。3.3.8各種試管應(yīng)先配上合適的棉塞，待高壓滅菌后再分裝培養(yǎng)基，可防止污染。3.3.9培養(yǎng)基配制時(shí)，應(yīng)先將有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、鹽類和瓊脂配好，經(jīng)調(diào)節(jié)pH值、加熱并煮沸溶化后再濾清；濾清時(shí)注意趁熱過(guò)濾，濾除異物、沉淀后，應(yīng)將蒸發(fā)失去的溶液量按原溶液量加純化水補(bǔ)足。3.3.10應(yīng)嚴(yán)格遵守各種培養(yǎng)基規(guī)定的滅菌溫度和時(shí)間，滅菌后培養(yǎng)基不得有混濁現(xiàn)象，每瓶配制并滅菌后的培養(yǎng)基、稀釋

18、劑均應(yīng)在外表清楚標(biāo)明滅菌日期。3.3.11每批稀釋劑、培養(yǎng)基均應(yīng)有空白試驗(yàn)，合格后方能使用。3.3.12滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存，放置時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，一般在兩周內(nèi)用完。久存培養(yǎng)基失水過(guò)多、固體干涸變形、液體出現(xiàn)沉淀、棉塞松弛或脫落者均不得使用。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，開(kāi)啟后不宜再用。3.3.13勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成份過(guò)度受熱而破壞，應(yīng)用水浴或微波爐加熱。4. 檢查總則（1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法）4.1微生物計(jì)數(shù)法適用范圍：系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)

19、行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢査。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢査時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 6 頁(yè)4.2微生物計(jì)數(shù)法4.2.1 適用性試驗(yàn)用菌株(表1)試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌( Staphylococcus

20、a u reus) C C M C C (B )26 003胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3 0 3 5 C ，培養(yǎng)時(shí)間1824小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（M P N 法），培養(yǎng)溫度30-35, 培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCMCC ( B )10 104胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35，培養(yǎng)時(shí)間1824小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆

21、胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（M P N 法），培養(yǎng)溫度30-35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò) 3天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌.Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間18-24小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（M P N 法），培養(yǎng)溫度30-35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不大于lOOcfu白色

22、念珠菌(Candida albicans)CCMCC(F)98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間2-3天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（M P N 法不適用）培養(yǎng)溫度3 0 3 5 °C，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共

23、 19 頁(yè) 第 7 頁(yè)黑曲霉（Asper君山wsniger) C C M C C (F )98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間57 天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（M P N 法不適用）培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于lOOcfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉

24、菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢査方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.2.2 計(jì)數(shù)方法：包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method, 簡(jiǎn)稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，M P N法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢査和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行

25、方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。4.2.3 菌種及菌液制備4.2.3.1菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。4.2.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見(jiàn)（表1）。菌液制備按(表1)規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培

26、養(yǎng)物加人35ml含0. 05% (m l/m l)聚山梨酯8 0的pH7_0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在2 4小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 ,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。4.2.4陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.2.5培養(yǎng)基適用性

27、檢査微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。按(表1) 規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 8 頁(yè)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.52 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。4.3計(jì)

28、數(shù)方法適用性試驗(yàn)4.3.1供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過(guò)45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)1 小時(shí)。常用的供試液制備方法如下（如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法）4.3.1.1水溶性供試品取供試品，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7. 2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1 : 1 0供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步1 0倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。4.3.1.2水不溶

29、性非油脂類供試品取供試品，用pH7. 0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7. 2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1 : 1 0供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1 %的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步1 0倍系列稀釋。4.3.1.3油脂類供試品取供試品，加人無(wú)菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯8 0或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò)4 0 t：(特殊情況下，最多不超過(guò)45°C) ，小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然

30、后加人預(yù)熱的稀釋液使成1 : 1 0 供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.4需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品取供試品，剪碎，加P H 7 .0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或P H 7 .2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1 : 1 0的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加人P H 6 .8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7. 6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中，振搖，

31、使溶解，制成1:10 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.5氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置一20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無(wú)菌注射器從每一容器中吸出藥液于無(wú)菌容器中混合，然后取樣檢査。4.3.1.6貼劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無(wú)菌多孔材料(如無(wú)菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯

32、8 0或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少3 0分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 9 頁(yè)4.3.2. 接種和稀釋 按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。4.3.2.1試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每lm l供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于lOOcfu。4.3.2.2供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試

33、驗(yàn)組操作。4.3.2.3菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加人試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。4.3.2.4若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加人試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。4.4抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收” 規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50% ,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。4.4.

34、1增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。4.4.2加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2 )可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0 .52 范圍內(nèi)。表2 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑酚類、乙醇、醛類、醛類季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸水銀水銀、汞化物、醛類EDTA、唆喏酮類抗生素磺胺類內(nèi)酰胺類抗生素亞硫酸氫鈉吸附物稀

35、釋法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對(duì)氨基苯甲酸內(nèi)酰胺酶4.4.3采用薄膜過(guò)濾法4.4.4上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒(méi)有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 10 頁(yè)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要

36、求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢査。4.5供試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或M PN法。4.5.1平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表1 中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法：取照上述“ 供試液的制備” “ 接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液lml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入1520ml溫度不超過(guò)45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培

37、養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法：取1520ml溫度不超過(guò)45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直徑90mm的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。4.5.2薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相

38、應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備” “ 接種和稀釋” 和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于lg 、lm l或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多

39、時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。4.5.3MPN法M P N法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒(méi)有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用M P N法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述“供試液的制備” “ 接種和稀釋” 和“ 抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液至少3 個(gè)連

40、續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3 份lm l分別接種至3 管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035°C培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 11 頁(yè)酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12 天，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表3 查被測(cè)供試品每l g 或每lm l中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表3 微生物最可能數(shù)檢索表生長(zhǎng)管數(shù)需氧菌總

41、數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g 或m l數(shù)M P N /g 或 m l下限上限0. 10. 010.001000<309.4001309.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.53520114435202205382101543821120538212279942202154022128994222359942302999423136994300235943013891043

42、0264161813104391813117517190標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 12 頁(yè)312120303603131603038032093183603211503038032221030400323290909903302409099033146090198033211002004000333>1100注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用l g (或m l )、0. l g ( 或m l )和O.Olg(或m l )時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低1 0 倍；如改用O .O lg ( 或m l)、O.OOlg( 或m l )和O.OOOlg( 或m

43、l )時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加1 0 倍，其余類推。5. 微生物計(jì)數(shù)法檢查5.1計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0 .52 范圍內(nèi)；采用M P N法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢査。5.2供試品檢查5.2.1檢驗(yàn)量：檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量(g、m l或cm

44、2) 。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2 個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;膜劑為100cm2; 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4 丸，膜劑還不得少于4 片。5.2.2供試品的檢査按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行

45、偏差調(diào)査。5.3平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平板。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035°C培養(yǎng)35 天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025°C培養(yǎng)57 天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)標(biāo) 題微生物限度檢

46、查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 13 頁(yè)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最髙的平均菌落數(shù)，算lg 、lm l或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位4 效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以< 1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.4 薄膜過(guò)濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于l g 、lm l或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的

47、供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過(guò)濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)lOOcfu菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于lg 、lm l或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以< 1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾lg 、lm l或10cm2供試品），或< 1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.5 MPN 法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在3035X：培養(yǎng)35天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適用

48、性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3 査每l g 或lm l供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。5.6結(jié)果判斷 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用M P N法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋

49、如下： lO cfu：可接受的最大菌數(shù)為20; 102 cfu：可接受的最大菌數(shù)為200; 103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000，依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢査結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。6控制菌檢查法（非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度：控制菌檢查法）6.1控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢査供試品中是否存在特定的微生物。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等6.1.1供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)

50、，不再?gòu)?fù)試。6.1.2供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度6.1.3檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105) ” 。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 14 頁(yè)6.1.4如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。6.2培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法6.2.1適用性試驗(yàn)6.2.1.1供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢査。6.2.1.2供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試

51、驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。6.2.1.3若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。6.2.2菌種及菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) CCMCC (B )26 003銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) CMCC ( B)10 104大腸埃希菌(EsdieWchacoa) CCMCC(B)44 102乙型副傷寒沙門菌（Salmonell

52、aparatyphiB) CCMCC(B)50 094白色念珠菌（canidia Albicans ) CCMCC(F)98 001生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CCMCC( B ) 6 4 941菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，3035°C培養(yǎng)1824小時(shí)；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025°C培養(yǎng)23 天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下3035°C培養(yǎng)2448小時(shí)或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中30

53、35°C培養(yǎng)1824小時(shí)。上述培養(yǎng)物用PH7. 0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28°C，可在24小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，孢子懸液可保存在28*C，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。6.2.3陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。6.2.4培養(yǎng)基適用性檢查6.2.4.1控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查?？刂凭鷻z査用培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目

54、包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢查項(xiàng)目及所用的菌株見(jiàn)表1。6.2.4.2液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢査分別接種不大于lOOcfu的試驗(yàn)菌(表1 )于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。6.2.4.3固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢査用涂布法分別接種不大于lOOcfu的試驗(yàn)菌（表1 )于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。標(biāo) 題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共 19 頁(yè) 第 15 頁(yè)表1 控制菌檢査用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力和指