干細(xì)胞的研究進(jìn)展和應(yīng)用

1、干細(xì)胞的研究與應(yīng)用摘要 干細(xì)胞指具有無(wú)限制分裂能力，同時(shí)亦可分化成特定組織細(xì)胞，在細(xì)胞生物發(fā)育階段屬于較原始時(shí)期的細(xì)胞。依干細(xì)胞可分化能力限制，又可分為全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞。由于干細(xì)胞具有這種分裂和分化的能力所以其成為組織再生，疾病治療，逆轉(zhuǎn)衰老等研究的實(shí)驗(yàn)材料。本文主要介紹幾種干細(xì)胞相關(guān)的研究，并討論干細(xì)胞的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；成體干細(xì)胞；應(yīng)用1. 干細(xì)胞的定義干細(xì)胞是具有自我更新能力和多向分化能力的細(xì)胞。按干細(xì)胞來(lái)源及分化潛能，干細(xì)胞可分為全能干細(xì)胞和特定組織干細(xì)胞(成體干細(xì)胞來(lái)源于成體組織如脂肪組織、外周血、骨骼、皮膚和肝臟等)。前者能發(fā)育分化形成完整的機(jī)體，后者是一種或

2、幾種組織的起源細(xì)胞。按其分化的差異性分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專(zhuān)能干細(xì)胞。2. miRNA與干細(xì)胞2.1參與干細(xì)胞譜系形成的信號(hào)通路 例如而R-125的兩個(gè)異構(gòu)體(miR-125a和miR-125 b)可以通過(guò)抑制人類(lèi)胚胎干細(xì)胞表達(dá)SMAD4來(lái)調(diào)控神經(jīng)元，導(dǎo)致SMAD2/3和SMAD1/5的磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)峪和表皮細(xì)胞的自我更新。而RNA是缺血預(yù)處理信號(hào)的效應(yīng)器，缺血預(yù)處理通過(guò)激活A(yù)kt和ERK1/2信號(hào)通路，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1a顯著減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。miR-21通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的EPK-MAP激酶信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化和心力衰竭，通過(guò)特異性抗

3、體沉默miR-21的壓力超負(fù)荷小鼠模型顯示，心肌成纖維細(xì)胞EPK-MAP激酶活性明顯下降，心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化明顯減輕，心功能明顯改善1。2.2參與干細(xì)胞治療 口前研究表明，細(xì)胞從一種干性狀態(tài)向其他形態(tài)分化的轉(zhuǎn)變是通過(guò)染色質(zhì)重構(gòu)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制及DNA的組蛋白修飾機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的。最近miRNA作為一個(gè)新的角色已提出，這個(gè)小的非編碼的mRNA可用于干細(xì)胞治療，該假說(shuō)已被證明，在早期胚胎發(fā)育中可表達(dá)而R-302/miR-367特定的胚胎干細(xì)胞，但在分化后迅速下降，因此，許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了miR-302/miR-367介導(dǎo)的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)的研究。3. 干細(xì)胞的種類(lèi)3.1胚胎干細(xì)胞20世紀(jì)80

4、年代初英國(guó)劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman用延緩著床的胚泡、美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的Martin用條件培養(yǎng)基分別成功分離、體外培養(yǎng)了小鼠早期胚胎的內(nèi)團(tuán)細(xì)胞或上胚層細(xì)胞，建立了胚胎干細(xì)胞系。人胚胎干細(xì)胞是多能干細(xì)胞的主要來(lái)源，研究人員已經(jīng)通過(guò)干細(xì)胞培養(yǎng)出血液、內(nèi)皮、心肌、骨骼、神經(jīng)細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem ceIIs，ES CeIIs），是動(dòng)物早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或原始生殖細(xì)胞（primordiaIgerm ceIIs，PGC）經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選出具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。它在發(fā)育階段上類(lèi)似于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（inner ceII mass，簡(jiǎn)稱(chēng)ICM 細(xì)胞）

5、，具有與早期胚胎相似的分化潛能和正常二倍體核型的特點(diǎn)，兼有胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞的類(lèi)似特性，既可進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化和篩選，又可分化成包括生殖系在內(nèi)的各種組織。Esc表達(dá)一些特殊的分子標(biāo)志，如細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Oct3“、Rex一1和uTF一1等，堿性磷酸酶(AP)、階段特異性胚胎抗原(SSEAl、SSEA一3、SSEA4)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控抗原(TRA一160、TRA一1-81)、同源蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Nanog)等在啟動(dòng)分化過(guò)程中，這些分子的表達(dá)量都有明顯的下調(diào)2。3.2生殖干細(xì)胞 1992年在哺乳動(dòng)物的生殖腺首次發(fā)現(xiàn)了生殖干細(xì)胞，這一干細(xì)胞群目前多來(lái)源于新生或成年鼠睪丸或卵巢組織，終生具有再生功能，生殖干

6、細(xì)胞表達(dá)多種干細(xì)胞表面分子。生殖干細(xì)胞的表面標(biāo)記物主要有：DDX4、POU5F1(OCT34)和TFAP2C(AP一2y)。小鼠的生殖干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在蛋白組學(xué)、表觀遺傳學(xué)以及一些干細(xì)胞相關(guān)基因修飾上具有很大的相似性。在胚胎發(fā)育早期，外胚層形成之前，伴隨著原腸胚性腺的發(fā)育，外胚層的部分細(xì)胞發(fā)生著原始生殖細(xì)胞特化。在原腸期，來(lái)源于胚胎外胚層和內(nèi)臟內(nèi)胚層的骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為旁分泌的信號(hào)使得近端外胚層的一小部分細(xì)胞特化成原始生殖細(xì)胞祖細(xì)胞，它的一些體細(xì)胞相關(guān)基因如Blimpl的表達(dá)受到抑制導(dǎo)致它們最終分化為生殖細(xì)胞系。特化的原始生殖細(xì)胞開(kāi)始從它們發(fā)生的初始位置后原條遷移向中胚層3。3.3誘導(dǎo)多潛能

7、干細(xì)胞借助基因?qū)爰夹g(shù)將某些特定因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，同時(shí)可選擇性地在培養(yǎng)液中加入特定的小分子物質(zhì)，即可將體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞（iPS），此類(lèi)細(xì)胞在克隆形態(tài)、生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志物、基因表達(dá)模式、表觀遺傳學(xué)特征、擬胚體(embryoidbodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合體(chimeras)形成(針對(duì)小鼠)等方面與胚胎干細(xì)胞非常相似。體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞所需轉(zhuǎn)錄因子組合需根據(jù)體細(xì)胞種類(lèi)及其相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平或額外加入的小分子化合物加以靈活選擇。一般Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 組合或Oct4、Sox2、Klf4組合即可將體細(xì)胞重編程為iP

8、S細(xì)胞，只是后一種組合重編程的效率較前一種低許多。當(dāng)選用小分子化合物時(shí)，可大幅度提高重編程效率和/或減少轉(zhuǎn)錄因子使用個(gè)數(shù)，增加轉(zhuǎn)錄因子使用個(gè)數(shù)(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc 和Klf4)，也可大幅度提高重編程效率又如Oct4 和Klf4 2 種基因，甚至只用Oct4 一個(gè)基因，即可將神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成iPS細(xì)胞，這主要由于這些細(xì)胞本身高表達(dá)Sox2、c-Myc 和Klf4，而當(dāng)在培養(yǎng)液中加入小分子化合物BIX 或PD0325901 與CHIR99021，則可顯著提高重編程效率Oct4和Klf4 2 種因子與小分子化合物BIX 和Bay組合聯(lián)用時(shí)，可高效率將小鼠

9、成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，這時(shí)BIX 和Bay 可以彌補(bǔ)外源Sox2 的缺失，這是由于小鼠成纖維細(xì)胞重編程為iPS 細(xì)胞至少需要Oct4、Sox2 和Klf4 3 種因子小鼠成熟B 細(xì)胞需要導(dǎo)入Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 和C/EBP5 種基因才能轉(zhuǎn)化成iPS 細(xì)胞，而當(dāng)在培養(yǎng)液中加入5-AZA，Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4 種因子亦可將成熟B細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞4。目前，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的方式均可將轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的基因?qū)塍w細(xì)胞，進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞。將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞只需轉(zhuǎn)錄因子基因在體細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)即可達(dá)到目的，而無(wú)

10、需病毒載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，但是該方法將體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞的效率較逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的低許多。非整合方式實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的理論基礎(chǔ)是：在通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方式將轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)塍w細(xì)胞而獲得的iPS細(xì)胞上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平非常低或外源轉(zhuǎn)基因完全沉默，而內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子基因被激活而維持很高表達(dá)水平，這時(shí)iPS細(xì)胞多潛能性靠?jī)?nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來(lái)維持，至此，外源轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)基因已完成自己的使命而不表達(dá)。誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞研究飛速發(fā)展，雖然現(xiàn)階段誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞還不能完全取代傳統(tǒng)干細(xì)胞研究，技術(shù)也存在一些有待解決的問(wèn)題，但是今后誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的研究會(huì)成為生命科學(xué)領(lǐng)

11、域的一個(gè)重要方向，隨著研究的不斷深入，在提高轉(zhuǎn)化效率和安全性后，誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞將有望應(yīng)用于臨床治療。3.4臍血干細(xì)胞 1974年 Kandlzon 等首先發(fā)現(xiàn)臍血中含有造血祖細(xì)胞。隨后1982年 Nakahata等發(fā)現(xiàn)臍血中的造血祖細(xì)胞的產(chǎn)率高于骨髓。Cardoso等比較了骨髓和臍血CD34+、CD38-細(xì)胞群的分化增殖能力和在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)中產(chǎn)生早期祖細(xì)胞的能力。在臍血中CD34+、CD38-組分占CD34+群的4%，而在骨髓中只占1%，臍血可能含相對(duì)豐富的干細(xì)胞。2009年羅利民等以新生兒臍血分離出的間質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈輸入60Co射線照射小鼠體內(nèi)，照射后當(dāng)天再次輸注人臍血間質(zhì)干細(xì)胞，證

12、實(shí)臍血間質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注對(duì)輻射造成的脾細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用，可促進(jìn)脾臟細(xì)胞分裂增殖，加速脾臟細(xì)胞修復(fù)5。 3.5脂肪干細(xì)胞2001年發(fā)現(xiàn)脂肪組織中除了含有已經(jīng)定型的前脂肪細(xì)胞外，也包含一種具有多方向分化潛能的細(xì)胞群，其性質(zhì)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，這種細(xì)胞可以分化成多種組織如骨骼、軟骨、脂肪、心肌、神經(jīng)等組織，同時(shí)可以促進(jìn)傷口愈合、損傷組織細(xì)胞再生和減少瘢痕的能力及抗衰老能力6。4. 干細(xì)胞分化的體外誘導(dǎo)4.1堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast gro wth factor,BFGF)是一種含有多個(gè)氨基酸的堿性蛋白質(zhì)，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及神經(jīng)纖維再生

13、，并誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)其具有營(yíng)養(yǎng)作用，單獨(dú)使用BFGF能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，當(dāng)然它也能夠與其它生長(zhǎng)因子協(xié)同作用修復(fù)神經(jīng)損傷。研究表明BFGF與心血管疾病密切相關(guān)，能夠調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞及成熟血細(xì)胞的生長(zhǎng)，參與生理性和病理性造血;它還能促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖及毛細(xì)血管的形成。4.2表皮生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)是一種小分子肽，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和樹(shù)突生成的作用。EGF常用于干細(xì)胞的誘導(dǎo)，維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，并與細(xì)胞有絲分裂以及糖、蛋白質(zhì)、DNA,RNA的合成有

14、關(guān)，所以能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。研究表明EGF能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白NeuN和NF -200。4. 3自體腦脊液腦脊液是一種無(wú)色透明的液體，略帶豁性，由脈絡(luò)叢產(chǎn)生，含有多種生長(zhǎng)因子、電解質(zhì)、蛋白質(zhì)以及糖，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等。使用DNA測(cè)序方法檢測(cè)BM-SC、細(xì)胞膜上，發(fā)現(xiàn)上面存在多種細(xì)胞因子的受體，其中就包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等。4. 4拘祀多糖拘祀多糖是由寧夏拘祀提煉得到的含有多種微量元素和氨基酸的蛋白多糖，臨床上具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、延緩衰老等功

15、效，近年研究表明其具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以清除超氧陰離子和經(jīng)自由基，具備誘導(dǎo)劑的基本條件。4.5紅花黃素紅花黃素是由中藥紅花提取而制成的中藥注射劑。大鼠脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)時(shí)，腹腔注射紅花黃素能減少繼發(fā)性損傷，并能促進(jìn)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷區(qū)域的存活和分化，增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)的分泌，加快SCI大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。4.6與星形膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中一種重要的細(xì)胞，它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時(shí)為神經(jīng)元提供支架，并能合成成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子，在神經(jīng)發(fā)育及損傷

16、再生中具有關(guān)鍵性作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)可以維持其生長(zhǎng)，并在一定程度上誘導(dǎo)其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。4.7與施萬(wàn)細(xì)胞共同培養(yǎng) 施萬(wàn)細(xì)胞(Schwan cell, SCs)是外周神經(jīng)所特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生及發(fā)育中起著重要作用。研究顯示，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SCs共培養(yǎng)，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物。4.8干細(xì)胞的分化機(jī)理體外培養(yǎng)下, 胚胎干細(xì)胞的不分化的多能性目前均是靠加人外源的白血病抑制因子來(lái)維持, 這些細(xì)胞因子通過(guò)信號(hào)受體復(fù)合物gp130激活Janus酪氨酸激酶及Stat(signal trans

17、ducer and activator of transcription)的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)來(lái)作用于胚胎干細(xì)胞內(nèi)的靶基因。缺失功能性gp130, 則Sat活性降低, 進(jìn)而導(dǎo)致白血病抑制因子不能抑制胚胎干細(xì)胞分化胚胎干細(xì)胞當(dāng)用維甲酸誘導(dǎo)或撤除白血病抑制因子而出現(xiàn)分化時(shí),酪氨酸磷酸化的Stat-3含量迅速降低,說(shuō)明其D N A 結(jié)合活性降低與Stat-3 參與誘導(dǎo)體細(xì)胞類(lèi)型的分化作用相反,Stat-3活性水平對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)起決定作用但同時(shí),Stat-3 的活性變化并不影響胚胎干細(xì)胞的增殖多潛能的增殖胚胎干細(xì)胞中無(wú)Stat-5,但在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化早期時(shí)有Stat-5 的轉(zhuǎn)錄, 分化兩天

18、后便可檢測(cè)到Stat-5蛋白,這說(shuō)明Stat-5是胚胎干細(xì)胞分化極早期的一個(gè)新的標(biāo)記分子。體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞, 撤除白血病抑制因子會(huì)出現(xiàn)分化7。5. 干細(xì)胞的應(yīng)用5.1骨髓干細(xì)胞移植治療2型糖尿病糖尿病的治療方法包括多種胰島素、日服藥等，但是這些藥物不能完全根治糖尿病，干細(xì)胞移植的研究為治療糖尿病帶來(lái)了新的希望。干細(xì)胞具有多種分化潛能，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下，可以向各種細(xì)胞分化，在各種組織器官中生長(zhǎng)。骨髓干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，都有增殖分化為胰島素分泌細(xì)胞的潛能。2型糖尿病患者存在胰島細(xì)胞功能下降和胰島素抵抗。通過(guò)動(dòng)員、采集、植入將一定數(shù)量的自體骨髓干細(xì)胞移植到胰腺組織中，可以在胰

19、腺組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下，分化增殖為胰島素分泌細(xì)胞，替代損傷的胰島細(xì)胞分泌胰島素，起到治療2型糖尿病的作用8。2005年在阿根廷首先將骨髓干細(xì)胞治療2型糖尿病應(yīng)用于臨床，其中84%的患者在減少用藥或停用降糖藥和胰島素的情況下，血糖仍然維持正常。骨髓干細(xì)胞有多向分化潛能，而且可以回避胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)爭(zhēng)論。5.2胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用可以通過(guò)胚胎干細(xì)胞建立體外分化模型。并建立各種基因改變的胚胎干細(xì)胞系。以求發(fā)現(xiàn)某些基因或細(xì)胞因子在胚胎發(fā)育早期對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞或組織分化的作用。在組織工程中以胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可以為臨床的細(xì)胞、組織、器官移植提供大量的材料。通過(guò)控制胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境、向胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染某一種系細(xì)胞形成的決定基因等可獲得特定種系的較純化的細(xì)胞并且數(shù)量不受限制。將這些細(xì)胞用于移植治療。將給帕金森氏病、脊髓損傷、糖尿病、心肌損傷、肝硬化、腎衰竭、各種血液疾病等疑難病癥的治療帶來(lái)新的希望。利用基因打靶技術(shù)